CN108739393A - 一种延长葡萄组培苗保存时间的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用组织培养技术进行葡萄种质资源离体保存的方法，特别是一种延长葡萄组培苗保存时间的方法。本方法将葡萄组培苗接种于培养基中，在培养基表面加入无菌水覆盖葡萄组培苗，常规或者低温培养条件培养。本方法通过在培养基表面覆盖无菌水，抑制培养基水分蒸发，有效延长了葡萄组培苗的保存时间，确保葡萄组培苗中间不继代保存30个月，相比于矿物油，成本较低，大大提高了试管苗的成活率，并且使用、清洗更方便，值得大规模推广使用。

Description

一种延长葡萄组培苗保存时间的方法

技术领域

本发明涉及一种利用组织培养技术进行葡萄种质资源离体保存的方法，特别是一种延长葡萄组培苗保存时间的方法。

背景技术

在组织培养保存种质资源的过程中，由于培养基水分蒸发，营养消耗，每隔一段时间，要将培养物及时转移接种到新培养基中，进行继代培养。葡萄组培苗一般2个月继代一次，频繁继代培养要消耗大量的人力、物力和时间，随继代次数的增加，还会导致体细胞无性系变异几率增加，有可能使保存的原始种质丢失。通过改变培养物生长条件，调控葡萄组培苗的生长节奏，延缓其生长，可以有效减少继代次数，改良种质资源离体保存方法。有的果树树种可通过降低培养温度，延缓组培苗生长，延长继代间隔时间，但葡萄抗寒性较差，大部分品种不能长期适应10℃以下冷藏箱的条件。通过在培养基中添加PP₃₃₃等生长延缓剂或加入甘露醇提高培养基渗透压可在一定程度上抑制葡萄组培苗生长，但由于室温下培养，封口材料透气，培养基水分蒸发殆尽，葡萄组培苗只能延长约3个月的保存时间。

CN104969857A公开了一种利用矿物油覆盖延长葡萄组培苗保存时间的方法，利用矿物油覆盖葡萄组培苗，有效抑制了培养基水分蒸发，通过降低培养环境的氧气含量，延缓了葡萄组培苗生长，延长了保存时间。但是申请人经过一系列试验发现，利用矿物油覆盖延长葡萄组培苗保存时间的方法存在下列问题：

1、以每瓶加入80ml矿物油算，每保存一瓶葡萄试管苗，需要投入的矿物油成本约25.6元，成本较高不便于大范围推广应用；

2、若是将矿物油重复使用，则保存试管苗成活率大大降低，效果很差；

3、加矿物油保存种质时导致培养架面有油渍，不便卫生清洁，同时用过的三角瓶因有油，也不好清洗；

4、废弃的矿物油不易处理，随意丢弃存在生态污染风险。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种延长葡萄组培苗保存时间的方法，通过在培养基表面覆盖无菌水，抑制培养基水分蒸发，还可结合低温条件及添加生长延缓剂处理，有效延长了葡萄组培苗的保存时间，确保葡萄组培苗中间不继代保存16～30个月，为有效利用组织培养技术进行葡萄种质资源的离体保存提供技术支撑；另外，本发明相比于矿物油，成本较低，试管苗的成活率大大提高，并且使用、清洗更方便，更加卫生、清洁、环保，值得大规模推广使用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：

一种延长葡萄组培苗保存时间的方法，将葡萄组培苗接种于培养基中，在培养基表面加入无菌水覆盖葡萄组培苗，常规或低温培养条件培养，具体包括以下步骤：

S1，制备培养基；

S2，将葡萄组培苗接入培养基中：将葡萄组培苗嫩梢切分成1.5～2.5cm、不带叶片的双芽茎段，接入培养基中；

S3，培养基表面加入无菌水覆盖葡萄组培苗：接种后即在培养基表面加入无菌水，无菌水高出培养基表面1～2cm，用双层封口膜封口；

S4，常规培养或者低温培养：常规培养条件为温度(25±3)℃，光照强度2000lx左右，光照时间10～14h/d；低温培养条件为葡萄组培苗接种后先常规培养4～6周，后置于11～15℃培养箱培养保存；

S5，恢复生长。

本领域的技术人员均知晓，在进行葡萄组培苗接种时都要保留叶片，以利于形态建成、光合作用，本申请采用与上述公知常识形成的惯性思维完全不同的技术手段：将葡萄组培苗嫩梢去掉叶片，通过留1.5～2.5cm长的双芽茎段，使腋芽在无菌水中萌发缓慢、节间缩短，叶片明显减小，生根晚，根细且短小，无侧根，延缓了葡萄组培苗生长，由于采用的一系列抑制生长措施，抑制了萌芽，双芽茎段可以提高萌芽率，有利于葡萄组培苗存活，为葡萄组培苗保存16～30个月提供了有力的支持。本发明将覆盖矿物油的方案改为覆盖无菌水，无菌水能够阻止培养基水分蒸发，因为培养基表面覆盖无菌水后，首先蒸发的是培养基上面的无菌水，无菌水越来越少，但是却抑制了培养基中的水分蒸发；无菌水还能降低培养物环境的氧分压，延缓生长。由于试管苗的保存时间较长，双层膜密封的更严，利于抑制水分蒸发以及控制污染。本方法可以有效延长继代间隔时间，减少继代次数。常规组培繁殖由于培养物不断增殖生长，消耗培养基中的养分和水分，同时培养基中的水分也会蒸发而逐渐干涸，这时不更换新的培养基进行继代转接，试管苗无法继续存活，如果中间不继代最多只能保存4～5个月。而本发明中的技术方案一是通过低温抑制了葡萄试管苗生长，二是培养基覆盖无菌水可以有效抑制培养基水分蒸发，从而保证16～30个月以上中间不用转接继代，即延长继代间隔时间，降低继代次数。与矿物油相比，无菌水的成本极低，并且使用、清洗更方便，更加卫生、清洁，值得大规模推广使用。

其中，葡萄组培苗接种并覆盖无菌水后，在常规培养条件下培养4～6周后置于11～15℃培养箱保存，葡萄抗寒性较差，大部分品种不能长期适应10℃以下冷藏箱的条件，11～15℃的培养温度是发明人经过一系列的试验研究筛选出来的，是绝大多数葡萄品种可适应的温度。

前述的延长葡萄组培苗保存时间的方法中，所述S1制备的培养基可以为：B5+IAA0.5mg/L+食用白砂糖25.0g/L+琼脂6.5g/L。培养基中采用食用白砂糖，相对于蔗糖而言，可以降低成本。因为白砂糖的主要成分为蔗糖，能够起到和蔗糖一样的作用，与蔗糖相比成本低很多，进一步降低了葡萄组培的投入成本。培养基中的琼脂起凝胶作用，将琼脂的浓度由6.0g/L调整为6.5g/L，能够提高培养基的硬度，从而可减缓植物从培养基中吸收养分的速度，一定程度有抑制延缓生长的作用。

前述的延长葡萄组培苗保存时间的方法中，所述S1制备的培养基也可以为：B5+IAA0.5mg/L+烯效唑0.5～1.0mg/L+食用白砂糖25.0g/L+琼脂6.5g/L。本发明制备了添加生长延缓剂(烯效唑)的培养基，烯效唑是一种植物生长延缓剂，主要的效果是延缓试管苗生长，使植株矮小、粗壮。采用“无菌水+烯效唑”的组合方式，既能延缓葡萄试管苗生长，减少营养消耗，又能抑制培养基水分蒸发，所以能有效延长保存时间。其中烯效唑的用量配比等也是发明人经过一系列的试验研究筛选出来的，因为烯效唑的用量过低效果不佳，若是浓度过高又会导致植物有轻微的玻璃化现象发生。

前述的延长葡萄组培苗保存时间的方法中，所述S1制备的培养基还可以为：B5+IAA0.5mg/L+缩节胺250～400mg/L+食用白砂糖25.0g/L+琼脂6.5g/L。本发明制备了添加缩节胺的培养基，缩节胺在本方案中起到的效果是延缓试管苗生长，使植株矮化，叶片变小。采用“无菌水+缩节胺”的组合方式，既能延缓葡萄试管苗生长，减少营养消耗，又能抑制培养基水分蒸发，所以能有效延长保存时间。现有技术中有将缩节胺应用于马铃薯，主要目的是壮苗以及诱导试管薯等。将缩节胺添加到培养基中用于延长葡萄组培苗的保存时间，是发明人经过试验摸索之后得出的方案，其中缩节胺的用量配比等也是发明人经过一系列的试验研究筛选出来的，因为缩节胺的用量过低导致效果不佳，若是浓度过高又会导致植物茎、叶畸形。

前述的延长葡萄组培苗保存时间的方法，所述S3培养基表面加入无菌水覆盖葡萄组培苗，具体包括以下步骤：

S31，开始在培养基表面加入无菌水，无菌水液面高出培养基表面1～2cm，用双层封口膜封口；

S32，当培养基表面的无菌水快蒸发完时，补加无菌水至其液面再次高出培养基表面1～2cm，用双层封口膜封口。

该种添加无菌水的方式为不一次加够，这样试管苗不用全部泡在水里，等到培养基表面的无菌水快蒸发完时，再续加，这样试管苗生长状态好，成活率为100％。

前述的延长葡萄组培苗保存时间的方法，所述S5恢复生长，具体操作步骤如下：当无菌水覆盖保存的葡萄组培苗需要恢复生长时，将无菌水在超净工作台中倒出，葡萄组培苗即可恢复生长。

前述的延长葡萄组培苗保存时间的方法，所述S3培养基表面加入无菌水覆盖葡萄组培苗，具体为：将葡萄组培苗接入培养基后，立即覆盖高出培养基表面的无菌水。本领域的技术人员均知晓，大多数植物组培苗需要在透气好的环境中生长保存，本申请则采用与上述公知常识形成的惯性思维完全不同的技术手段，葡萄组培苗接种后，立即覆盖高出培养基表面的无菌水，通过立即覆盖无菌水，可避免接种后先培养一段时间，待腋芽萌发生长后再覆盖无菌水，造成葡萄组培苗很快枯尖、死亡，达到了将葡萄组培苗保存16～30个月的技术效果。

与现有技术相比，本发明的有益之处在于：

1、本发明通过在培养基表面覆盖无菌水结合低温处理，延缓葡萄组培苗生长，抑制培养基水分蒸发，也降低了培养环境的氧气含量，有效延长了葡萄组培苗的保存时间，确保葡萄组培苗中间不继代保存30个月，降低了变异几率，为有效利用组织培养技术进行葡萄种质资源的离体保存提供技术支撑；

2、另外本发明相比于矿物油，成本较低，大大提高了试管苗的成活率，并且使用、清洗更方便，更加卫生、清洁，值得大规模推广使用；

3、通过在培养基中增加一定比例的生长延缓剂，比如烯效唑或缩节胺，使植株矮小、粗壮，能延缓试管苗生长，有效延长了葡萄组培苗室温下的保存时间；其中烯效唑或缩节胺的用量配比等也是发明人经过一系列地试验研究筛选出来的，因为用量过低效果不佳，若是浓度过高又会导致植物有轻微的玻璃化现象或茎、叶畸形；

4、培养基中采用食用白砂糖，相对于蔗糖而言，可以降低成本，因为白砂糖的主要成分为蔗糖，能够起到和蔗糖一样的作用，与蔗糖相比成本低很多，进一步降低了葡萄组培苗的投入成本；

5、培养基中的琼脂起凝胶作用，将琼脂的浓度由6.0g/L调整为6.5g/L，能够提高培养基的硬度，从而可减缓植物从培养基中吸收养分的速度，一定程度有抑制延缓生长的作用；

6、该种添加无菌水的方式为不一次加够，这样试管苗不用全部泡在水里，等到培养基表面的无菌水快蒸发完时，再续加，这样试管苗生长状态好，成活率为100％；

7、该技术可应用于巨玫瑰、莫丽莎、巨峰、夏黑、皇家秋天、克瑞森无核、赤霞珠、红斯威特等葡萄品种组培苗，具有适应品种广、保存时间长、成本低、操作简便、易恢复生长等优点，是目前葡萄种质离体保存的好方法。

附图说明

图1是接种后覆盖无菌水的葡萄组培苗；

图2是低温保存了16个月的“巨峰”葡萄组培苗；

图3是“无菌水+低温”保存的“红斯威特”葡萄组培苗；

图4是“矿物油”保存的“红斯威特”葡萄组培苗；

图5是“无菌水+烯效唑”保存的“巨峰”葡萄组培苗；

图6是“无菌水+缩节胺”保存的“赤霞珠”葡萄组培苗。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明。

具体实施方式

本发明的实施例1：如图1所示，一种延长葡萄组培苗保存时间的方法，将葡萄组培苗接种于培养基中，在培养基表面加入无菌水覆盖葡萄组培苗，常规培养条件下培养4～6周后，置于11～15℃培养箱中培养保存，具体包括以下步骤：

S1，制备培养基：B5+IAA0.5mg/L+食用白砂糖25.0g/L+琼脂6.5g/L，培养基的分装量比常规分装量多1/3，该种方式使得营养充足，培养基蒸发消耗慢，有利于延长保存时间；

S2，将葡萄组培苗接入培养基中：将葡萄组培苗嫩梢去掉叶片，切分成1.5～2.5cm的双芽茎段，接入培养基中；双芽茎段与单芽茎段相比，双芽成活机率更高，可选择的芽也多，能够提高采取抑制生长措施后的葡萄组培苗的萌芽率，利于长时间保存；另外，去掉叶片的株高增长量低一些，更能延长保存时间，详见表1。

表1接种方式对“赤霞珠”葡萄组培苗生长的影响(接种后60d调查)

注：表中同列数值后标记不同字母表示差异达0.05显著水平，相同字母表示差异不显著。

S3，培养基表面加入无菌水覆盖葡萄组培苗：在培养基表面加入无菌水，无菌水液面高出培养基表面1～2cm，用双层封口膜封口；覆盖无菌水可有效抑制培养基水分蒸发，延长保存时间。图2为低温下没有无菌水覆盖的葡萄组培苗，16个月时培养基已干涸，葡萄组培苗已经死亡。

S4，低温培养：常规培养4～6周后，置于11～15℃低温培养箱中培养，其中常规培养条件为温度(25±3)℃，光照强度2000lx左右，光照时间10～14h/d；

低温培养前需在常规培养条件下进行一定时间的缓苗处理，适宜的4～6周时间是发明人经过一系列地试验研究筛选出来的，不进行常规缓苗处理或缓苗时间过短，葡萄组培苗萌芽率很低，影响以后存活，缓苗时间过长(超过6周)，室温下无菌水蒸发较快，葡萄组培苗开始生长，抑制效果受影响；

S5，恢复生长：葡萄组培苗长出水面或将无菌水在超净工作台中倒出，常规培养条件下，即可恢复生长。

进一步的，本实施例中的培养容器采用100ml三角瓶，培养基分装量为60ml/瓶，无菌水液面高出培养基表面1～2cm，100ml三角瓶约需20～40ml无菌水，用双层封口膜封口；

CN104969857A“一种利用矿物油覆盖延长葡萄组培苗保存时间的方法”中的技术方案中的培养容器也采用100ml三角瓶，培养基分装量40ml/瓶，矿物油液面高出培养基表面5～6cm，100ml三角瓶约需80ml矿物油，封口膜封口。

如表2、表3以及图2-图4所示，图2为低温11℃保存了16个月的“巨峰”葡萄组培苗；图3为“无菌水+低温11℃”保存的“红斯威特”葡萄组培苗，其中a图为保存10个月的状态，b图为保存26个月的状态，c图为保存30个月的状态；图4为“矿物油”保存的“红斯威特”葡萄组培苗，其中d图为保存6个月的状态，e图为保存15个月的状态，f图为保存18个月的状态(此时已经全部死亡)。本实施例采用的技术方案与CN104969857A“一种利用矿物油覆盖延长葡萄组培苗保存时间的方法”中的技术方案对比如下：

表2“无菌水+低温”技术方案与“矿物油”技术方案的对比

表3“无菌水+低温”与“矿物油”保存效果的对比

实施例2：如图5所示，一种延长葡萄组培苗保存时间的方法，将葡萄组培苗接种于培养基中，在培养基表面加入无菌水覆盖葡萄组培苗，常规培养条件培养，具体包括以下步骤：

S1，制备培养基：B5+IAA0.5mg/L+烯效唑0.5～1.0mg/L+食用白砂糖25.0g/L+琼脂6.5g/L；

S2，将葡萄组培苗接入培养基中：将葡萄组培苗嫩梢去掉叶片，切分成1.5cm～2.5cm的双芽茎段，接入培养基中；

S3，培养基表面加入无菌水覆盖葡萄组培苗：在培养基表面加入无菌水，无菌水液面高出培养基表面1～2cm，用双层封口膜封口；

S4，常规培养：温度(25±3)℃，光照强度2000lx左右，光照时间10～14h/d；

S5，恢复生长时，将葡萄组培苗转接到培养基中常规培养，即可恢复正常生长。

本发明制备了添加生长延缓剂(烯效唑)的培养基，烯效唑是一种植物生长延缓剂，主要的效果是使植株矮小、粗壮，能延缓试管苗生长。采用“无菌水+烯效唑”的组合方式，既能延缓葡萄试管苗生长，减少营养消耗，又能抑制培养基水分蒸发，所以能有效延长保存时间。其中烯效唑的用量配比等也是发明人经过一系列地试验研究筛选出来的，因为烯效唑的用量过低效果不佳，若是浓度过高又会导致植物有轻微的玻璃化现象发生，且抑制作用太强，植株长时间不能长出水面，不利于长期保存。以“巨峰”葡萄组培苗为例，具体请看图5和下表4中相关数据。图5为“无菌水+烯效唑”保存的‘巨峰’葡萄组培苗，其中g图为接种后覆盖无菌水的状态，h图为保存8个月的状态，i图为保存18个月的状态。

表4不同浓度的烯效唑对“巨峰”葡萄组培苗生长情况的影响(150d)

烯效唑/mg/L	存活率/％	株高/cm	生根率/％
				0.0	0.0c
0.5	100.0a	4.2a	100.0a
				1.0	97.6a	2.9b	100.0a
2.0	66.4b	1.2c	100.0a
				4.0	0.0c

注：表中同列数值后标记不同字母表示差异达0.05显著水平，相同字母表示差异不显著。

进一步的，本实施例中的培养容器采用100ml三角瓶，培养基分装量为60ml/瓶，无菌水液面高出培养基表面1～2cm，100ml三角瓶约需20～40ml无菌水，用双层封口膜封口；

CN104969857A“一种利用矿物油覆盖延长葡萄组培苗保存时间的方法”中的技术方案中的培养容器也采用100ml三角瓶，矿物油液面高出培养基表面5～6cm，100ml三角瓶约需80ml矿物油，用封口膜封口。

如表5所示，本实施例采用的技术方案与CN104969857A“一种利用矿物油覆盖延长葡萄组培苗保存时间的方法”中的技术方案对比如下：

表5“无菌水+烯效唑”技术方案与“矿物油”技术方案的对比

实施例3：图6为“无菌水+缩节胺”保存的‘赤霞珠’葡萄组培苗，其中j图为保存6个月的状态，k图为保存18个月的状态，如图6所示，一种延长葡萄组培苗保存时间的方法，将葡萄组培苗接种于培养基中，在培养基表面加入无菌水覆盖葡萄组培苗，常规培养条件培养，具体包括以下步骤：

S1，制备培养基：B5+IAA0.5mg/L+缩节胺250～400mg/L+食用白砂糖25.0g/L+琼脂6.5g/L；

S2，将葡萄组培苗接入培养基中：将葡萄组培苗嫩梢去掉叶片，切分成1.5cm～2.5cm的双芽茎段，接入培养基中；

S3，培养基表面加入无菌水覆盖葡萄组培苗：在培养基表面加入无菌水，无菌水液面高出培养基表面1～2cm，用双层封口膜封口；

S4，常规培养：温度(25±3)℃，光照强度2000lx左右，光照时间10～14h/d；

S5，恢复生长时，将葡萄组培苗转接到培养基中常规培养，即可恢复正常生长。

进一步的，本实施例中的培养容器采用100ml三角瓶，无菌水液面高出培养基表面1～2cm，100ml三角瓶约需20～40ml无菌水，用双层封口膜封口；

CN104969857A“一种利用矿物油覆盖延长葡萄组培苗保存时间的方法”中的技术方案中的培养容器也采用100ml三角瓶，矿物油液面高出培养基表面5～6cm，100ml三角瓶约需80ml矿物油，用封口膜封口。

如表6所示，本实施例采用的技术方案与CN104969857A“一种利用矿物油覆盖延长葡萄组培苗保存时间的方法”中的技术方案对比如下：

表6“无菌水+缩节胺”技术方案与“矿物油”技术方案的对比

实施例4：一种延长葡萄组培苗保存时间的方法，将葡萄组培苗接种于培养基中，在培养基表面加入无菌水覆盖葡萄组培苗，常规条件培养，具体包括以下步骤：

S1，制备培养基为：B5+IAA0.5mg/L+食用白砂糖25.0g/L+琼脂6.5g/L；

S2，将葡萄组培苗接入培养基中：将葡萄组培苗嫩梢切分成1.5cm～2.5cm、不带叶片的双芽茎段，接入培养基中；

S3，培养基表面加入无菌水覆盖葡萄组培苗：接种后即在培养基表面加入无菌水，无菌水高出培养基表面1～2cm，用双层封口膜封口；

所述S3培养基表面加入无菌水覆盖葡萄组培苗，具体包括以下步骤：

S31，在培养基表面加入无菌水，无菌水液面高出培养基表面1～2cm，用双层封口膜封口；

S32，当培养基表面的无菌水快蒸发完时，补加无菌水至其液面再次高出培养基表面1～2cm，用双层封口膜封口；

S4，常规培养：常规培养条件为温度(25±3)℃，光照强度2000lx左右，光照时间10～14h/d；

S5，恢复生长，具体操作步骤如下：当无菌水覆盖保存的葡萄组培苗需要恢复生长时，将无菌水在超净工作台中倒出葡萄组培苗即可恢复正常生长。

实施例5：一种延长葡萄组培苗保存时间的方法，将葡萄组培苗接种于培养基中，在培养基表面加入无菌水覆盖葡萄组培苗，常规培养条件培养，具体包括以下步骤：

S1，制备培养基；

具体的，所述S1制备的培养基可以为：B5+IAA0.5mg/L+食用白砂糖25.0g/L+琼脂6.5g/L；所述S1制备的培养基可以为：B5+IAA0.5mg/L+烯效唑0.5～1.0mg/L+食用白砂糖25.0g/L+琼脂6.5g/L；所述S1制备的培养基还可以为：B5+IAA0.5mg/L+缩节胺250～400mg/L+食用白砂糖25.0g/L+琼脂6.5g/L；

S2，将葡萄组培苗接入培养基中：将葡萄组培苗嫩梢去掉叶片，切分成1.5cm～2.5cm的双芽茎段，接入培养基中；

S3，培养基表面加入无菌水覆盖葡萄组培苗：在培养基表面加入无菌水，无菌水液面高出培养基表面1～2cm，用双层封口膜封口；

进一步的，所述S3培养基表面加入无菌水覆盖葡萄组培苗，具体包括以下步骤：

S31，开始在培养基表面加入无菌水，无菌水液面高出培养基表面1～2cm，用双层封口膜封口；

S32，当培养基表面的无菌水快蒸发完时，补加无菌水至其液面高出培养基表面1～2cm，用双层封口膜封口。

更进一步的，所述S3培养基表面加入无菌水覆盖葡萄组培苗，具体为：将葡萄组培苗接入培养基后，立即覆盖高出培养基表面的无菌水。

S4，常规培养：温度(25±3)℃，光照强度2000lx左右，光照时间10～14h/d；

S5，恢复生长。

通过培养基中加入生长延缓剂，有效延缓了葡萄组培苗生长和营养消耗，通过培养基表面覆盖无菌水，减少了培养基水分蒸发，降低了培养环境的氧气含量，有效延缓了葡萄组培苗生长，成功延长了葡萄组培苗的保存时间。经试验验证，具体实施过程要注意以下问题：(1)葡萄组培苗接种时最好去掉嫩梢叶片，只留约2.0cm长的双芽茎段，腋芽在水中萌发缓慢，节间缩短，叶片明显减小，生根晚，根细且短小，无侧根，延缓生长效果好。(2)接种后应立即覆盖无菌水，如果接种后先培养一段时间，待腋芽萌发生长后再覆盖无菌水，容易造成葡萄组培苗很快枯尖、死亡，保存时间短。(3)覆盖无菌水可以一次加够量，一般高出培养基表面1～2cm至三角瓶瓶颈即可；无菌水还可以分次加入，这样试管苗不用全部泡在水里，等到培养基表面的无菌水快蒸发完时，再续加，这样试管苗生长状态好，成活率为100％。若是采用100ml三角瓶则约需20～40ml无菌水，用双层封口膜封口，用双层封口膜封口水量减少较慢，且不易污染。

Claims (7)

1.一种延长葡萄组培苗保存时间的方法，其特征在于，将葡萄组培苗接种于培养基中，在培养基表面加入无菌水覆盖葡萄组培苗，常规或低温培养条件培养，具体包括以下步骤：

S1，制备培养基；

S2，将葡萄组培苗接入培养基中：将葡萄组培苗嫩梢切分成1.5cm～2.5cm、不带叶片的双芽茎段，接入培养基中；

S3，培养基表面加入无菌水覆盖葡萄组培苗：接种后即在培养基表面加入无菌水，无菌水高出培养基表面1～2cm，用双层封口膜封口；

S4，常规培养或者低温培养：常规培养条件为温度(25±3)℃，光照强度2000lx左右，光照时间10～14h/d；低温培养条件为葡萄组培苗接种后先常规培养条件下培养4～6周，后置于11～15℃培养箱培养；

S5，恢复生长。

2.根据权利要求1所述的延长葡萄组培苗保存时间的方法，其特征在于，所述S1制备的培养基为：B5+IAA0.5mg/L+食用白砂糖25.0g/L+琼脂6.5g/L。

3.根据权利要求1所述的延长葡萄组培苗保存时间的方法，其特征在于，所述S1制备的培养基为：B5+IAA0.5mg/L+烯效唑0.5～1.0mg/L+食用白砂糖25.0g/L+琼脂6.5g/L。

4.根据权利要求1所述的延长葡萄组培苗保存时间的方法，其特征在于，所述S1制备的培养基为：B5+IAA0.5mg/L+缩节胺250～400mg/L+食用白砂糖25.0g/L+琼脂6.5g/L。

5.根据权利要求1所述的延长葡萄组培苗保存时间的方法，其特征在于，所述S3培养基表面加入无菌水覆盖葡萄组培苗，具体包括以下步骤：

S31，在培养基表面加入无菌水，无菌水液面高出培养基表面1～2cm，用双层封口膜封口；

S32，当培养基表面的无菌水快蒸发完时，补加无菌水至其液面再次高出培养基表面1～2cm，用双层封口膜封口。

6.根据权利要求1所述的延长葡萄组培苗保存时间的方法，其特征在于，所述S5恢复生长，具体操作步骤如下：当无菌水覆盖保存的葡萄组培苗需要恢复生长时，将无菌水在超净工作台中倒出，葡萄组培苗即可恢复正常生长。

7.根据权利要求1所述的延长葡萄组培苗保存时间的方法，其特征在于，所述S3培养基表面加入无菌水覆盖葡萄组培苗，具体为：将葡萄组培苗接入培养基后，立即覆盖高出培养基表面的无菌水。