CN108834966A - 一种低铜福建牡蛎选育系的制种方法 - Google Patents
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Abstract
一种低铜福建牡蛎选育系的制种方法，涉及水产生物遗传育种技术。从同一性成熟福建牡蛎群体中挑选壳型整齐的个体作为基础选育群体暂养；取部分外套膜进行铜含量测定，剩余软体部在低温高湿条件下原位保存；通过电感耦合等离子体质谱法完成外套膜铜含量测定；将亲贝复苏，进行人工受精，受精成功出现极体后洗去多余精子；将群体选育系受精卵置于养殖池中孵化及浮游幼体培育，幼体附着变态后继续培育稚贝；将培育得到的稚贝转移至同一养殖海域进行养殖，获得子一代低铜选育系，9～12个月后子一代发育至性成熟并达到商品规格；从性成熟子一代中选择壳型整齐、大小近似的个体，重复1～2次进行性状固定，获得低铜富集的福建牡蛎新品系。
Description
技术领域
本发明涉及水产生物遗传育种技术，尤其是涉及一种低铜福建牡蛎选育系的制种方法。
背景技术
牡蛎肉味鲜美，营养丰富，是传统的贝类养殖品种之一。福建牡蛎(Crassostreaangulata)又称葡萄牙牡蛎，因其生长快、活力强等特点而被视为优良的牡蛎养殖品种。2016年福建牡蛎产量高达174.66万吨，占全国牡蛎总产量的36.13％(中国渔业年鉴2017)。由此可见福建牡蛎养殖业已成为我国重要的海洋与渔业产业。
随着养殖业发展，福建牡蛎的营养品质和食品安全受到越来越多的关注。牡蛎有很强的铜富集能力，可将海水中铜高效富集于软体部。在洁净海域中福建牡蛎软体部铜含量可达0.1～0.4mg/g干重(史博等，2015)。由于环境变化以及食品结构调整，我国居民膳食营养中铜的推荐日摄取量从2mg/日(2006年)降低到0.8mg/日(2017年)，但是我国居民铜平均每日实际摄取量约为1.9mg，大大超出推荐适宜摄取量。由此可见降低饮食中铜摄取量更符合现在中国国民膳食营养需求，而牡蛎高富集铜的特性与居民低铜膳食需求存在显著矛盾。此外很多近海河口养殖海域面临工业化、生活废水排放造成的重金属污染威胁，而牡蛎在污染海域体内铜富集量甚至高达10mg/g(干重)以上(王文雄等，2011)。无论从满足国民膳食营养需求还是食品安全角度出发，都需要降低牡蛎软体部中铜富集量。
因此培育低铜含量的福建牡蛎新品系是市场变化的需求，对牡蛎养殖业的健康可持续发展具有重要意义。但是目前关于低铜富集性状的牡蛎选育工作依然是一片空白，急需技术突破。
发明内容
本发明的目的在于针对目前福建牡蛎养殖产业中缺乏低铜、优质安全新品种的现状，提供健康、安全、优质的一种低铜福建牡蛎选育系的制种方法。
本发明包括以下步骤：
1)从同一性成熟福建牡蛎群体中挑选壳型整齐的个体作为基础选育群体，暂养3～7天；
在步骤1)中，所述个体可采用大小近似、相同年龄且性腺指数超过50％的福建牡蛎；壳型挑选原则可为：壳长≥10cm，壳高≥3cm，总重近似；所述暂养的条件可为水温25～30℃，盐度25～30，每日投喂2～3次饵料，每次饵料包括角毛藻2～3万细胞/ml、小球藻2～3万细胞/ml、扁藻3～5万细胞/ml，日换水量为1/2，每日水体饵料滤食干净后进行换水以避免精卵排放。
2)从步骤1)的基础选育群体中挑选性腺饱满的个体，取部分外套膜进行铜含量测定，剩余软体部在低温高湿条件下原位保存；
在步骤2)中，所述取部分外套膜的铜含量可以准确表征牡蛎铜富集性状；所述原位保存可采用软体部放置于牡蛎壳中，保持性腺组织完整无损伤，避免生殖细胞流出以影响后续精卵保存，保存温度4～10℃，湿度90％以上；原位保存可以最大限度减少对性腺的损伤，低温高湿环境下性腺为生殖细胞保存提供最适宜的理化条件，可有效保存48h。
3)通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法完成外套膜铜含量测定；
在步骤3)中，所述通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法完成外套膜铜含量测定，可以10％选择压选取铜含量最低的雌雄各50只作为亲贝；所述铜含量测定的时间可为24～48h，以免影响所保存亲贝的生殖细胞活力。
4)将步骤3)中所选亲贝复苏，进行人工受精，受精成功出现极体后洗去多余精子；
在步骤4)中，所述亲贝复苏的方法是将亲本软体部取出，放置于20℃过滤海水中20～40min，卵子收集后在25℃海水中熟化30min后，以精卵比(10～15)︰1进行人工受精。
5)将步骤4)中群体选育系受精卵置于养殖池中孵化及浮游幼体培育，幼体附着变态后继续培育稚贝；
在步骤5)中，所述培育稚贝的长度可为1.5～2.5mm，优选2mm。
6)将步骤5)培育得到的稚贝转移至同一养殖海域进行养殖，获得子一代低铜选育系，9～12个月后子一代发育至性成熟并达到商品规格；
在步骤6)中，所述稚贝可在不同海域进行培育，确定其选育效力是否存在普适性，在海上培育过程时保证同一养殖密度、养殖笼具放置深度，定期分苗和清理；所述养殖时，养殖密度、养殖水层深度保持一致。
7)从性成熟子一代中选择壳型整齐、大小近似的个体，按照步骤2)～6)重复1～2次进行性状固定，获得低铜富集的福建牡蛎新品系。
本发明所养殖的福建牡蛎存在显著的铜富集个体差异，并且该性状是一种数量性状，因此，可通过对铜富集这一性状的精准测定、连续定向优选、纯化稳定，在保证福建牡蛎高速生长的前提下有效降低牡蛎软体部铜含量，使福建牡蛎更适合我国居民膳食营养需求，本发明从同一群体福建牡蛎存在较大铜含量个体差异的生物学特征出发，根据外套膜铜含量可以较为准确指示牡蛎软体部铜含量的原则，突破牡蛎生殖细胞原位保存技术难点，进而通过亲本优选、定向选育、性状固定一系列方法，实现福建牡蛎低铜含量性状的选择。本发明实用性强、效果显著、易于推广。通过本发明可以获得健康、安全、优质的低铜福建牡蛎新品系。
具体实施方式
以下实施例将对本发明作进一步的说明。
本发明实施例包括如下步骤：
1.从诏安湾1年龄福建牡蛎养殖群体中挑选壳长10cm以上，壳高3cm以上，总重近似的个体2000个作为基础群，带回育苗场暂养池暂养7天，保证牡蛎活力，暂养条件为水温25～27℃，盐度25，每日投饵两次，每次投喂角毛藻3万细胞/ml、小球藻3万细胞/ml、扁藻5万细胞/ml，每日水体饵料滤食干净后缓慢换掉一半海水；
2.选取性腺饱满的雌雄牡蛎各500只，取外套膜0.1～0.3g用以铜含量测定，剩余软体部原位放置于下壳(凹壳)内，上壳覆盖后以含海水脱脂棉包覆，置于8℃低温保存，环境湿度保持100％，再从基础群体中随机选取雌雄各50只作为对照群体亲贝并同样低温保存；
3.软体部低温保存过程中进行外套膜铜含量测定，外套膜称重后以2ml浓硝酸消解，稀释后利用ICP-MS测定铜浓度，测定完成需28h，根据测定结果在牡蛎中以10％选择压选取铜含量最低的雌雄各50只作为低铜选育系亲贝；
4.将上述亲贝软体部取出，放置于20℃海水中复苏30min，收集卵子以300目筛绢过滤清洗并浸泡海水30min，收集精子用300目筛绢滤掉杂质后以精卵比15︰1立即进行人工受精，30min后洗掉多余精子；
5.养殖池预先用漂白粉消毒清洗并晾干，将上述受精卵置于养殖池中孵化，微充气孵化12h候后虹吸去除未孵化死卵；D型幼体培育密度为5～8个/ml，随着幼体生长适时分池，在壳顶幼体中后期密度调整为1个/ml；幼体培育饵料为孵化24h后少量小球藻开口，随后2天投喂金藻，后投喂小球藻，适量添加角毛藻，幼虫发育至壳顶中期添加扁藻；在水温25～27℃，盐度25的条件下，经过15天培育至眼点期幼体；
6.眼点幼体生长至320微米以上时，投放附着基，附着后在养殖池继续培育至稚贝达到2mm，从受精卵孵化到幼体培育期间，不同选育群严格隔离，避免种质污染，将各个群体稚贝在东山岐下村及晋江围头港海域进行海上养殖，养殖期间定期进行分苗并采样测定牡蛎铜含量及生长性状，9～12个月后子一代达到商品规格并发育至性成熟；
7.从性成熟子一代中选择壳型整齐、大小近似的个体，按照步骤2～6重复进行群体定向选育，获得低铜含量的福建牡蛎新品系。
本发明建立了的低铜含量福建牡蛎选育方法，所获得福建牡蛎低铜选育群在东山海域养殖9个月生长至商品规格时体内铜含量比对照群降低19.90％，在围头港海域则比对照降低20.03％，而在幼体发育、生长相关性状等方面则和对照没有差异。
Claims (10)
1.一种低铜福建牡蛎选育系的制种方法，其特征在于包括以下步骤：
1)从同一性成熟福建牡蛎群体中挑选壳型整齐的个体作为基础选育群体，暂养3～7天；
2)从步骤1)的基础选育群体中挑选性腺饱满的个体，取部分外套膜进行铜含量测定，剩余软体部在低温高湿条件下原位保存；
3)通过电感耦合等离子体质谱法完成外套膜铜含量测定；
4)将步骤3)中所选亲贝复苏，进行人工受精，受精成功出现极体后洗去多余精子；
5)将步骤4)中群体选育系受精卵置于养殖池中孵化及浮游幼体培育，幼体附着变态后继续培育稚贝；
6)将步骤5)培育得到的稚贝转移至同一养殖海域进行养殖，获得子一代低铜选育系，9～12个月后子一代发育至性成熟并达到商品规格；
7)从性成熟子一代中选择壳型整齐、大小近似的个体，按照步骤2)～6)重复1～2次进行性状固定，获得低铜富集的福建牡蛎新品系。
2.如权利要求1所述一种低铜福建牡蛎选育系的制种方法，其特征在于在步骤1)中，所述个体采用大小近似、相同年龄且性腺指数超过50％的福建牡蛎。
3.如权利要求1所述一种低铜福建牡蛎选育系的制种方法，其特征在于在步骤1)中，壳型挑选原则为：壳长≥10cm，壳高≥3cm，总重近似。
4.如权利要求1所述一种低铜福建牡蛎选育系的制种方法，其特征在于在步骤1)中，所述暂养的条件为水温25～30℃，盐度25～30，每日投喂2～3次饵料，每次饵料包括角毛藻2～3万细胞/ml、小球藻2～3万细胞/ml、扁藻3～5万细胞/ml，日换水量为1/2，每日水体饵料滤食干净后进行换水以避免精卵排放。
5.如权利要求1所述一种低铜福建牡蛎选育系的制种方法，其特征在于所述在步骤2)中，所述取部分外套膜的铜含量是以准确表征牡蛎铜富集性状。
6.如权利要求1所述一种低铜福建牡蛎选育系的制种方法，其特征在于所述在步骤2)中，所述原位保存采用软体部放置于牡蛎壳中，保持性腺组织完整无损伤，避免生殖细胞流出以影响后续精卵保存，保存温度4～10℃，湿度90％以上；原位保存最大限度有效保存48h。
7.如权利要求1所述一种低铜福建牡蛎选育系的制种方法，其特征在于在步骤3)中，所述通过电感耦合等离子体质谱法完成外套膜铜含量测定，是以10％选择压选取铜含量最低的雌雄各50只作为亲贝；所述铜含量测定的时间为24～48h。
8.如权利要求1所述一种低铜福建牡蛎选育系的制种方法，其特征在于在步骤4)中，所述亲贝复苏的方法是将亲本软体部取出，放置于20℃过滤海水中20～40min，卵子收集后在25℃海水中熟化30min后，以精卵比(10～15)︰1进行人工受精。
9.如权利要求1所述一种低铜福建牡蛎选育系的制种方法，其特征在于在步骤5)中，所述培育稚贝的长度为1.5～2.5mm，优选2mm。
10.如权利要求1所述一种低铜福建牡蛎选育系的制种方法，其特征在于在步骤6)中，所述稚贝是在不同海域进行培育，确定其选育效力是否存在普适性，在海上培育过程时保证同一养殖密度、养殖笼具放置深度，定期分苗和清理；所述养殖时，养殖密度、养殖水层深度保持一致。
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