CN108795817B - 一种微生物菌剂及该微生物菌剂的制备、使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微生物菌剂，包括枯草芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌、屎肠球菌、酿酒酵母。同时公开了该微生物菌剂的制备方法和使用方法：将枯草芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌、屎肠球菌、酿酒酵母分别接入到液体种子活化培养基进行活化，然后分别接入到扩增培养基进行一级培养，再分别将一级培养所得菌液接入到另外的扩增培养基进行二级培养，二级培养所得各菌液按比例混合混匀，然后接入含5%糖蜜的无机盐培养基中，微好氧发酵7天，得到微生物菌剂。本发明的微生物菌剂不含致病菌，不含重金属和有毒害化学物质，适合水产养殖领域中养殖水的生物处理。实际应用不会对环境造成二次污染，不会额外造成负担，属于环境友好亲和型微生物菌剂产品。

Description

一种微生物菌剂及该微生物菌剂的制备、使用方法
技术领域
一种微生物菌剂及该微生物菌剂的制备、使用方法，属于水产养殖中养殖水的生物处理技术领域。
背景技术
我国是一个水产养殖大国，水体中氨氮、亚硝酸盐对水生动物具有危害，应将水体中氨氮保持在2mg/L以下，亚硝酸盐保持在1mg/L 以下。微生物菌群作为环保型高效的水处理制剂，其技术关键是：筛选、培养、驯化出能快速高效去除污染物的菌群。
微生物菌剂中的高效菌种是通过从微生物菌种保藏中心得到。再经过特定的培养基活化，按照不同比例将各菌种复合配制成养殖水处理的菌剂。通过添加有益菌，在达到污染物去除的同时，增加水生动物的抵抗力，减少疾病的爆发。
本发明根据不同养殖水的特点，制备出能有效控制水体污染物的的微生物菌剂，使水体保持清爽。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种微生物菌剂，以单个纯菌株培养到对数末期的活菌数量比计，包括25-35％的枯草芽孢杆菌、27-32％的弯曲芽孢杆菌、30-32％的屎肠球菌、6-12％的酿酒酵母。
所述微生物菌剂，以单个纯菌株培养到对数末期的活菌数量比计，包括32％的枯草芽孢杆菌、32％的弯曲芽孢杆菌、28％的屎肠球菌、8％的酿酒酵母。
一种微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：将枯草芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌、屎肠球菌、酿酒酵母分别接入到液体种子活化培养基进行活化，然后分别再以1-3％的接种量接入到扩增培养基进行一级培养，再分别将一级培养所得菌液以1-3％的接种量接入到另外的扩增培养基进行二级培养，二级培养所得各菌液按比例混合混匀制成初始微生物混合菌剂，将初始微生物混合菌剂接入含5％糖蜜的无机盐培养基中，微好氧发酵7天，得到微生物菌剂。
枯草芽孢杆菌的活化条件包括有温度35-38℃、时间10-14小时；弯曲芽孢杆菌的活化条件包括有温度35-38℃、时间10-14小时；屎肠球菌的活化条件包括有温度35-38℃、时间10-14小时；酿酒酵母的活化条件包括有温度28-32℃、时间22-24小时。
用于活化所述枯草芽孢杆菌的培养基成分以质量百分比计，包括 0.8-1.2％的蛋白胨、0.8-1.2％的氯化钠、0.4-0.6％的酵母膏、 0.5-1.5％的氢氧化钠，培养基的pH值调到6.5-7.5，将培养基在 115℃条件下灭菌20分钟后再用来活化枯草芽孢杆菌；用于活化所述弯曲芽孢杆菌的培养基成分以质量百分比计，包括0.8-1.2％的蛋白胨、0.8-1.2％的氯化钠、0.4-0.6％的酵母膏、0.5-1.5％的氢氧化钠，培养基的pH值调到6.5-7.5，将培养基在115℃条件下灭菌20分钟后再用来活化弯曲芽孢杆菌；活化所述屎肠球菌的培养基为MRS液体培养基，MRS液体培养基在120℃条件下灭菌15分钟后再进行屎肠球菌活化；活化所述酿酒酵母的培养基的成分以质量百分比计，包括 0.8-1.2％的酵母膏、1.5-2.5％的蛋白胨、1-3％的蔗糖，将培养基在 115℃条件下灭菌20分钟再用来活化酿酒酵母。
枯草芽孢杆菌的一级培养包括温度为35-38℃、转速为50rpm、时间为10-14小时，枯草芽孢杆菌的二级培养包括温度为35-38℃、转速为200rpm、时间为9-11小时；所述弯曲芽孢杆菌的一级培养包括温度为35-38℃、转速为50rpm、时间为10-14小时，弯曲芽孢杆菌的二级培养包括温度为35-38℃、转速为200rpm、时间为9-11 小时；所述屎肠球菌的一级培养包括温度为35-38℃、转速为50rpm、时间为10-14小时，屎肠球菌的二级培养包括温度为28-35℃、转速为100rpm、时间为9-11小时；所述酿酒酵母的一级培养包括温度为28-32℃、转速为50rpm、时间为16-20小时，酿酒酵母的二级培养包括温度为28-32℃、转速为200rpm、时间为14-16小时；
用于枯草芽孢杆菌一级培养和二级培养使用的扩增培养基成分以质量百分比计，包括0.8-1.2％的蜜糖、0.4-0.6％的酵母膏、 0.8-1.2％的氯化钠，扩增培养基的pH值调到6.5-7.5，将扩增培养基在115℃条件下灭菌20分钟后再分别用来枯草芽孢杆菌的一级培养和二级培养；用于弯曲芽孢杆菌一级培养和二级培养使用的扩增培养基的成分以质量百分比计，包括0.8-1.2％的蜜糖、0.4-0.6％的酵母膏、0.8-1.2％的氯化钠，扩增培养基的pH值调到6.5-7.5，将扩增培养基在115℃条件下灭菌20分钟后再分别用来弯曲芽孢杆菌的一级培养和二级培养；用于屎肠球菌一级培养和二级培养使用的扩增培养基为MRS液体培养基，MRS液体培养基在120℃条件下灭菌15后再分别用来屎肠球菌的一级培养和二级培养；用于酿酒酵母一级培养和二级培养使用的扩增培养基的成分以质量百分比计，包括0.8-2.2％的蜜糖、0.8-1.2％的酵母膏，将扩增培养基在115℃条件下灭菌20 分钟后再分别用来酿酒酵母的一级培养和二级培养。
一种微生物菌剂的使用方法，在每亩养殖水中添加500ml所述微生物菌剂，一个月添加两到三次，微生物菌剂中活菌数量在30亿 CFU/ml以上。
本发明的有益效果是：本发明的微生物菌剂不含致病菌，不含重金属和有毒害化学物质，适合水产养殖领域中养殖水的生物处理。实际应用不会对环境造成二次污染，不会额外造成负担，属于环境友好亲和型微生物菌剂产品。本发明的微生物菌剂的制备方法易操作，产品方便储运和投放。
具体实施方式
一种微生物菌剂的制备方法：
1、从-70℃的冰箱中取出甘油冻管保藏的枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilisCCTCC AB 130006)菌种、弯曲芽孢杆菌 (Bacillus flexus CCTCC AB 206923)菌种、屎肠球菌 (Enterococcus faecium CICC 20680)菌种、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiaeATCC 9080)菌种，在经紫外灭菌的超净工作台中融解，移液枪无菌吸取1ml接入已灭菌的10ml液体种子活化培养基中，其中，用于活化所述枯草芽孢杆菌的培养基成分以质量百分比计，包括1.0％的蛋白胨、1.0％的氯化钠、0.5％的酵母膏、 1.0％的氢氧化钠，培养基的pH值调到7.0，将培养基在115℃条件下灭菌20分钟后再用来活化枯草芽孢杆菌；用于活化所述弯曲芽孢杆菌的培养基成分以质量百分比计，包括1.0％的蛋白胨、1.0％的氯化钠、0.5％的酵母膏、1.0％的氢氧化钠，培养基的pH值调到7.0，将培养基在115℃条件下灭菌20分钟后再用来活化弯曲芽孢杆菌；活化所述屎肠球菌的培养基为MRS液体培养基，MRS液体培养基在 120℃条件下灭菌15分钟后再进行屎肠球菌活化；活化所述酿酒酵母的培养基的成分以质量百分比计，包括1.0％的酵母膏、2.0％的蛋白胨、2％的蔗糖，将培养基在115℃条件下灭菌20分钟再用来活化酿酒酵母。
2、枯草芽孢杆菌接入液体种子活化培养基后，在37℃的温度条件下活化12小时；弯曲芽孢杆菌接入液体种子活化培养基后，在37℃的温度条件下活化12小时；屎肠球菌接入液体种子活化培养基后，在32℃的温度条件下活化12小时；酿酒酵母接入液体种子活化培养基后，在30℃的温度条件下活化24小时。
3、无菌条件下吸取活化好的各菌种1ml，接入50mL的扩增培养基中，进行一级培养。枯草芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌在37℃、50rpm 条件下培养12小时左右；屎肠球菌在35℃、200rpm条件下培养12 小时左右；酿酒酵母在30℃、50rpm条件下培养18小时。其中，枯草芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌的一级培养用扩增培养基的组成为：1％糖蜜，0.5％酵母膏，1％氯化钠，pH 值调至7.0；屎肠球菌的的一级培养用扩增培养基成分为MRS；酿酒酵母的的一级培养用扩增培养基组成为：2％糖蜜，1％酵母膏。扩增培养基均在115℃条件下灭菌20分钟后再分别用来一级培养。
4、将一级培养好的种子液以2％的接种量接入新鲜扩增培养基中进行二次培养，枯草芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌在37℃、200rpm条件下培养10小时左右；屎肠球菌在30℃、100rpm条件下培养10小时左右；酿酒酵母在30℃、200rpm条件下培养15小时。其中，枯草芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌的二级培养用扩增培养基的组成为：1％糖蜜， 0.5％酵母膏，1％氯化钠，pH 值调至7.0；屎肠球菌的的二级培养用扩增培养基成分为MRS；酿酒酵母的的二级培养用扩增培养基组成为： 2％糖蜜，1％酵母膏。扩增培养基均在115℃条件下灭菌20分钟后再分别用来二级培养。
5、将二级培养所制得二级种子液按照枯草芽孢杆菌32％、弯曲芽孢杆菌32％、屎肠球菌28％、酿酒酵母8％混合，即做成初始微生物混合菌剂。
6、将初始微生物混合菌剂接入含5％糖蜜的无机盐培养基中，微好氧发酵7天，得到本发明的微生物菌剂。
经测试，本本发明的微生物菌剂活菌浓度>109CFU/mL，室温下能稳定保存12个月，按此比例混合，本菌剂能发挥最佳效果的条件(但不仅仅局限于此条件)，同时本菌剂能适应多种养殖废水的处理。最佳应用条件：温度为20-40℃；pH为6.5-8.5。
将上述方法制备得到的微生物菌剂分别进行测试：
1、采用本发明菌剂对南美白对虾养殖的养殖废水进行处理。将 1L菌剂均匀泼洒到4亩南美白对虾的养殖塘中，每月施用两次，从虾放苗到收获，水体中氨氮维持在1.5mg/L以下，亚硝酸盐维持在 0.5mg/L以下，每亩收获700-800斤。未施用本菌剂的虾塘平均亩产400斤左右；
2、采用本发明菌剂对泥鳅养殖户的养殖废水进行处理。将0.5L 菌剂均匀泼洒到1亩泥鳅养殖塘中，每月施用两次，从泥鳅放苗到收获，水体中氨氮维持在1.8mg/L以下，亚硝酸盐维持在0.7mg/L以下，每亩收获7000斤。未施用本菌剂的塘平均亩产5000斤左右。
本发明的养殖水处理微生物菌剂主要含有以下几种菌：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis CCTCC AB 130006)、弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus CCTCC AB 206923)、屎肠球菌(Enterococcus faecium CICC 20680)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae ATCC9080)。该发明菌剂形式是微生物菌悬液，制备方法包括对各类菌种进行保藏、活化、扩大培养，获得处于最佳生长期的菌悬液，将各菌菌悬液按比例混合，采用糖蜜为基质进行混合发酵即可得到该菌剂。
本发明可有效降低养殖水中氨氮及亚硝酸盐含量。产品不含致病菌，不含重金属和有毒害化学物质，无毒无刺激性。实际应用不会对环境造成二次污染，不会额外造成负担，属于环境友好亲和型微生物菌剂产品。产品的储运和投放简便高效。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例，应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化，因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂，以单个纯菌株培养到对数末期的活菌数量比计，包括32%的枯草芽孢杆菌、32%的弯曲芽孢杆菌、28%的屎肠球菌、8%的酿酒酵母，枯草芽孢杆菌的菌种为Bacillus subtilis CCTCC AB 130006菌种、弯曲芽孢杆菌的菌种为Bacillus flexus CCTCC AB 206923菌种、屎肠球菌的菌种为Enterococcus faeciumCICC 20680菌种、酿酒酵母的菌种为Saccharomyces cerevisiae ATCC 9080菌种。
2.一种如权利要求1所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将枯草芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌、屎肠球菌、酿酒酵母分别接入到液体种子活化培养基进行活化，然后分别再以1-3%的接种量接入到扩增培养基进行一级培养，再分别将一级培养所得菌液以1-3%的接种量接入到另外的扩增培养基进行二级培养，二级培养所得各菌液按比例混合混匀制成初始微生物混合菌剂，将初始微生物混合菌剂接入含5%糖蜜的无机盐培养基中，微好氧发酵7天，得到微生物菌剂。
3.如权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的活化条件包括有温度35-38℃、时间10-14小时；弯曲芽孢杆菌的活化条件包括有温度35-38℃、时间10-14小时；屎肠球菌的活化条件包括有温度35-38℃、时间10-14小时；酿酒酵母的活化条件包括有温度28-32℃、时间22-24小时。
4.如权利要求3所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，用于活化所述枯草芽孢杆菌的培养基成分以质量百分比计，包括0.8-1.2%的蛋白胨、0.8-1.2%的氯化钠、0.4-0.6 %的酵母膏、0.5-1.5% 的氢氧化钠，培养基的pH值调到6.5-7.5，将培养基在115℃条件下灭菌20分钟后再用来活化枯草芽孢杆菌；用于活化所述弯曲芽孢杆菌的培养基成分以质量百分比计，包括0.8-1.2%的蛋白胨、0.8-1.2%的氯化钠、0.4-0.6 %的酵母膏、0.5-1.5% 的氢氧化钠，培养基的pH值调到6.5-7.5，将培养基在115℃条件下灭菌20分钟后再用来活化弯曲芽孢杆菌；活化所述屎肠球菌的培养基为MRS液体培养基，MRS液体培养基在120℃条件下灭菌15分钟后再进行屎肠球菌活化；活化所述酿酒酵母的培养基的成分以质量百分比计，包括0.8-1.2%的酵母膏、1.5-2.5 %的蛋白胨、1-3 %的蔗糖，将培养基在115℃条件下灭菌20分钟再用来活化酿酒酵母。
5.如权利要求4所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的一级培养包括温度为35-38℃、转速为50 rpm、时间为10-14小时，枯草芽孢杆菌的二级培养包括温度为35-38℃、转速为200 rpm、时间为9-11小时；所述弯曲芽孢杆菌的一级培养包括温度为35-38℃、转速为50 rpm、时间为10-14小时，弯曲芽孢杆菌的二级培养包括温度为35-38℃、转速为200 rpm、时间为9-11小时；所述屎肠球菌的一级培养包括温度为35-38℃、转速为50 rpm、时间为10-14小时，屎肠球菌的二级培养包括温度为28-35℃、转速为100 rpm、时间为9-11小时；所述酿酒酵母的一级培养包括温度为28-32℃、转速为50 rpm、时间为16-20小时，酿酒酵母的二级培养包括温度为28-32℃、转速为200 rpm、时间为14-16小时。
6.如权利要求5所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，用于枯草芽孢杆菌一级培养和二级培养使用的扩增培养基成分以质量百分比计，包括0.8-1.2%的蜜糖、0.4-0.6 %的酵母膏、0.8-1.2% 的氯化钠，扩增培养基的pH值调到6.5-7.5，将扩增培养基在115℃条件下灭菌20分钟后再分别用来枯草芽孢杆菌的一级培养和二级培养；用于弯曲芽孢杆菌一级培养和二级培养使用的扩增培养基的成分以质量百分比计，包括0.8-1.2%的蜜糖、0.4-0.6%的酵母膏、0.8-1.2% 的氯化钠，扩增培养基的pH值调到6.5-7.5，将扩增培养基在115℃条件下灭菌20分钟后再分别用来弯曲芽孢杆菌的一级培养和二级培养；用于屎肠球菌一级培养和二级培养使用的扩增培养基为MRS液体培养基，MRS液体培养基在120℃条件下灭菌15后再分别用来屎肠球菌的一级培养和二级培养；用于酿酒酵母一级培养和二级培养使用的扩增培养基的成分以质量百分比计，包括0.8-2.2%的蜜糖、0.8-1.2 %的酵母膏，将扩增培养基在115℃条件下灭菌20分钟后再分别用来酿酒酵母的一级培养和二级培养。
7.一种如权利要求1所述的微生物菌剂的使用方法，其特征在于，在每亩养殖水中添加500ml所述微生物菌剂，一个月添加两到三次。
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