CN108853060B

CN108853060B - 一种包含奥利司他的纳米微球及其制备方法和用途

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Publication number: CN108853060B
Application number: CN201811036584.2A
Authority: CN
Inventors: 向飞; 杜志博; 彭韪
Original assignee: Zhongshan Wanhan Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Zhongshan Wanhan Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2018-09-06
Filing date: 2018-09-06
Publication date: 2020-09-18
Anticipated expiration: 2038-09-06
Also published as: CN108853060A

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种包含奥利司他的纳米微球及其制备方法和用途。本发明通过将奥利司他与共聚物混合制成纳米微球，使其可以溶于水溶液中，制备成口服剂或注射剂，并且克服了奥利司他口服生物利用率低的缺陷，提高生物利用度至75％以上，对肝细胞癌BEL‑7402细胞株与胃癌BGC‑823细胞株的抑制率高达20％以上，可广泛应用于肿瘤治疗。

Description

一种包含奥利司他的纳米微球及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种包含奥利司他的纳米微球及其制备方法和用途。

背景技术

脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase，FAS)是脂肪酸合成的关键酶，该酶在正常细胞组织中处于低表达低活性的状态，而在乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、视网膜母细胞瘤等肿瘤组织具有较高的表达水平，因此，当前FAS被广泛认为是一个较理想的抗肿瘤治疗靶点。

奥利司他(Orlistat)是上个世纪九十年代末在欧美上市、本世纪初在中国上市的脂肪酶抑制剂类减肥药，具有脂肪酶抑制剂的活性，因此该药的抗肿瘤作用近年来越来越受到关注。陈少波等人(陈少波,张厚德.奥利司他抗肿瘤的研究进展[J].医学综述,2015,21(15):2735-2737.)通过药理学试验发现，奥利司他可通过以下途径发挥其抗肿瘤作用：①直接作用于FAS；②干扰磷酯生物膜功能和新陈代谢、诱导细胞周期阻滞，抑制肿瘤细胞增殖；③阻断细胞信号传导通路、调控基因与相关蛋白，诱导肿瘤细胞凋亡；④抑制肿瘤血管形成、抑制肿瘤细胞伪足形成、调控黏附分子的表达，抑制肿瘤的侵袭与转移；⑤逆转肿瘤细胞的耐药性等。

但奥利司他作为抗肿瘤药物面临以下两个技术难题：①常规口服制剂中的奥利司他生物利用度极低(<2％)，使其无法通过口服给药用于肿瘤的治疗；②奥利司他在水中的溶解度极低(<0.001g/100ml)，无法制成液体制剂通过注射给药用于肿瘤的治疗。

纳米技术自其兴起以来，被医药科技人员密切关注，并应用于药物载体领域，具有以下特点：①载药微球的粒径在10～1000nm范围内，比表面积显着增大；②增加药物溶解度；③提高口服药物的溶出速率；④增强载药粒子(口服)的胃肠道黏膜黏附性；⑤增强口服药物的胃肠道稳定性；⑥增强载药粒子在起效部位或吸收部位的停留时间及面积；⑦增强药物的跨越黏膜屏障能力；⑧提高药物的口服生物利用度；⑨某些口服纳米给药系统还有缓释、控释、靶向功能等。

中国专利申请CN107412196A公开了一种奥利司他纳米微球及其制备方法和在抗肿瘤药物中的应用，所述纳米微球由奥利司他和载药材料混合组成，所述载药材料为聚乙二醇-聚己内酯(mPEG-PCL)，该微球改变了奥利司他的疏水性质，并提高纳米微球对非小细胞肺癌A549、人乳腺癌细胞MCF7与人神经母瘤细胞SH-SY5Y的抗肿瘤活性。Bhargava-ShahA等人(Orlistat and antisense-miRNA-loaded PLGA-PEG nanoparticles for enhancedtriple negative breast cancer therapy，(Bhargava-Shah A etc，(Nanomedicine(Lond).2016,11(3):235-47))公开了一种以PLGA-PEG为载体的纳米微球，该纳米微球显著提高了奥利司他对三阴性乳腺癌细胞的抗肿瘤活性。但上述两种含有奥利司他的纳米微球的口服生物利用度均无法满足疾病治疗的需求，且对胃癌和肝癌细胞的生长抑制率均较低。

因此，迫切需要一种口服生物利用度高、可显著抑制胃癌和肝癌细胞生长的包含奥利司他的纳米微球。

发明内容

本发明旨在提供一种口服生物利用度高、可显著抑制胃癌和肝癌细胞生长的包含奥利司他的纳米微球及其制备方法和用途。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种包含奥利司他的纳米微球，包括奥利司他和具有式(Ⅰ)结构的共聚物，所述奥利司他与共聚物的质量比为1:(1～10)；

其中，所述式(Ⅰ)结构中，x为10或12，m:n为(50～76):(24～50)。

进一步地，所述式(Ⅰ)结构中，x为10，m:n为(53～76):(24～47)，重均分子量为39900～61700。

更进一步地，所述式(Ⅰ)结构中，x为10，m:n为76:24，重均分子量为61700。

进一步地，所述式(Ⅰ)结构中，x为12，m:n为(50～76):(24～50)，重均分子量为18500～30900。

更进一步地，所述式(Ⅰ)结构中，x为12，m:n比是76:24，重均分子量为25200。

进一步地，所述纳米微球的平均粒径为10～100nm。

另外的，本发明还提供了所述纳米微球的制备方法，包括以下步骤：

S1、取共聚物溶于分散相中，配制成共聚物浓度为50～200mg/ml的油相基质溶液，再加入相应量的奥利司他，在100～800rpm的转速下搅拌10～30min，使其混合均匀，得溶液A；

S2、取表面活性剂溶于水中，配制成表面活性剂的质量浓度为0.5～5％的水相溶液，得溶液B；

S3、将步骤S1所得溶液A滴加到步骤S2所得溶液B中，使溶液B的体积为溶液A的4～20倍，500～2000rpm转速下搅拌10～14h，再于5000～15000rpm离心10～20min，沉淀用蒸馏水分散离心3～5次洗净表面活性剂，最后将沉淀冷冻干燥，即得；

其中，所述步骤S1中的分散相选自乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮中的一种；所述步骤S2中的表面活性剂选自聚乙烯、明胶、羟丙甲基纤维素、吐温80中的一种。

另外的，本发明还提供了所述纳米微球或所述制备方法在制备抗肿瘤药物中的用途。

进一步地，所述肿瘤包括肝癌与胃癌。

另外的，本发明还提供了一种抗肿瘤药，所述抗肿瘤药含有有效量的所述纳米微球或所述制备方法制备的纳米微球；所述抗肿瘤药可制成口服剂或注射剂。

进一步地，所述口服剂还包含至少一种药学上可接受的赋形剂。

更进一步地，所述赋形剂包括柠檬酸和磷酸二钙。

进一步地，所述口服剂还包含药学上可接受的填充剂。

更进一步地，所述填充剂包括淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、预胶化淀粉、微晶纤维素、山梨醇和硅酸。

进一步地，所述口服剂还包含药学上可接受的粘合剂。

更进一步地，所述粘合剂包括纤维素衍生物、淀粉、海藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和金合欢树胶。

进一步地，所述口服剂还包含药学上可接受的崩解剂。

更进一步地，所述崩解剂包括琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉、木薯淀粉、海藻酸、交联羧甲纤维素钠、复合硅酸盐和碳酸钠。

进一步地，所述口服剂还包含药学上可接受的溶液缓凝剂。

更进一步地，所述溶液缓凝剂为石蜡。

进一步地，所述口服剂还包含药学上可接受的吸收促进剂。

更进一步地，所述吸收促进剂为季铵化合物。

进一步地，所述口服剂还包含药学上可接受的润湿剂。

更进一步地，所述润湿剂包括鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯和硬脂酸镁。

进一步地，所述口服剂还包含药学上可接受的吸附剂。

更进一步地，所述吸附剂包括高岭土和皂粘土。

进一步地，所述口服剂还包含药学上可接受的润滑剂。

更进一步地，所述润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚二醇、月桂基硫酸钠、硬脂富马酸钠中的一种或多种。

本发明中，通过一系列的酰化、聚合反应，制备得到了具有式(Ⅰ)结构的共聚物，将该聚合物与奥利司他按照一定的配比制备成的纳米微球，可溶于水溶液中，制成口服剂的生物利用度显著提高，由试验例1可见，本发明试验例1～2制备的含有奥利司他的纳米微球口服生物利用率高达75％以上，显著提高了单独口服奥利司他的生物利用度，并且略高于对比例1～2制备的纳米微球。

同时，本发明制备的奥利司他纳米微球还可显著抑制胃癌和肝癌细胞生长，由试验例2可以看出，本发明实施例1～2制备的纳米微球对胃癌BGC-823和肝癌BEL-7402细胞的抑制率高达30％以上，而单独使用奥利司他对肿瘤的抑制率仅在2％以下，对比例1～2制备的纳米微球对肿瘤细胞的抑制率也显著降低30～40％。

本发明具有以下优点：

(1)本发明制备的包含奥利司他的纳米微球可抑制癌细胞生长，显著提高了奥利司他对胃癌BGC-823细胞和肝癌BEL-7402细胞的生长抑制率，对肿瘤的治疗具有重要的意义。

(2)本发明通过将奥利司他与共聚物混合制成纳米微球，使其可以溶于水溶液中，显著提高了奥利司他的口服生物利用率，在机体内可显著抑制肿瘤细胞生长，即可口服也可注射，可广泛应用于肿瘤治疗。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。

其中所用试剂均为常用试剂，均可购于普通试剂生产销售厂家。

共聚物的制备与结构确证

1.共聚物1a的制备

(1)反应路径：

当x＝10时，本发明通过如下所示的反应路径，制备得到了共聚物1a。

(2)制备步骤：

步骤①：取0.252g化合物2a(1mmol)，溶于5ml二氯甲烷中，在-10℃的条件下搅拌5min，缓缓滴加含有0.087ml草酰氯(1mmol)的二氯甲烷溶液5ml，20min内滴完，再滴一滴N,N-二甲基甲酰胺，在-10℃的条件下继续搅拌2h，得溶液A；另取0.063ml氨基乙醇(1.05mmol)，溶于5ml二氯甲烷中，再向其中滴加0.276ml三乙胺(2mmol)，在-10℃的条件下搅拌均匀，得溶液B，将溶液A缓缓滴加入溶液B中，在-10℃的条件下继续搅拌2h，反应液用10ml的10％碳酸钠溶液洗涤，水层用二氯甲烷萃取3次，每次5ml，有机层用10ml饱和食盐水洗涤，合并前述所有的有机相后用无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，粗产品用快速硅胶柱层析(乙酸乙酯：石油醚＝1:1，V/V)纯化，得0.251g白色固体，为化合物4a，产率为85.1％。

结构确证：

化合物2a的¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：6.068(1H，dd)，5.600(1H，m)，2.844(1H，m)，2.309～2.245(2H，m)，2.188(2H，t)，1.964(1H，m)，1.741(1H，m)，1.569(2H，m)，1.341～1.234(16H，m)。

化合物4a的¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：6.062(1H，dd)，5.616(1H，m)，3.477(2H，t)，3.227(2H，t)，2.831(1H，m)，2.342～2.246(2H，m)，2.107～1.943(3H，m)，1.748(1H，m)，1.530(2H，m)，1.298～1.244(16H，m)。

步骤②：取0.296g化合物4a(1mmol)、10ml甲苯、0.125g对甲苯磺酸和0.038g对苯二酚，混合后置于配备有分水器的三颈烧瓶中，加热搅拌至固体全部溶解，再向所得的混合体系中加入0.130g甲基丙烯酸(1.5mmol)，继续加热升温至水与甲苯共沸，同时被蒸出，待分水器中的水量约为0.018g时，减压蒸馏除去未反应的甲基丙烯酸与甲苯，将烧瓶中的粗酯冷却至室温，加入适量石油醚完全溶解，用包含5％碳酸钠与1％氢氧化钠的碱液中和洗涤至微碱性，除去少量的甲苯和甲基丙烯酸、对甲苯磺酸与对苯二酚，再用蒸馏水洗至中性后，用无水氯化钙干燥，过滤后蒸出石油醚，得0.318g灰白色固体，为化合物6a，产率为87.5％。

结构确证：

化合物6a的¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：6.503(1H，s)，6.429(1H，s)，6.221(1H，dd)，5.601(1H，m)，4.560(2H，t)，3.306(2H，t)，2.820(1H，m)，2.35(1H，m)，2.216(1H，m)，2.117(2H，t)，1.986～1.980(4H，m，1.985处有呈强吸收的单峰)，1.733(1H，m)，1.506(2H，m)，1.319～1.312(4H，m)，1.289～1.245(12H，m)。

步骤③：取3.61g化合物6k(0.01mol)、0.99g 2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(化合物7，MPC，3.33mmol)与0.046gAIBN(偶氮二异丁腈)，加定量甲醇/四氢呋喃(1/4，v/v)的混合溶剂，配制成化合物6b的质量浓度(wt％)为20％的溶液。将所得溶液移至聚合反应管中后，向溶液中通入氩气以除去溶液中的氧气。密封反应管，并在60℃下震荡16h后冷却，以中止聚合反应。将反应液倾倒至正庚烷中，过滤收集析出的固体，真空下干燥，得固体4.08g。

结构确证：

化合物7的¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：6.102(1H，s)，5.608(1H，s)，4.263(4H，m)，4.051(2H，t，J＝6.1)，3.757(2H，t，J＝6.1)，3.322(9H，s)，1.902(3H，s)。

共聚物1a的¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：6.009(dd)，5.625(m)，4.516(t)，4.412(t)，4.292～4.276(m)，3.604(t)，3.259(s)，3.247(t)，2.835(m)，2.359(m)，2.211(m)，2.042(t)，1.945(m)，1.881(s)，1.656(m)，1.654(s)，1.584(m)，1.325(s)，1.208(m)，1.195(s)。

2.共聚物1b的制备

(1)反应路径：

当x＝12时，本发明通过如下所示的反应路径，制备得到了共聚物1b。

(1)制备步骤：

步骤①：取0.280g化合物2b(1mmol)，参考共聚物1a的制备的步骤①进行制备，得0.255g白色固体，为化合物4b，产率78.9％。

结构确证：

化合物2b的¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：6.251(1H，dd)，5.582(1H，m)，2.839(1H,m),2.332(1H,m)，2.234～2.218(3H，m)，1.969(1H，m)，1.705(1H，m)，1.518(2H，m)，1.331～1.248(20H，m)。

化合物4b的¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：6.247(1H，dd)，5.571(1H，m)，3.493(2H，t)，3.205(2H，t)，2.827(1H，m)，2.309～2.236(2H，m)，2.135(2H，t)，1.958(1H，m)，1.709(1H，m)，1.553(2H，t)，1.288～1.267(20H，m)。

步骤②：取1mmol化合物4b(约0.324g)，参考共聚物1a的制备的步骤②进行制备，得0.371g白色固体粉末，为化合物6b，产率93.1％。

结构确证：

化合物6b的¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：6.472(1H，s)，6.418(1H，s)，6.204(1H，dd)，5.601(1H，m)，4.564(2H，t)，3.296(2H，t)，2.825(1H，m)，2.305～2.259(2H，m)，2.150(2H，t)，1.999(3H，s)，1.959(1H，m)，1.700(1H，m)，1.531(2H，m)，1.316～1.227(20H，m)。

步骤③：取3.91g化合物6m(0.01mol)、0.99g 2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(化合物7，MPC，3.33mmol)与0.049gAIBN(偶氮二异丁腈)，加定量甲醇/四氢呋喃(1：4，v/v)的混合溶剂，配制成化合物6m的质量浓度(wt％)为20％的溶液。将所得溶液移至聚合反应管中后，向溶液中通入氩气以除去溶液中的氧气。密封反应管，并在60℃下震荡16h后冷却，以中止聚合反应。将反应液倾倒至乙醚中，过滤收集析出的固体，真空下干燥，得固体4.25g。

结构确证：

共聚物1b的¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：5.971(dd)，5.653(m)，4.497～4.464(m)，4.340～4.243(m)，3.585(t)，3.247(s)，3.220(t)，2.915(m)，2.344(m)，2.211(m)，2.005～1.945(m)，1.905(s)，1.706(m)，1.672(s)，1.624(m)，1.351(s)，1.211(s)，1.172(m)。

3.具有式(Ⅰ)结构的共聚物中m:n及分子量的测定

(1)m:n的计算

采用¹H-NMR(400Hz，CDCl₃)，对式(Ⅰ)共聚物进行结构确证，通过计算¹H-NMR图谱中-N⁺(CH₃)₃氢的特征峰的峰面积占总氢峰面积的比例，可得式(Ⅰ)共聚物中的m:n值。其中，式(Ⅰ)共聚物中的m:n值随着化合物6与化合物7的摩尔投料比的增加而增加，因此，本发明只计算了化合物6与化合物7以最小与最大摩尔投料比进行反应时所得共聚物1结构中的m:n比，结果如表1所示。

(2)分子量测定

采用GPC/ALC 150C型凝胶色谱仪，在25℃下，以四氢呋喃为溶剂，以聚苯乙烯作为对照，测定化合物6a或6b与化合物7以不同投料摩尔比反应所得共聚物1a或1b的重均分子量(M_w)与数均分子量(M_n)，得分子量分布D＝M_w/M_n，结果如表1所示。

表1式(Ⅰ)结构的共聚物的m:n值与分子量

由表1可见，共聚物1a结构中，x为10，m:n为(53～76):(24～47)，重均分子量为39900～61700；共聚物1b结构中，x为12，m:n为(50～76):(24～50)，重均分子量为18500～30900。

包含奥利司他的纳米微球的制备条件影响

1.制备方法与影响因素

包含奥利司他的纳米微球的制备方法包括以下步骤：

S1、取共聚物1a(共聚物结构中m:n的值设为影响因素Ⅰ)溶于三氯甲烷中，配制成共聚物浓度为50～200mg/ml(设为影响因素Ⅱ)的油相基质溶液，再加入与共聚物的质量比为1:(1～10)(设为影响因素Ⅲ)的奥利司他，在100～800rpm(设为影响因素Ⅳ)的转速下搅拌10～30min(设为影响因素Ⅴ)，使其混合均匀，得溶液A；

S2、取吐温80溶于水中，配制成表面活性剂的质量浓度为0.5～5％(设为影响因素Ⅵ)的水相溶液，得溶液B；

S3、将步骤S1所得溶液A滴加到步骤S2所得溶液B中，使溶液B的体积为溶液A的4～20倍(设为影响因素Ⅶ)，500～2000rpm(设为影响因素Ⅷ)转速下搅拌10～14h(设为影响因素Ⅸ)，再于5000～15000rpm(设为影响因素Ⅹ)离心10～20min，沉淀用蒸馏水分散离心3～5次洗净吐温80，最后将沉淀冷冻干燥，即得。

2.影响因素考察

采用正交因素试验依次考察制备方法中各可变的参数(影响因素Ⅰ～Ⅹ)对制备而成的纳米微球针对胃癌BGC-823细胞株抑制率的影响。

(1)测定方法

①样品溶液的制备

根据表2影响因素的取值及上述第1部分包含奥利司他的纳米微球的制备方法制备纳米微球；

表2影响因素取值

取定量纳米微球，用100％DMSO溶解，用RPMI 1640培养基稀释成含有5％DMSO的溶液，其中，奥利司他的含量为20mg/L，用0.22μm过滤器除菌过滤后备用。

另取定量奥利司他，用100％DMSO溶解，用RPMI 1640培养基稀释成含有5％DMSO的溶液，其中，奥利司他的含量为20mg/L，经0.22μm过滤器除菌过滤后备用。

②MTT法测定纳米微球对胃癌BGC-823细胞增殖的抑制率

配制含10％胎牛血清、1×10⁵U/L青霉素、100mg/L链霉素的RPMI 1640全培养基，在5％CO₂和37℃的条件下培养人胃癌BGC-823细胞，每隔24～48h更换一次培养基，常规消化传代，取对数生长期细胞进行实验。

取对数生长期的胃癌BGC-823细胞，接种于96孔板中，使细胞密度为2×10⁶/L，每孔添加200μl受试物干预24h后，每孔加入10μl的MTT(5g/L)，在37℃，5％CO₂细胞孵育箱培养4h后，弃去培养液，用150μl的DMSO溶解细胞，振摇15min，待细胞内紫色结晶溶解后，利用酶标仪测定其570nm波长处的吸光度OD_x，并根据如下公式计算细胞生长抑制率：

细胞生长抑制率(IR)(％)＝[(OD₀-OD_x)/OD₀]×100％

其中，OD₀为空白对照组的吸光度值；OD_x为受试物的吸光度值。

(2)试验结果

表3影响因素Ⅰ～Ⅹ对纳米微球胃癌BGC-823细胞抑制率的影响

由表3可见，本发明纳米微球的最佳的制备方法为：

S1、取m:n值为76:24的共聚物1a溶于三氯甲烷中，配制成共聚物浓度为125mg/ml的油相基质溶液，再加入与共聚物的质量比为1:5.5的奥利司他，在450rpm的转速下搅拌20min，使其混合均匀，得溶液A；

S2、取吐温80溶于水中，配制成表面活性剂的质量浓度为2.75％的水相溶液，得溶液B；

S3、将步骤S1所得溶液A滴加到步骤S2所得溶液B中，使溶液B的体积为溶液A的12倍，1250rpm转速下搅拌12h，再于10000rpm离心15min，沉淀用蒸馏水分散离心5次洗净吐温80，最后将沉淀冷冻干燥，即得。

实施例1包含奥利司他和共聚物1a(m:n＝76:24)的纳米微球

实施例2包含奥利司他和共聚物1b(m:n＝76:24)的纳米微球

与实施例1的区别在于，实施例2的共聚物替换为共聚物1b(m:n＝76:24)，其余参数及操作参考实施例1。

实施例3包含纳米微球的颗粒剂

表4包含纳米微球的颗粒剂处方(按1000袋计)

原料	重量(g)
		实施例1制备的纳米微球	60(依奥利司他计)
预胶化淀粉	130
		硬脂富马酸钠	3

制备步骤：

分别将实施例1制备的纳米微球、预胶化淀粉和硬脂富马酸钠过80目筛，取处方量的纳米微球、预胶化淀粉和硬脂富马酸钠混合制粒，分装，即得。

实施例4包含纳米微球的胶囊剂

表5包含纳米微球的胶囊剂处方(按1000袋计)

原料	重量(g)
		实施例2制备的纳米微球	60(依奥利司他计)
微晶纤维素	135
		单硬脂酸甘油酯	4

制备步骤：

分别将实施例2制备的纳米微球、微晶纤维素和单硬脂酸甘油酯过80目筛，取处方量的纳米微球、微晶纤维素和单硬脂酸甘油酯混合，灌装胶囊，即得。

实施例5包含纳米微球的片剂

表6包含纳米微球的胶囊剂处方(按1000袋计)

原料	重量(g)
		实施例1制备的纳米微球	60(依奥利司他计)
山梨醇	135
		单棕榈酸甘油酯	4

制备步骤：

分别将实施例1制备的纳米微球、山梨醇和单棕榈酸甘油酯过80目筛，取处方量的纳米微球、山梨醇和单棕榈酸甘油酯混合，压片，即得。

实施例6包含纳米微球的注射剂

表7包含纳米微球的胶囊剂处方(按1000袋计)

原料	用量
		实施例2制备的纳米微球	60g
注射用水	1000ml

制备步骤：

取处方量的纳米微球，用处方量注射用水溶解，除菌过滤，分装，即得。

对比例1包含奥利司他的纳米微球

与实施例1的区别在于，对比例1的共聚物替换为中国专利申请CN107412196A中所公开的聚乙二醇-聚己内酯(mPEG-PCL)，其余参数及操作参考实施例1。

对比例2包含奥利司他的纳米微球

与实施例1的区别在于，对比例1的共聚物替换为文献《Orlistat and antisense-miRNA-loaded PLGA-PEG nanoparticles for enhanced triple negative breastcancer therapy》(Bhargava-Shah A etc，(Nanomedicine(Lond).2016,11(3):235-47)中所公开的PLGA-PEG，其余参数及操作参考实施例1。

试验例1纳米微球的口服生物利用度

1.试验材料：实施例1～2和对比例1～2制备的纳米微球还有奥利司他。

2.试验对象：雄性清洁级SD大鼠，体重200～220g，由中山大学实验动物中心提供。

3.试验方法：取实施例1～2和对比例1～2制备的纳米微球还有奥利司他各2份，其中1份用0.5％CMC-Na溶液配制成含奥利司他3g/L的灌胃液，按60mg/kg的剂量(依奥利司他计)灌胃给药一次；另1份用注射用水配制成含奥利司他15g/L的注射液，按6mg/kg的剂量(依奥利司他计)皮下注射给药1次；

各组大鼠分别于给药后0，5，15，30，60，120，240，360，480，720，1440min眼眶静脉丛采血0.4ml，用肝素抗凝，于5000r/min离心5min，收集血浆，-70℃冰冻保存；

分别取各组大鼠血浆100μl，加入300μl乙酸乙酯溶液，涡旋混匀后12000r/min离心5min，下层再以300μl乙酸乙酯同法萃取，合并2次上清液，于40℃下氮气吹干，用100μL甲醇复溶，离心，取上清液进样；

色谱条件为：以乙腈：磷酸：水＝860:0.05:140的溶液作为流动相，以USP奥利司他RS溶于流动相制成0.5mg/ml的标准溶液，以UV 195作为检测器，色谱柱规格为3.9mm×15cm，粒径4μm，填料为LI，设置流速为1.0ml/min，进样量为20μl，进样检测。

相对口服生物利用度的计算：

4.试验结果：

表8纳米微球和奥利司他的生物利用度

组别	生物利用度(％)
		奥利司他	1.6
实施例1	79.3
		实施例2	75.8
对比例1	68.5
		对比例2	70.2

由表8可见，本发明试验例1～2制备的含有奥利司他的纳米微球口服生物利用率高达75％以上，显著提高了单独口服奥利司他的生物利用度，并且略高于对比例1～2制备的纳米微球。

试验例2纳米微球的肿瘤抑制率

2.试验对象：胃癌BGC-823细胞和肝癌BEL-7402细胞。

3.试验方法：

(1)纳米微球对胃癌BGC-823细胞的生长抑制率

取定量纳米微球，用100％DMSO溶解，用RPMI 1640培养基稀释成含有5％DMSO的溶液，其中，奥利司他的含量为20mg/L，用0.22μm过滤器除菌过滤后备用；另取定量奥利司他，用100％DMSO溶解，用RPMI 1640培养基稀释成含有5％DMSO的溶液，其中，奥利司他的含量为20mg/L，经0.22μm过滤器除菌过滤后备用；

配制含10％胎牛血清、1×105U/L青霉素、100mg/L链霉素的RPMI 1640全培养基，在5％CO2和37℃的条件下培养人胃癌BGC-823细胞，每隔24～48h更换一次培养基，常规消化传代，取对数生长期细胞进行实验；

取对数生长期的胃癌BGC-823细胞，接种于96孔板中，使细胞密度为2×106/L，每孔添加200μl受试物干预24h后，每孔加入10μl的MTT(5g/L)，在37℃，5％CO2细胞孵育箱培养4h后，弃去培养液，用150μl的DMSO溶解细胞，振摇15min，待细胞内紫色结晶溶解后，利用酶标仪测定其570nm波长处的吸光度OD_x，并根据如下公式计算细胞生长抑制率：

细胞生长抑制率(IR)(％)＝[(OD₀-OD_x)/OD₀]×100％

(2)纳米微球对肝癌BEL-7402细胞的生长抑制率

参考上述纳米微球对胃癌BGC-823细胞的生长抑制率的测定方法测定计算纳米微球对肝癌BEL-7402细胞的生长抑制率。

4.试验结果：

表9纳米微球对肿瘤细胞的生长抑制率

由表9可见，本发明实施例1～2制备的纳米微球对胃癌BGC-823和肝癌BEL-7402细胞的抑制率高达30％以上，而单独使用奥利司他对肿瘤的抑制率仅在2％以下，对比例1～2制备的纳米微球对肿瘤细胞的抑制率也显著降低15～25％。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims

1.一种包含奥利司他的纳米微球，其特征在于，包括奥利司他和具有式(Ⅰ)结构的共聚物，所述奥利司他与共聚物的质量比为1:(1～10)；

其中，所述式(Ⅰ)结构中，x为10或12，m:n为(50～76):(24～50)。

2.根据权利要求1所述纳米微球，其特征在于，所述式(Ⅰ)结构中，x为10，m:n为(53～76):(24～47)，重均分子量为39900～61700。

3.根据权利要求2所述纳米微球，其特征在于，所述式(Ⅰ)结构中，x为10，m:n为76:24，重均分子量为61700。

4.根据权利要求1所述纳米微球，其特征在于，所述式(Ⅰ)结构中，x为12，m:n为(50～76):(24～50)，重均分子量为18500～30900。

5.根据权利要求4所述纳米微球，其特征在于，所述式(Ⅰ)结构中，x为12，m:n比是76:24，重均分子量为25200。

6.根据权利要求1所述纳米微球，其特征在于，所述纳米微球的平均粒径为10～100nm。

7.根据权利要求1～6任一所述纳米微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据权利要求1～6任一所述纳米微球或权利要求7所述制备方法制备得到的纳米微球在制备抗肿瘤药物中的用途。

9.根据权利要求8所述用途，其特征在于，所述肿瘤包括肝癌与胃癌。

10.一种抗肿瘤药，其特征在于，所述抗肿瘤药含有有效量的权利要求1～6任一所述纳米微球或权利要求7所述制备方法制备得到的纳米微球；所述抗肿瘤药可制成口服剂或注射剂。