CN108823256A - 一种表面活性剂改良酶法制备甘油磷脂酰胆碱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种表面活性剂改良酶法制备甘油磷脂酰胆碱的方法。该方法包括以下步骤：将卵磷脂分散于纯水中搅拌30‑60min，得分散液；向分散液中加入非离子表面活性剂搅拌均匀得反应体系，备用；向反应体系中加入酶液于35‑50℃下反应30‑60min，分离甘油磷脂酰胆碱，即可。本发明通过在水相的反应体系中添加了聚氧乙烯类非离子型表面活性剂可以获得一种更加高效快速的生产甘油磷脂酰胆碱的方法，不仅提高了底物磷脂酰胆碱在水相体系中的分散程度，而且加快了中间产物酰基转移的速率，极大的缩短了单用磷脂酶A1催化反应体系所使用的时间，是一种更加适合工业化生产的方法，具有良好的工业化应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及甘油磷脂酰胆碱的制备领域，具体涉及一种表面活性剂改良酶法制备甘油磷脂酰胆碱的方法。
背景技术
甘油磷脂酰胆碱（L-α-GPC）由磷脂酰胆碱水解生成，它不仅可以合成磷脂酰胆碱的前体，也是人体内合成神经递质乙酰胆碱的前体，在治疗阿兹海默老年痴呆症等疾病中拥有潜在的应用价值。
申请号201010248594.X公开了一种利用磷脂酶在水相体系中水解卵磷脂制备甘油磷脂酰胆碱的方法。磷脂酶水解磷脂中的脂肪酸时对其位置有专一性，磷脂酶A1只能专一性的水解磷脂酰胆碱的Sn-1位的脂肪酸，生成Sn-2-LPC。因此单用磷脂酶A1催化磷脂酰胆碱水解生成甘油磷脂酰胆碱，需要经历一步酰基转移的过程，从Sn-2-LPC转移生成Sn-1-LPC。这种酰基转移发生的原因是Sn-1-LPC的热力学稳定性要比Sn-2-LPC低。从Sn-2-LPC到Sn-1-LPC的酰基转移持续到动态平衡。这使得甘油磷脂酰胆碱L-α-GPC的产生速率和PC的消耗率过高依赖于中间产物Sn-2-LPC的酰基转移的速率，导致整个酶反应时间较长。另外，磷脂酰胆碱在水相体系中的溶解度低，酶反应中甘油磷脂酰胆碱的得率低。
发明内容
针对现有技术问题，本发明的目的在于提供一种表面活性剂改良酶法制备甘油磷脂酰胆碱的方法，该方法反应简单，成本低廉，产量高，更适合工业化生产。
一种表面活性剂改良酶法制备甘油磷脂酰胆碱的方法，包括以下步骤：
步骤1，将卵磷脂分散于纯水中搅拌30-60min，得分散液；
步骤2，向分散液中加入非离子型表面活性剂搅拌均匀得反应体系，备用；
步骤3，向反应体系中加入酶液，于35-50℃下反应30-60min，分离甘油磷脂酰胆碱，即可。
作为改进的是，步骤1中所述卵磷脂的来源为蛋黄或大豆。
作为改进的是，步骤2中所述非离子表面活性剂为聚氧乙烯类非离子型表面活性剂。
进一步改进的是，所述聚氧乙烯类非离子型表面活性剂为Span或吐温系列中任一种。
作为改进的是，步骤3中所述酶液中酶为除磷脂酶C和磷脂酶D外的所有磷脂酶。
进一步改进的是，所述酶的添加量为0.16-1.28g/L。
有益效果：
与现有技术相比，本发明采用水相体系，并向体系中添加聚氧乙烯类非离子型表面活性剂可以获得一种更加高效快速的生产甘油磷脂酰胆碱的方法，不仅改善了底物磷脂酰胆碱在水相体系中的分散程度，还加快了中间产物酰基转移的速率，极大的缩短了单用磷脂酶A1催化反应体系所用的时间。底物磷脂酰胆碱的转化率可达到96.8%以上，产物甘油磷脂酰胆碱的产率可达到92.8%以上，且反应时间比目前报道的水相体系中低底物浓度的反应体系缩短了三倍。因此，本发明制备甘油磷脂酰胆碱具有良好的工业化前景。
附图说明
图1为本发明制备甘油磷脂酰胆碱的反应路线图；
图2为不同体系反应中PC转化率和LPC/GPC的产率随时间变化的曲线图；
图3为分批补料对甘油磷脂酰胆碱的影响。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详细介绍。
实施例1
一种表面活性剂改良酶法制备甘油磷脂酰胆碱的方法，包括以下步骤：
25g的卵磷脂（PC含量70%，PE含量15%，由蛋黄磷脂提取制得），添加30mL的纯水，将混合磷脂在水中均质10-30min，分两种情况，1号反应体系为不添加聚氧乙烯类非离子型表面活性剂（即空白组），2号反应体系添加聚氧乙烯类非离子型表面活性剂，添加0.16-1.28g/L的磷脂酶A1（Lecitase Ultra），来源于诺维信公司。将混合物在45℃下正常搅拌3小时，定时取样，再通过高效液相色谱检测产物的含量，实验结果如图2所示。
空白体系中，当反应进行3h时，体系的转化率达到92%以上，而在添加了聚氧乙烯类非离子型表面活性剂的体系中，当反应进行1h时，反应的转化率就达到92%以上。上述两体系反应结束后，最终PC的消耗率和GPC的产率都差不多，但是添加聚氧乙烯类非离子型表面活性剂的体系所用的反应时间缩短至空白组的1/3。另外，与以往的报道相比，我们在纯水相体系中的底物浓度远远要高于目前报道的纯水相体系中的浓度。
在上述检测中高效液相色谱的检测方法： Agilent 1260 高效液相色谱；检测器：ELSD；色谱柱为Agilent ZORBAX RX-SIL；流动相：90%甲醇；流速1 ml/min；柱温25℃；漂移管温度：65℃；柱温25℃；氮气流速：1.5SLM。
实施例2
取25g的卵磷脂（PC含量70%，PE含量15%，由蛋黄磷脂提取制得），添加30mL的纯水，均质10-30min，再添加聚氧乙烯类非离子型表面活性剂，添加0.16-1.28g/L的磷脂酶A1 （Lecitase Ultra），来源于诺维信公司。将反应混合物在45℃下搅拌，每隔30min补料25g磷脂混合物，总共补料5次，总底物浓度达到360g/L。每30min取样检测产物甘油磷脂酰胆碱的含量。在反应进行3h时，PC的转化率为93.9%；GPC的得率为91.3%。
综上所述，本发明方法不仅提高了底物磷脂酰胆碱在水相体系中的分散程度，而且加快了中间产物酰基转移的速率，极大的缩短了单用磷脂酶A1催化反应体系所使用的时间。反应结束后，底物磷脂酰胆碱的转化率可达到96.8%以上，产物甘油磷脂酰胆碱的产率可达到92.8%以上，且反应时间比目前报道的水相体系中低底物浓度的反应体系缩短了三倍。
另外，本发明不限于上述实施方式，只要在不超出本发明的范围内，可以采取各种方式实施本发明。
Claims (6)
1.一种表面活性剂改良酶法制备甘油磷脂酰胆碱的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，将卵磷脂分散于纯水中搅拌30-60min，得分散液；步骤2，向分散液中加入非离子型表面活性剂搅拌均匀得反应体系，备用；步骤3，向反应体系中加入酶液，于35-50℃下反应30-60min，分离甘油磷脂酰胆碱，即可。
2.根据权利要求1所述的表面活性剂改良酶法制备甘油磷脂酰胆碱的方法，其特征在于，步骤1中所述卵磷脂的来源为蛋黄或大豆。
3.根据权利要求1所述的表面活性剂改良酶法制备甘油磷脂酰胆碱的方法，其特征在于，步骤2中所述非离子表面活性剂为聚氧乙烯类非离子型表面活性剂。
4.根据权利要求3所述的表面活性剂改良酶法制备甘油磷脂酰胆碱的方法，其特征在于，所述聚氧乙烯类非离子型表面活性剂为Span或吐温系列中任一种。
5.根据权利要求1所述的表面活性剂改良酶法制备甘油磷脂酰胆碱的方法，其特征在于，步骤3中所述酶液中酶为除磷脂酶C和磷脂酶D外的所有磷脂酶。
6.根据权利要求5所述的表面活性剂改良酶法制备甘油磷脂酰胆碱的方法，其特征在于，步骤3中所述酶的添加量为0.16-1.28g/L。
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