CN108844922A - 一种毛发中毒品的快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种毛发中毒品的快速检测方法，包括如下步骤：1）毛发毒品的收集：2）毛发毒品酶解提取法：3）毛发样本的胶体金法检测：4）毛发样本的SPR检测：本发明的有益效果是，1分钟内即可完成毛发样本毒品分子的快速提取，1分钟内手持式胶体金光学模组智能化识别和自动检测仪即可完成毛发样本消解液低浓度毒品分子的检测，2分钟内便携式等离子共振（SPR）仪即可完成毛发样本消解液痕量浓度毒品分子的检测，该方法操作简单、检测时间短、成本低，适于基层推广应用。

Description

一种毛发中毒品的快速检测方法

技术领域

本发明涉及生物及刑事鉴定技术领域。具体涉及一种毛发中毒品的快速检测方法。

背景技术

毒品滥用是严重危害社会安全和人类生命健康的重大问题，吸毒人群呈数量不断上升和年轻化的趋势，且甲卡西酮等第三代新型毒品种类不断增多。目前国内外主要应用免疫胶体金技术、气质联用色谱和高效液相色谱-质谱联用分析对吸毒人员的尿液和唾液进行检测和认定。但通常吸毒24～48小时后，尿液和唾液毒品基本代谢排出，导致检测阴性而无法提供无价值的信息。因此，现阶段急需建立一种快速、结果稳定、检测时限长、能反映较长时间毒品使用情况的检测方法，进而应用于娱乐场所、重大活动场所筛查等快速现场检测以及社区吸毒人员管控等。

毛发生物检材具有样本易获取、易保存、结果稳定、检测时限长、能反映较长时间（几个月甚至几年）的药物使用情况等独特优势。血液中的毒品、药物分子进入头发、腿毛、阴毛、腋毛等毛发毛囊周围密集的毛细血管，在毛囊中毒品分子被毛发中的角蛋白固定，大约3-5天内含有毒品分子的毛发将长出头皮表面。由于毛发生长速度相对较慢，毒品分子可在毛发中长期稳定存在。吸毒人员的毛发检测既可以为是否滥用毒品提供证据，也可以认证毒品的摄取类型和时间。因此，毛发毒品和药物分析在毒品检测、法医毒物学、临床毒物学以及兴奋剂检测领域具有非常广泛的应用前景。

甲基苯丙胺、氯胺酮等毒品分子在吸毒人员毛发中含量稳定，主要以其原型分子形式长期稳定存在。海洛因进入体内能快速代谢为6-单乙酰吗啡，由于海洛因和6-单乙酰吗啡均含有酯结构，在尿液和血液中很容易水解为吗啡，因此尿液、唾液和血液中海洛因和6-单乙酰吗啡的含量很低，且随着吸食时间的延长，尿液、唾液和血液中海洛因和6-单乙酰吗啡浓度越来越低，最后只能检测到最终代谢物吗啡。由于吗啡也可通过止咳药水主要成分可待因代谢或由镇痛药物吗啡产生，吗啡检出并不能证明滥用了海洛因，容易产生误判的可能。而6-单乙酰吗啡仅来源于海洛因的代谢，是海洛因特征性的中间代谢产物，体内单乙酰吗啡的检出是确认滥用海洛因的证据。为了提高海洛因滥用的检测率和证据力，6-单乙酰吗啡的检出非常重要。海洛因吸食者毛发海洛因特征性代谢物6-单乙酰吗啡含量较高，且在吸毒后很长时间内可检出，因此毛发是海洛因吸毒认定的最佳生物检材。

与尿液或血液毒品分子含量通常为µg/ml级相比，毛发中毒品及其代谢物的含量很低，仅为ng/mg级，且角蛋白等生物杂质含量非常高。由于毛发中的毒品包埋在角蛋白中，首先需应用酸解、碱解和甲醇等有机溶剂超声法对毛发进行消解，使得毒品分子释放并呈游离状态进人溶液。通常情况下，酸水解毛发产物本底较低，但待测物毒品分子释放效率低于碱水解法；碱水解可完全溶解毛发，使待测毒品分子完全释放，但其提取液中蛋白杂质含量较高而影响检测。另外更为重要的是，酸、碱水解处理过程中容易导致海洛因特征代谢产物6-单乙酰吗啡酯结构水解产生吗啡，因此酸、碱水解法不适于海洛因吸食人员的认定。甲醇、乙腈等有机溶剂超声水解可最大程度地降低海洛因特征代谢产物6-单乙酰吗啡等在毛发毒品释放过程中的水解，适于海洛因吸食人员毛发生物检材的检测和认定，但有机溶剂超声水解存在环境污染、操作复杂、基层不易推广等问题。

毛发生物检材经消解后，其消解液经过涡旋液相微萃取、固相萃取、液相萃取、超临界流体萃取、柱萃取等萃取技术对消解液进行待测物的提取，用氮气将待测物萃取液吹干后进行衍生化处理；最后采用气质联用色谱（GC/MS）和高效液相色谱-质谱联用（HPLC/MS）和高效毛细管电泳检测手段进行检测。虽然上述色谱方法具有很好的灵敏度和特异性，但操作繁琐、耗时长，需要昂贵的仪器设备和专业操作人员。近年酶联免疫法（ELISA）也被应用于毛发消解液毒品的检测，但同样也存在操作繁琐、耗时长、成本高等问题。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了高效准确的一种毛发中毒品的快速检测方法。

本发明的技术方案如下：

一种毛发中毒品的快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）毛发样本的收集：收集吸毒人员及未吸毒人员的毛发样本，并分别分装到两个毛发样本专用取样袋中，一袋作为检测样品，另一袋留样备用，分别用记号笔记录相关检测信息；

2）毛发样本酶解提取法：分别取出取样袋中的检测样品，用医用剪刀剪碎后加入毛发快速消解液，并手工快速震荡，静置后得到相应的毛发消解提取液；所述毛发快速消解液包括角蛋白酶5000～20000IU/L、Na2HPO4 35.5g/L、NaCl 8.775g/L、Casein 1～2g/L、PVP-101～2g和NaN3 0.05～0.2g/L；角蛋白酶用于降解毛发的主要成分角蛋白，释放出小分子毒品；Na₂HPO₄提供合适的酶反应PH环境，中和酶反应产生的产物；NaCl提供合适的离子强度；Casein在长期保存中稳定酶的活性；PVP-10增加角蛋白酶在水中的溶解度；NaN₃作为毛发快速消解液的防腐剂；

3）毛发样本的胶体金法检测：将步骤2）中得到的毛发消解提取液通过胶体金法检测装置进行检测，将液体移行至胶体金法检测装置加样区开始至液体达到反应区末端时停止，初步观察胶体金法检测装置的质控线与检测线；在利用胶体金光学模组智能化识别和自动检测检测仪，对胶体金法检测装置质控线及检测线进行判读，若检测仪判读为阴性，则毛发样本需进行SPR检测；

4）毛发样本的SPR检测：首先制备SPR传感器生物芯片，并在SPR传感器生物芯片的表面标记BSA偶联毒品完全抗原；用胶体金标记毒品抗体并用PBS缓冲液稀释；将毛发样本消解液经SPR检测仪进样装置过滤处理后与PBS缓冲液稀释胶体金标记的毒品混合后进样；最后将混合后的进样与SPR传感器生物芯片表面标记的BSA偶联毒品完全抗原作用，记录SPR响应值的动态变化，SPR反应2 min后结束检测，若SPR响应值出现明显衰弱，则为阳性。

所述的一种毛发中毒品的快速检测方法，其特征在于，所述毛发样本采用吸毒人员头发、腿毛、阴毛或腋毛。

所述的一种毛发中毒品的快速检测方法，适用于对甲基苯丙胺、吗啡、氯胺酮、MDMA、可卡因、甲卡西酮或四氢大麻酚毒品的检测。

所述的一种毛发中毒品的快速检测方法，其特征在于，所述毛发快速消解液包括角蛋白酶10000IU/L、Na2HPO4 35.5g/L、NaCl 8.775g/L、Casein 2g/L、PVP-10 2g和NaN30.2g/L。

所述的一种毛发中毒品的快速检测方法，其特征在于，所述步骤4）中SPR传感器生物芯片采用羧甲基葡聚糖生物芯片，

所述羧甲基葡聚糖生物芯片制备如下：

步骤1）滴加2ml 80%乙醇溶液配制的5mM 11-巯基十一烷酸溶液于玻璃金膜表面，在40℃ 孵育30min；使巯基烷醇连接于金膜表面以便进一步修饰，同时可对金膜进行封闭而降低了生物分子的非特异性吸附；取出后用80%乙醇溶液洗5次，再用去离子水洗净，氮气吹干；

步骤2）采用体积比为1:1的0.4M NaOH和二甘醇二甲醚溶液配制环氧氯丙烷溶液，滴加2ml在玻璃金膜上，室温下孵育4h，使表面生成环氧基以用于葡聚糖的共价修饰；取出后用流水缓慢冲洗，80%乙醇溶液洗5次，再用去离子水洗净，氮气吹干；

步骤3）采用0.1M NaOH溶液配制0.3g/ml葡聚糖溶液，滴加2ml在玻璃金膜上，室温下振荡孵育20h，取出后用流水缓慢冲洗，再用50℃去离子水洗净，氮气吹干；

步骤4）2M NaOH溶液配制3ml的1M 溴乙酸溶液，滴加2ml在玻璃金膜上，室温下振荡孵育16h，使葡聚糖羧基化，取出后用去离子水洗净，氮气吹干，即得到羧甲基葡聚糖芯片。

所述的一种毛发中毒品的快速检测方法，其特征在于，所述羧甲基葡聚糖生物芯片标记BSA偶联毒品完全抗原的方法如下：

步骤1）注射含0.4M EDC和0.1M NHS的氨基偶联试剂200μl，活化生物芯片上的羧基，将BSA偶联毒品完全抗原分别用pH 7.4的PBS缓冲液稀释至5mg/ml，注射该溶液200μl，由于BSA上的氨基与SPR传感生物芯片上活化的酯基发生氨基偶联反应而使毒品被固定在传感片上；

步骤2）注射 200μl的1M乙醇胺溶液，用来封闭金膜上尚未发生偶联反应的酯基，最后注入200μl的PH7.4的PBS缓冲液除去非特异吸附的乙醇胺。

所述的一种毛发中毒品的快速检测方法，其特征在于，所述SPR传感器生物芯片采用聚甲基丙烯酸甲酯制成，并采用四通道微型流通池结构，包括管路及四通道流通池。

本发明的有益效果是：

1）胶体金检测采用胶体金免疫层析技术是一种具有免疫反应和侧向层析功能的免疫诊断技术，与色谱分析和酶联免疫法（ELISA）等比较，胶体金层析技术具有简单快速、易于操作等优点，通过手持式毛发毒品胶体金光学模组智能化识别和自动分析检测仪能实现毛发样本的毒品的现场快速检测，检测时间小于1min；并可实现对毛发样本低浓度毒品检测。

2）SPR检测采用表面等离子共振（SPR）传感技术是一种无需标记、无需分离纯化的新型光电生物检测技术，该技术通过在线实时监测生物分子相互作用来确定反应物种类和浓度定量测量，具有检测灵敏度高、响应速度快、可实现多种成份同时分析等优势。毛发样本成分复杂，在应用SPR传感技术进行毒品检测时必须排除生物芯片蛋白和多肽等非特异性吸附导致的干扰，避免非特异性吸附产生的假阳性和假阴性结果。本发明前处理装置吸附过滤毛发样本消解提取液中的各种蛋白质和多肽杂质，减少上述物质对毒品小分子检测的干扰，提高毛发微量毒品小分子检测的灵敏度和特异度。SPR检测毛发毒品快速检测仪体积小、重量轻，便于执法人员便携现场执法，检测灵敏度高，可实现痕量浓度毒品（10ng/ml）的检测，检测速度快，2分钟内实现毛发样本中常见毒品的快速检测，可应用于快速筛检。

3）本发明提供的一种毛发的快速检测方法，1分钟内即可完成毛发样本毒品分子的快速提取，1分钟内手持式胶体金光学模组智能化识别和自动检测仪即可完成毛发样本消解液低浓度毒品分子的检测，2分钟内便携式等离子共振（SPR）仪即可完成毛发样本消解液痕量浓度毒品分子的检测；因此，本发明提供的毛发快速检测方法操作简单、检测时间短、成本低，适于基层推广应用。

4）本发明提供一种毛发快速消解液，1分钟内完成毛发样本待测毒品分子的高效释放，且其消解提取液大分子蛋白杂质含量低。更为重要的是，本发明提供的毛发样本快速酶解法极大程度的抑制海洛因特征代谢产物6-单乙酰吗啡等在毛发毒品释放过程中的水解反应，因此，本发明提供了一种快速、高效、简便的毛发毒品分子提取方法，不仅准确地反映毛发中的毒品类型和含量，而且适于基层公安的推广使用。

附图说明

图1为正常人毛发样本消解液的SPR检测连续监控曲线图；

图2为海洛因吸食人员毛发样本消解液SPR检测连续监控曲线图；

图3为冰毒吸食人员毛发样本消解液的SPR检测连续监控曲线图；

图4为K粉吸食人员毛发样本消解液的SPR检测连续监控曲线图。

具体实施方式

一种毛发中毒品的快速检测方法：

步骤1：毛发毒品的收集：

收集海洛因、冰毒、K粉吸食人员及未吸毒人员毛发样本各5份，采样人员使用剪刀从受剪人头顶后部采集样品约10mg，5cm长度的头发约10根左右，并分别分装到2个毛发样品专用取样袋中：一袋作为检测样品，另一袋留样备用，分别用记号笔记录相关检测信息。

步骤2：毛发毒品酶解提取：

取出检测样品袋中的毛发样品，用医用剪刀剪碎至3-4mm长度后加入1ml本发明提供的pH 8.0的毛发快速消解液，手工快速震荡3次，静置1min后得到毛发消解提取液。与酸碱裂解法比较，应用本毛发快速消解液裂解的毛发样本裂解较为彻底、外观澄清、样本不粘稠。

本发明提供的毛发快速消解液包括角蛋白酶5000～20000IU/L、Na2HPO4 35.5g/L、NaCl 8.775g/L、Casein 1～2g/L、PVP-10 1～2g和NaN3 0.05～0.2g/L。角蛋白酶用于降解毛发的主要成分角蛋白，释放出小分子毒品；角蛋白酶反应促进剂Na₂HPO₄提供合适的酶反应PH环境，中和酶反应产生的产物；NaCl提供合适的离子强度；角蛋白酶保护剂Casein在长期保存中稳定酶的活性；角蛋白酶促溶剂PVP-10增加角蛋白酶在水中的溶解度；NaN₃作为毛发快速消解液的防腐剂。

步骤3：毛发样本胶体金检测

分别向胶体金法检测装置加样区内加入冰毒、K粉、海洛因吸食人员及未吸毒人员毛发样本消解液各5例，液体移行至加样区开始计时，直至液体达到反应区末端时停止计时，所用的时间记为t（s），观察质控线（C线）与检测线（T线）颜色是否清晰，是否拖尾，进一步应用胶体金光学模组智能化识别和自动检测检测器，对于试纸C线及T线进行判读。

检测结果显示5例海洛因吸食者毛发样本中4例样本检测线（T线）颜色消失，1例样本检测线（T线）清晰存在，上述结果表明5例海洛因吸食者毛发样本的吗啡阳性检测率为80%。5例冰毒吸食者毛发样本中4例样本检测线（T线）颜色消失，1例样本检测线（T线）清晰存在，上述结果表明5例冰毒吸食者毛发样本的甲基苯丙胺阳性检测率为80%。5例K粉吸食者毛发样本中4例样本检测线（T线）颜色消失，1例样本检测线（T线）清晰存在，上述结果表明5例K粉吸食者毛发样本的氯胺酮阳性检测率为80%，所有检测时间小于1min，如表1所示。

表 1 ：吸毒人员和正常人毛发样本胶体金光学模组智能化识别和自动检测检测结果统计表

毛发样本胶体金光学模组智能化识别和自动检测阈值检测

分别精密称量5.00mg（质量以碱计算）吗啡、甲基苯丙胺、氯胺酮标准品于5ml容量瓶中，加入甲醇至刻度线，配制成1mg/ml的标准品储备液；分别取500μl标准品储备液于5ml容量瓶中，加入样本稀释液至刻度线，分别配制成100μg/ml的中间液；分别取100μg/ml标准品中间液，用50ml容量瓶将吗啡（表2）、甲基苯丙胺（表3）、氯胺酮（表4）中间液稀释成以下浓度的待测样品。

分别向胶体金法检测装置加样区内加入表1、表2、表3配置的不同浓度的吗啡、K粉、海洛因吸食人员及未吸毒人员毛发样本消解液各5例，液体移行至加样区开始计时，直至液体达到反应区末端时停止计时，所用的时间记为t（s），观察质控线（C线）与检测线（T线）颜色是否清晰，是否拖尾，进一步应用胶体金光学模组智能化识别和自动检测检测器，对于试纸C线及T线进行判读。如表5所示，毛发样本胶体金光学模组智能化识别和自动检测阈值检测结果分别为吗啡（50ng/ml）、甲基苯丙胺（50ng/ml）、氯胺酮（100ng/ml）。

表 2 吗啡阈值待测样品配制表

表 3 甲基苯丙胺阈值待测样品配制表

表 4 氯胺酮阈值待测样品配制表

表 5 胶体金光学模组智能化识别和自动检测检测阈值统计表

由于手持式胶体金光学模组智能化识别和自动检测仪毛发样本检测阈值分别为吗啡（50ng/ml）、甲基苯丙胺（50ng/ml）、氯胺酮（100ng/ml），1例海洛因、1例冰毒吸食者和1例K粉吸食者毛发样本检测阴性可能与其吸食时间过长，毛发样本毒品分子浓度较低有关，由于胶体金法检测对毒品浓度有一定要求，因此胶体金法检测存在一定的局限性，需要进一步检测。

手持式胶体金光学模组智能化识别和自动检测仪集成了GPS定位、身份证扫描、检测数据快速读取、网络上传并保存等功能，可实现涉毒人员GPS定位、现场查缉结果的原始数据保存、查询、远端上传和溯源等功能，为涉毒人员信息化管理提供可靠的基础数据。

步骤4：毛发样本的SPR检测：

吸毒人员毛发样本消解液经SPR进样装置样本过滤处理，除去消解液毛发杂质。将SPR仪器流速控制在300μl/min，先通过一段连续的PBS缓冲液直至基线稳定。当基线稳定后，经SPR进样装置前处理的海洛因、冰毒、K粉吸食者毛发样本消解液与PBS缓冲液稀释胶体金标记的吗啡抗体、甲基苯丙胺抗体和氯胺酮抗体混合后进样，与SPR传感等离子生物芯片或CM5芯片表面标记的BSA偶联甲基苯丙胺完全抗原、BSA偶联氯胺酮完全抗原、BSA偶联吗啡完全抗原等作用2min，记录SPR响应值的动态变化。SPR反应2 min后结束检测，通入PBS溶液和30mM氢氧化钠溶液，进行洗脱和再生，使抗原-抗体结合物分解，然后PBS缓冲液清洗2min，SPR响应值可回到免疫反应前的基线，可用于下组样品的检测。

SPR传感器羧甲基葡聚糖（CM5）生物芯片制备及标记流程：

滴加2ml 80%乙醇溶液配制的5mM 11-巯基十一烷酸溶液于玻璃金膜表面，40℃ 孵育30min。使巯基烷醇连接于金膜表面以便进一步修饰，同时可对金膜进行封闭而降低了生物分子的非特异性吸附。取出后用80%乙醇溶液洗5次，再用去离子水洗净，氮气吹干。采用体积比为1:1的0.4M NaOH和二甘醇二甲醚溶液配制将环氧氯丙烷溶液，滴加2ml在玻璃金膜上，室温下孵育4h，使表面生成环氧基以用于葡聚糖的共价修饰。取出后用流水缓慢冲洗，80%乙醇溶液洗5次，再用去离子水洗净，氮气吹干。采用0.1M NaOH溶液配制0.3g/ml葡聚糖溶液，滴加2ml在玻璃金膜上，室温下振荡孵育20h。取出后用流水缓慢冲洗，再用50℃去离子水洗净，氮气吹干。2M NaOH溶液配制3ml的1M 溴乙酸溶液，滴加2ml在玻璃金膜上，室温下振荡孵育16h，使葡聚糖羧基化。取出后用去离子水洗净，氮气吹干，即得到CM5芯片。

注射含0.4M EDC和0.1M NHS的氨基偶联试剂200μl，活化CM5芯片上的羧基。将BSA偶联甲基苯丙胺完全抗原、BSA偶联氯胺酮完全抗原、BSA偶联吗啡完全抗原、BSA偶联可卡因完全抗原、BSA偶联MDMA完全抗原等分别用pH 7.4的PBS缓冲液稀释至5mg/ml，注射该溶液200μl，由于BSA上的氨基与CM5芯片上活化的酯基发生氨基偶联反应而使甲基苯丙胺被固定在传感片上。注射 200μl的1M乙醇胺溶液，用来封闭金膜上尚未发生偶联反应的酯基。最后注 入200μl的PH7.4的PBS缓冲液除去非特异吸附的乙醇胺。

微型流通池制备：

聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）属于高分子有机硅化合物，具有较好的光学通透性、化学稳定性、耐厚性和抗拉伸性等，并可以方便修饰表面结构等优点，在微流控领域应用较广，也是微流控芯片的常用材料。本发明提供的SPR生物传感CM5芯片四通道微型流通池结构包含管路和四通道流通池，四通道流通池用于CM5传感芯片。

毛发样本SPR阈值检测

分别精密称量5.00mg（质量以碱计算）吗啡、甲基苯丙胺、氯胺酮标准品于5ml容量瓶中，加入甲醇至刻度线，配制成1mg/ml的标准品储备液；分别取500μl标准品储备液于5ml容量瓶中，加入样本稀释液至刻度线，分别配制成100μg/ml的中间液；分别取100μg/ml标准品中间液，用50ml容量瓶将吗啡（表2）、甲基苯丙胺（表3）、氯胺酮（表4）中间液稀释成以下浓度的待测样品。

分别向SPR进样装置内加入上述表2、表3、表4配置的不同浓度的吗啡、K粉、海洛因吸食人员及未吸毒人员毛发样本消解液各6例，如表6所示，毛发样本SPR阈值检测结果显示5ng/ml、10ng/ml的甲基苯丙胺共振像素衰减值分别为5.67和10，5ng/ml、10ng/ml的吗啡共振像素衰减值分别为8.83和14，5ng/ml、10ng/ml的氯胺酮共振像素衰减值分别为5.17和11.83。因此SPR检测能够对低浓度的毒品进行有效检测，进一步提高检测的准确性。

表 6 SPR检测阈值统计表

实施例1：毛发样本吗啡（MOP）检测

由于胶体金标记的吗啡抗体分子量较大，其与SPR传感器生物芯片表面的吗啡-BSA探针结合后，引起的SPR响应值变化大。如果毛发样本含有吗啡，其与缓冲液中胶体金标记的吗啡抗体结合，导致与芯片表面吗啡-BSA探针结合的抗体数量少，芯片介质折射率和SPR共振峰变化小，SPR响应值降低。因此毛发样品中吗啡分子浓度与SPR响应值的变化成反比。

吗啡通道检测结果显示，200倍稀释吗啡金标抗体甲基SPR响应值为24，200倍稀释吗啡金标抗体分别和手持式胶体金光学模组智能化识别和自动检测仪检测阴性的1例海洛因吸食者和正常人毛发样本消解液分别混合进样，海洛因吸食者吗啡通道SPR共振像素响应值为8，正常人毛发样本消解液吗啡通道SPR共振像素响应值为23（图1），检测时间约120秒。海洛因吸食者吗啡通道SPR共振像素响应值和正常人毛发样本消解液吗啡通道SPR共振像素响应值差值为15（图2），其浓度在10～20ng/ml，吗啡检测结果呈阳性。上述检测结果表明，SPR竞争抑制法检测手持式胶体金光学模组智能化识别和自动检测仪检测阴性的海洛因吸食者毛发样本吗啡方法可行。

实施例2 毛发样本甲基苯丙胺（MET）检测

由于胶体金标记的甲基苯丙胺抗体分子量较大，与SPR传感器生物芯片表面的甲基苯丙胺-BSA探针结合后，引起的SPR响应值变化大。如果毛发样本含有甲基苯丙胺，其与缓冲液中胶体金标记的甲基苯丙胺抗体结合，导致与芯片表面甲基苯丙胺-BSA探针结合的抗体数量少，芯片介质折射率和SPR共振峰变化小，SPR响应值降低。因此毛发样品中甲基苯丙胺分子浓度与SPR响应值的变化成反比。

甲基苯丙胺通道检测结果显示，200倍稀释甲基苯丙胺金标抗体甲基SPR响应值为24，200倍稀释甲基苯丙胺金标抗体和手持式胶体金光学模组智能化识别和自动检测仪检测阴性的自动检测仪检测阴性的1例冰毒吸食者和正常人毛发样本消解液分别混合进样，冰毒吸食者甲基苯丙胺通道SPR共振像素响应值为11，正常人毛发样本消解液甲基苯丙胺通道SPR共振像素响应值为23（图1），检测时间约120秒。海洛因吸食者吗啡通道SPR共振像素响应值和正常人毛发样本消解液甲基苯丙胺通道SPR共振像素响应值差值为12（图3），其浓度在10～20ng/ml，因此冰毒检测结果呈阳性。上述检测结果表明，SPR竞争抑制法检测手持式胶体金光学模组智能化识别和自动检测仪检测阴性的冰毒吸食者毛发样本甲基苯丙胺方法可行。

实施例3 毛发样本氯胺酮（KET）检测：

由于胶体金标记的氯胺酮抗体分子量较大，其与SPR传感器生物芯片表面的氯胺酮-BSA探针结合后，引起的SPR响应值变化大。如果毛发样本含有氯胺酮，其与缓冲液中胶体金标记的氯胺酮抗体结合，导致与芯片表面氯胺酮-BSA探针结合的抗体数量少，芯片介质折射率和SPR共振峰变化小，SPR响应值降低低。因此毛发样品中氯胺酮分子浓度与SPR响应值的变化成反比。

氯胺酮通道检测结果显示，200倍稀释氯胺酮金标抗体甲基SPR响应值为24，200倍稀释氯胺酮金标抗体和手持式胶体金光学模组智能化识别和自动检测仪检测阴性的1例K粉吸食者和正常人毛发样本消解液分别混合进样，K粉吸食者氯胺酮通道SPR共振像素响应值为10，正常人毛发样本消解液氯胺酮通道SPR共振像素响应值为23（图1），检测时间约120秒。K粉吸食者吗啡通道SPR共振像素响应值和正常人毛发样本消解液K粉通道SPR共振像素响应值差值为13（图4），其浓度在10～20ng/ml,K粉检测结果呈阳性。1例K粉吸食者毛发样本消解液混合进样后，上述检测结果表明，SPR竞争抑制法检测手持式胶体金光学模组智能化识别和自动检测仪检测阴性的K粉吸食者毛发样本氯胺酮方法可行。

由于便携式等离子共振（SPR）检测仪可实现5ng/ml 毛发样本痕量毒品的检测，可实现吸食时间过长和毒品分子浓度低的毛发样本检测。

表 7： 吸毒人员和正常人毛发样本SPR检测结果统计表

本发明的方法适用于吸毒人员头发、腿毛、阴毛、腋毛等毛发样本甲基苯丙胺、吗啡、氯胺酮、MDMA、可卡因、甲卡西酮、四氢大麻酚等毒品小分子的检测，但与以下任何一种物质无非特异性交叉反应：异丙嗪、异丙基苄胺、二甲砜、磷酸可待因、咖啡因、甲基麻黄素、伪麻黄碱、环己基胺和美沙酮。

本发明的毛发快速消解液1分钟内完成毛发样本待测毒品分子的高效释放，且其消解提取液大分子蛋白杂质含量低；为胶体金检测、手持式胶体金光学模组智能化识别和自动检测、便携式SPR检测、ELISA、放射免疫分析法、色谱法检测提供一种快速、高效、简便的毛发毒品分子提取方法。

Claims (7)

1.一种毛发中毒品的快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）毛发样本的收集：收集吸毒人员及未吸毒人员的毛发样本各两份，并分别分装到毛发样本取样袋中，一袋作为检测样品，另一袋留样备用，分别用记号笔记录相关检测信息；

2）毛发样本酶解提取：分别取出取样袋中的检测样品，用医用剪刀剪碎后加入毛发快速消解液，并手工快速震荡，静置后得到相应的毛发消解提取液；所述毛发快速消解液包括角蛋白酶5000～20000IU/L、Na2HPO4 35.5g/L、NaCl 8.775g/L、Casein 1～2g/L、PVP-10 1～2g和NaN3 0.05～0.2g/L；角蛋白酶用于降解毛发的主要成分角蛋白，释放出小分子毒品；Na₂HPO₄提供合适的酶反应PH环境，中和酶反应产生的产物；NaCl提供合适的离子强度；Casein在长期保存中稳定酶的活性；PVP-10增加角蛋白酶在水中的溶解度；NaN₃作为毛发快速消解液的防腐剂；

3）毛发样本的胶体金法检测：将步骤2）中得到的毛发消解提取液通过胶体金法检测装置进行检测，初步观察胶体金法检测装置的质控线与检测线；再利用胶体金光学模组智能化识别和自动检测检测仪，对胶体金法检测装置质控线及检测线进行判读，若检测仪判读为阴性，则对毛发样本进行SPR检测；

4）毛发样本的SPR检测：首先制备SPR传感器生物芯片，并在SPR传感器生物芯片的表面标记BSA偶联毒品完全抗原；用胶体金标记毒品抗体并用PBS缓冲液稀释；将毛发样本消解液经SPR检测仪进样装置过滤处理后与PBS缓冲液稀释胶体金标记的毒品混合后进样；最后将混合后的进样与SPR传感器生物芯片表面标记的BSA偶联毒品完全抗原作用，记录SPR响应值的动态变化，SPR反应2 min后结束检测，若SPR响应值出现明显衰弱，则为阳性。

2.根据权利要求1所述的一种毛发中毒品的快速检测方法，其特征在于，所述毛发样本采用吸毒人员头发、腿毛、阴毛或腋毛。

3.根据权利要求1所述的一种毛发中毒品的快速检测方法，用于对甲基苯丙胺、吗啡、氯胺酮、MDMA、可卡因、甲卡西酮或四氢大麻酚毒品的检测。

4.根据权利要求1所述的一种毛发中毒品的快速检测方法，其特征在于，所述毛发快速消解液包括角蛋白酶10000IU/L、Na2HPO4 35.5g/L、NaCl 8.775g/L、Casein 2g/L、PVP-102g和NaN3 0.2g/L。

5.根据权利要求1所述的一种毛发中毒品的快速检测方法，其特征在于，所述步骤4）中SPR传感器生物芯片采用羧甲基葡聚糖生物芯片，

所述羧甲基葡聚糖生物芯片制备如下：

步骤1）滴加2ml 80%乙醇溶液配制的5mM 11-巯基十一烷酸溶液于玻璃金膜表面，在40℃ 孵育30min；使巯基烷醇连接于金膜表面以便进一步修饰，同时可对金膜进行封闭而降低了生物分子的非特异性吸附；取出后用80%乙醇溶液洗5次，再用去离子水洗净，氮气吹干；

步骤2）采用体积比为1:1的0.4M NaOH和二甘醇二甲醚溶液配制环氧氯丙烷溶液，滴加2ml在玻璃金膜上，室温下孵育4h，使表面生成环氧基以用于葡聚糖的共价修饰；取出后用流水缓慢冲洗，80%乙醇溶液洗5次，再用去离子水洗净，氮气吹干；

步骤3）采用0.1M NaOH溶液配制0.3g/ml葡聚糖溶液，滴加2ml在玻璃金膜上，室温下振荡孵育20h，取出后用流水缓慢冲洗，再用50℃去离子水洗净，氮气吹干；

步骤4）2M NaOH溶液配制3ml的1M 溴乙酸溶液，滴加2ml在玻璃金膜上，室温下振荡孵育16h，使葡聚糖羧基化，取出后用去离子水洗净，氮气吹干，即得到羧甲基葡聚糖芯片。

6.根据权利要求5所述的一种毛发中毒品的快速检测方法，其特征在于，所述羧甲基葡聚糖生物芯片标记BSA偶联毒品完全抗原的方法如下：

步骤1）注射含0.4M EDC和0.1M NHS的氨基偶联试剂200μl，活化生物芯片上的羧基，将BSA偶联毒品完全抗原分别用pH 7.4的PBS缓冲液稀释至5mg/ml，注射该溶液200μl，由于BSA上的氨基与SPR传感生物芯片上活化的酯基发生氨基偶联反应而使毒品被固定在传感片上；

步骤2）注射 200μl的1M乙醇胺溶液，用来封闭金膜上尚未发生偶联反应的酯基，最后注入200μl的PH7.4的PBS缓冲液除去非特异吸附的乙醇胺。

7.根据权利要求1或5所述的一种毛发中毒品的快速检测方法，其特征在于，所述SPR传感器生物芯片采用聚甲基丙烯酸甲酯制成，并采用四通道微型流通池结构，包括管路及四通道流通池。