CN104770305A - 一种罗汉果种质资源离体保存的方法及保存后恢复生长的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种罗汉果种质资源离体保存的方法及保存后恢复生长的方法。本发明提供的离体保存方法中采用特殊配方组成的种质保存培养基，使罗汉果试管苗的继代周期由2个月延长为12～24个月，且存活率高达85％以上，实现了罗汉果种质资源在常温条件下的长时间离体保存。经保存的材料采用本发明所述的恢复生长方法可快速恢复生长，并能进行大量繁殖，大量繁殖所获得的试管苗与未经保存过的试管苗相比，其形态特征和长势无明显差异，农艺性状稳定；此外，本发明的离体保存方法中微型块茎的形成、膨大与离体保存均在同一培养基中进行，不需要转接，不仅使得操作更简便，而且成本也更低，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术，具体涉及一种罗汉果种质资源离体保存的方法及保存后恢复生长的方法。
背景技术
罗汉果(Siratia grosvenorii(Swingle)C.Jeffrey)属葫芦科(Cucurbitaceae)罗汉果属植物，为多年生草质藤本植物，雌雄异株，冬季茎蔓枯死，以块茎过冬。罗汉果的果实是我国的传统中药，具有清热解毒、止咳润肺等功效。罗汉果果实中含有甜度极高的葫芦烷三萜类物质(罗汉果甜甙)，其中罗汉果甜甙Ⅴ的甜度约为蔗糖的300倍，是果实中主要的甜味成分，无毒，不含热量，可作为食品、饮料的甜味剂，也是糖尿病人理想的食糖代用品。
近十年来，罗汉果育种工作者利用组织培养技术建立起了高效的无性快繁体系，为广大种植户提供大量优质脱毒种苗，给罗汉果产业带来了新的生机。现有罗汉果试管苗抗病能力较弱，容易感染花叶病毒和根结线虫等，冬季采收块茎留种会导致次年产量和品质下降。而在组培过程中，需要对罗汉果试管苗进行频繁的继代培养(40～60d继代一次)才能保持其正常生长。试管苗的培养时间过长和继代次数过多，则容易发生遗传变异，如再作为次年大量生产的原种，必将影响果实的产量和品质。因此，为了保证种苗的优良品性，育种工作者需要在每年取材，重新建立离体快繁体系，这样则需要浪费较多的时间、人力和物力。
种质资源离体保存包括常温限制生长保存、低温保存和超低温保存三种方法，具有建立种质圃、种质库、田间种植保存等方法不可比拟的优势，既可节省空间、人力、物力和土地，又可避免自然灾害引起的种质丢失，在需要时可以用离体培养方法很快大量繁殖。刘华英等(罗汉果试管苗茎尖玻璃化法超低温保存及植株再生，中草药，第40卷第2期，2009年2月)曾报道了罗汉果种质资源的超低温保存方法，但该方法的实施需要特殊的保存设备，而且操作过程复杂，难以推广应用。至今，尚未见有在常温条件下罗汉果种质资源离体保存的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种罗汉果种质资源离体保存的方法及保存后恢复生长的方法。该保存方法实现了罗汉果种质资源在常温条件下的离体保存，保存的时间可达12～24个月，离体保存后的材料可快速恢复生长，并进行大量繁殖。
本发明所述的罗汉果种质资源离体保存的方法，包括获得脱毒试管苗的步骤和微型块茎的形成、膨大与离体保存步骤，所述的微型块茎的形成、膨大与离体保存步骤是将获得的脱毒试管苗继代培养20～40天后，切除叶片和顶芽，所得枝条分切成带1～3个节的茎段；所得茎段转接入种质保存培养基中培养60～90天，即有微型块茎形成，所形成的微型块茎继续在种质保存培养基中膨大和保存；其中：
所述的种质保存培养基配方为：(1/4～1)MS+6-BA0.01～3.0mg/L+NAA0.01～0.1mg/L+琼脂5～10g/L+蔗糖30～90g/L+多效唑0.1～3.0mg/L或矮壮素100～1000mg/L。
上述离体保存方法中，所述获得脱毒试管苗的步骤与现有常规技术相同。
上述离体保存方法中，所述的种质保存培养基配方优选为：(1/4～1)MS+6-BA0.1～0.5mg/L+NAA0.02～0.05mg/L+琼脂6～8g/L+蔗糖45～75g/L+多效唑0.5～2mg/L或矮壮素300～700mg/L。最佳的选择为：1/2MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+琼脂7g/L+蔗糖60g/L+多效唑1mg/L或矮壮素500mg/L。所述种质保存培养基的pH值为5.5～7.0，优选为5.8～6.0。
上述离体保存方法中，所述茎段转接入种质保存培养基中培养的条件，以及微型块茎继续在种质保存培养基中膨大和保存的培养条件相同。在本申请中，优选是将茎段转接入种质保存培养基中培养的条件，以及微型块茎继续在种质保存培养基中膨大和保存的培养条件均设置为：温度为20～35℃，光照时间为8～14h/d，光照强度为1500～3000lx；更优选设置为：温度为22～27℃，光照时间为10～12h/d，光照强度为1500～2500lx。
上述离体保存方法中，在将茎段转接入种质保存培养基中按上述条件培养60～90天时，即每个茎段上至少有1～2个微型块茎形成，所形成的各微型块茎的直径通常在2.0～5.0mm范围内。
本发明还包括采用上述罗汉果种质资源离体保存后恢复生长的方法，具体包括：取出离体保存后的材料，切取微型块茎转入恢复生长培养基中培养30～40天，获得恢复生长的芽苗；所得芽苗按常规方法进行增殖培养和生根培养，即可获得完整小植株；其中：
所述的恢复生长培养基配方为：MS+6-BA0.01～2.0mg/L或KT0.01～2.0mg/L+NAA0.01～0.2mg/L或IBA0.01～0.2mg/L+蔗糖20～50g/L+琼脂0或5～10g/L。
上述恢复生长的方法中，如果是想将恢复生长的芽苗进行大量的繁殖以进行炼苗、移栽，则只要将芽苗分切成带1～3个节的茎段或茎尖按现有常规方法进行增殖培养，然后再进行生根培养，即可获得可供移栽的完整小植株。
上述恢复生长的方法中，所述恢复生长培养基配方优选为：MS+6-BA0.1～1.0mg/L或KT0.1～1.0mg/L+NAA0.01～0.1mg/L或IBA0.01～0.1mg/L+蔗糖30～40g/L+琼脂0或5～10g/L。最佳的选择为：MS+6-BA0.5mg/L或KT0.5mg/L+NAA0.05mg/L或IBA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂0或7g/L。所述恢复生长培养基的pH值5.5～7.0，优选为5.8～6.0。
上述恢复生长的方法中，所述微型块茎在恢复生长培养基中的培养条件与现有技术相同，在本申请中，优选将培养条件设置为：温度为20～35℃，光照时间为8～14h/d，光照强度为1500～3000lx。更优选设置为：温度为22～27℃，光照时间为10～12h/d，光照强度为1500～2500lx。
本发明所述的离体保存方法和恢复生长方法中，所涉及到的增殖培养和生根培养所用到的培养基与培养条件均与现有技术相同，本申请中，增殖培养所用的培养基优选采用MS+6-BA0.3～0.5mg/L+NAA0.01～0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH值为5.8～6.0；生根培养所用的培养基优选采用1/2MS+IBA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+活性炭1g/L+琼脂0或7g/L，pH值为5.8～6.0。
进一步地，本发明还提供一种罗汉果种质资源离体保存及保存后恢复生长的方法，包括离体保存步骤和保存后恢复生长步骤，其中：
所述离体保存步骤包括获得脱毒试管苗的步骤和微型块茎的形成、膨大与离体保存步骤，所述的微型块茎的形成、膨大与离体保存步骤是将获得的脱毒试管苗继代培养20～40天后，切除叶片和顶芽，所得枝条分切成带1～3个节的茎段；所得茎段转接入种质保存培养基中培养60～90天，即有微型块茎形成，所形成的微型块茎继续在种质保存培养基中膨大和保存；其中：所述的种质保存培养基配方为：(1/4～1)MS+6-BA0.01～3.0mg/L+NAA0.01～0.1mg/L+琼脂5～10g/L+蔗糖30～90g/L+多效唑0.1～3.0mg/L或矮壮素100～1000mg/L；
所述保存后恢复生长步骤为：取出离体保存后的材料，切取微型块茎转入恢复生长培养基中培养30～40天，获得恢复生长的芽苗；所得芽苗按常规方法进行增殖培养和生根培养，获得完整小植株；其中：所述的恢复生长培养基配方为：MS+6-BA0.01～2.0mg/L或KT0.01～2.0mg/L+NAA0.01～0.2mg/L或IBA0.01～0.2mg/L+蔗糖20～50g/L+琼脂0或5～10g/L。
上述离体保存及保存后恢复生长的方法中，各参数的优选选择与前述相同。
与现有技术相比，本发明提供了一种新的罗汉果种质资源离体保存的方法及保存后恢复生长的方法，以及种质资源离体保存及保存后恢复生长的方法，其中的离体保存方法中采用特殊配方组成的种质保存培养基，使罗汉果试管苗的继代周期由2个月延长为12～24个月，且存活率高达85％以上，实现了罗汉果种质资源在常温条件下的长时间离体保存。经保存的材料采用本发明所述的恢复生长方法可快速恢复生长，并能进行大量繁殖，大量繁殖所获得的试管苗与未经保存过的试管苗相比，其形态特征和长势无明显差异，农艺性状稳定；此外，本发明的离体保存方法中微型块茎的形成、膨大与离体保存均在同一培养基中进行，不需要转接，不仅使得操作更简便，而且成本也更低，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为按本发明实施例1所述方法进行保存，在种质保存培养基中保存4个月的试管苗(已有较大的微型块茎)；
图2为按本发明实施例1所述方法进行保存，在种质保存培养基中保存12个月的试管苗(部分叶片枯萎，微型块茎存活)；
图3按本发明实施例1所述方法进行保存，在种质保存培养基中保存18个月的试管苗(叶片全部枯萎，微型块茎存活)；
图4按本发明实施例2所述方法进行恢复生长后所得的芽苗；
图5按实施例2所述方法进行恢复生长并进行繁殖，经炼苗移栽后栽培于试验田中的雄株开花；
图6按实施例2所述方法进行恢复生长并进行繁殖，经炼苗移栽后栽培于试验田中的雌株开花；
图7按实施例2所述方法进行恢复生长并进行繁殖，经炼苗移栽后栽培于试验田中的雌株挂果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述,以更好地理解本发明的内容,但本发明并不限于以下实施例。
实施例1
1)获得脱毒试管苗：按常规方法获得罗汉果脱毒试管苗；
2)微型块茎的形成、膨大与离体保存：将获得的脱毒试管苗继代培养30天后，切除叶片和顶芽，所得枝条分切成带1个或2个节的茎段；所得茎段转接入种质保存培养基中培养90天，每个茎段上即有1～2个直径为2.5～5.0mm微型块茎形成，所形成的微型块茎继续在种质保存培养基中膨大和保存；其中：
所述继代培养用的培养基配方为：MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.01mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8；
所述继代培养的条件为：温度为25℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000lx；
所述的种质保存培养基配方为：1/2MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+多效唑1.0mg/L+蔗糖60g/L+琼脂7g/L，pH5.8；
所述茎段转接入种质保存培养基中培养的条件，以及微型块茎继续在种质保存培养基中膨大和保存的条件均为：温度为25℃，光照时间10h/d，光照强度1500lx。
在上述培养条件下保存18个月后，按照保存后茎段存活数/接种茎段总数×100％来计算存活率(下同)，存活率为96.4％。其中微型块茎上述培养条件下保存4个月、12个月和18个月的图片分别如图1、2和3所示。
实施例2
取出经实施例1离体保存18个月后的材料，切取微型块茎转入恢复生长培养基中培养30天，获得恢复生长的芽苗；所得芽苗将芽苗分切成带1～3个节的茎段或茎尖按常规方法进行增殖培养和生根培养，即可获得完整小植株；其中：
所述恢复生长培养基的配方为：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，pH6.0；
所述微型块茎恢复生长的培养条件为：温度25℃，光照时间8h/d，光照强度3000Lx；
所述增殖培养的培养基配方为：MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.01mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.9；
所述增殖培养的条件为：温度为27℃，光照时间为10h/d，光照强度为2000lx；
所述生根培养的培养基配方为：1/2MS+IBA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+活性炭1g/L，pH值为5.8；
所述生根培养的条件为：温度为23℃，光照时间为10h/d，光照强度为3000lx。
按照分化芽苗的块茎数/接种块茎总数×100％来计算恢复率，恢复率为100％。
实施例3
重复实施例1的方法，只是进行如下修改：
1、将种质保存培养基配方修改为：1/4MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L+多效唑3.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8；
2、将脱毒试管苗继代培养的时间修改为40天，将培养条件修改为：温度：昼/夜30(±2)℃/17(±2)℃；光照时间：14h；光照强度1500lx；
3、将保存的时间修改为24个月。
经计算，存活率为95％。
实施例4
重复实施例1的方法，只是进行如下修改：
1、将种质保存培养基配方修改为：1/4MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.1mg/L+多效唑0.5mg/L+蔗糖90g/L+琼脂5g/L，pH 6.0；
2、将脱毒试管苗继代培养的时间修改为20天，将培养条件修改为：温度：昼/夜30(±2)℃/23(±2)℃；光照时间：8h；光照强度2500～3000lx；
3、将保存的时间修改为12个月。
经计算，存活率为90.6％。
实施例5
重复实施例1的方法，只是进行如下修改：
1、将种质保存培养基配方修改为：1/2MS+6-BA0.01mg/L+NAA0.01mg/L+矮壮素500mg/L+蔗糖70g/L+琼脂8g/L，pH 5.8；
2、将脱毒试管苗继代培养的时间修改为25天；
3、将保存的时间修改为12个月。
经计算，存活率为94％。
实施例6
重复实施例1的方法，只是将种质保存培养基配方修改为：1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L+矮壮素100mg/L+蔗糖45g/L+琼脂7g/L，pH 6.0。
经计算，存活率为91.9％。
实施例7
重复实施例1的方法，只是将种质保存培养基配方修改为：1/4MS+6-BA2.5mg/L+NAA0.1mg/L+矮壮素800mg/L+蔗糖45g/L+琼脂7g/L，pH 6.0。
经计算，存活率为91.3％。
实施例8
重复实施例1的方法，只是将种质保存培养基配方修改为：1/4MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.03mg/L+矮壮素300mg/L+蔗糖60g/L+琼脂10g/L，pH 5.9。
经计算，存活率为90.6％。
实施例9
取出经实施例3离体保存后的材料，切取微型块茎转入恢复生长培养基中培养40天，获得恢复生长的芽苗；所得芽苗将芽苗分切成带1～3个节的茎段或茎尖进行增殖培养和生根培养，获得完整小植株；其中：
所述恢复生长培养基的配方为：MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.01mg/L+蔗糖20g/L，pH5.8；
所述微型块茎恢复生长的培养条件为：温度23～27℃，光照时间8～14h/d，光照强度1500～2000lx；
所述增殖培养的培养基配方为：MS+6-BA10.5mg/L+NAA0.02mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH6.0；所述增殖培养的条件为：温度为25～27℃，光照时间为10h/d，光照强度为2500lx；
所述生根培养的培养基配方为：1/2MS+IBA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+活性炭1g/L+7g/L，pH值为5.8～6.0；
所述生根培养的条件为：温度为23～25℃，光照时间为512h/d，光照强度为3000lx；
恢复率为100％。
实施例10
1)离体保存步骤：
1.1)获得脱毒试管苗：按常规方法获得罗汉果脱毒试管苗；
1.2)微型块茎的形成、膨大与离体保存：将获得的脱毒试管苗继代培养25天后，切除叶片和顶芽，所得枝条分切成带1个或2个节的茎段；所得茎段转接入种质保存培养基中培养75天，每个茎段上即有1～2个直径为2.5～5.0mm微型块茎形成，所形成的微型块茎继续在种质保存培养基中膨大和保存；其中：
所述继代培养用的培养基配方为：MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.01mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH6.0；
所述继代培养的条件为：温度为25℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000lx；
所述的种质保存培养基配方为：1/4MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.1mg/L+多效唑2.0mg/L+蔗糖70g/L+琼脂10g/L，pH5.8；
所述茎段转接入种质保存培养基中培养的条件，以及微型块茎继续在种质保存培养基中膨大和保存的条件均为：温度为25℃，光照时间14h/d，光照强度2000lx；
1.3)在上述培养条件下保存18个月后，得到离体保存后的材料。经计算，存活率为92.1％。
2)保存后恢复生长步骤：
2.1)取出上述1.3)所得离体保存后的材料，切取微型块茎转入恢复生长培养基中培养35天，获得恢复生长的芽苗；所得芽苗将芽苗分切成带1个节或3个节的茎段或茎尖进行增殖培养和生根培养，获得完整小植株；其中：
所述恢复生长培养基的配方为：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖50g/L+琼脂10g/L，pH5.5；
所述微型块茎在恢复生长培养基中的培养条件为：温度20℃，光照时间14h/d，光照强度1500lx；
所述增殖培养的培养基配方为：MS+6-BA0.4mg/L+NAA0.03mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.9；
所述增殖培养的条件为：温度为25℃，光照时间为11h/d，光照强度为1500lx；
所述生根培养的培养基配方为：1/2MS+IBA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+活性炭1g/L+琼脂0g/L，pH值为7.0；
所述生根培养的条件为：温度为30℃，光照时间为10h/d，光照强度为1500lx；
经计算，恢复率为100％。
田间试验：
1、2013年，申请人按本发明实施例1所述方法进行罗汉果种质资源离体保存，并将保存后的材料按实施例2所述方法进行恢复生长，经炼苗移栽后栽培于试验田中，之后按常规管理方式进行管理直至挂果。试验结果表明，与常规脱毒试管苗相比，其形态特征和长势无明显差异，雌、雄株均能正常开花，雌株单株挂果约100个，亩产8000～12000个。
2、2014年，申请人按本发明实施例10所述方法进行罗汉果种质资源离体保存及恢复生长，经炼苗移栽后栽培于试验田中，之后按常规管理方式进行管理直至挂果。试验结果表明，与常规脱毒试管苗相比，其形态特征和长势无明显差异，雌、雄株均能正常开花，雌株单株挂果约110个，亩产11000～13000个。
Claims (10)
1.一种罗汉果种质资源离体保存的方法，包括获得脱毒试管苗的步骤和微型块茎的形成、膨大与离体保存步骤，其特征在于：
所述的微型块茎的形成、膨大与离体保存步骤是将获得的脱毒试管苗继代培养20～40天后，切除叶片和顶芽，所得枝条分切成带1～3个节的茎段；所得茎段转接入种质保存培养基中培养60～90天，即有微型块茎形成，所形成的微型块茎继续在种质保存培养基中膨大和保存；其中：
所述的种质保存培养基配方为：(1/4～1)MS+6-BA0.01～3.0mg/L+NAA0.01～0.1mg/L+琼脂5～10g/L+蔗糖30～90g/L+多效唑0.1～3.0mg/L或矮壮素100～1000mg/L。
2.根据权利要求1所述的罗汉果种质资源离体保存的方法，其特征在于：所述的种质保存培养基配方为：(1/4～1)MS+6-BA0.1～0.5mg/L+NAA0.02～0.05mg/L+琼脂6～8g/L+蔗糖45～75g/L+多效唑0.5～2mg/L或矮壮素300～700mg/L。
3.根据权利要求1所述的罗汉果种质资源离体保存的方法，其特征在于：所述的种质保存培养基配方为：1/2MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+琼脂7g/L+蔗糖60g/L+多效唑1mg/L或矮壮素500mg/L。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的罗汉果种质资源离体保存的方法，其特征在于：所述种质保存培养基的pH值为5.5～7.0。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的罗汉果种质资源离体保存的方法，其特征在于：所述茎段转接入种质保存培养基中培养的条件，以及微型块茎继续在种质保存培养基中膨大和保存的条件均为：温度为20～35℃，光照时间为8～14h/d，光照强度为1500～3000lx。
6.按权利要求1所述的罗汉果种质资源离体保存后恢复生长的方法，其特征在于：取出离体保存后的材料，切取微型块茎转入恢复生长培养基中培养30～40天，获得恢复生长的芽苗；所得芽苗按常规方法进行增殖培养和生根培养，获得完整小植株；其中：
所述的恢复生长培养基配方为：MS+6-BA0.01～2.0mg/L或KT0.01～2.0mg/L+NAA0.01～0.2mg/L或IBA0.01～0.2mg/L+蔗糖20～50g/L+琼脂0或5～10g/L。
7.根据权利要求6所述的罗汉果种质资源离体保存后恢复生长的方法，其特征在于：所述的恢复生长培养基配方为：MS+6-BA0.1～1.0mg/L或KT0.1～1.0mg/L+NAA0.01～0.1mg/L或IBA0.01～0.1mg/L+蔗糖30～40g/L+琼脂0或5～10g/L。
8.根据权利要求6或7所述的罗汉果种质资源离体保存后恢复生长的方法，其特征在于：所述恢复生长培养基的pH值5.5～7.0。
9.根据权利要求6或7所述的罗汉果种质资源离体保存后恢复生长的方法，其特征在于：所述微型块茎在恢复生长培养基中的培养条件为：温度为20～35℃，光照时间为8～14h/d，光照强度为1500～3000lx。
10.一种罗汉果种质资源离体保存及保存后恢复生长的方法，包括离体保存步骤和保存后恢复生长步骤，其中：
所述离体保存步骤包括获得脱毒试管苗的步骤和微型块茎的形成、膨大与离体保存步骤，所述的微型块茎的形成、膨大与离体保存步骤是将获得的脱毒试管苗继代培养20～40天后，切除叶片和顶芽，所得枝条分切成带1～3个节的茎段；所得茎段转接入种质保存培养基中培养60～90天，即有微型块茎形成，所形成的微型块茎继续在种质保存培养基中膨大和保存；其中：所述的种质保存培养基配方为：(1/4～1)MS+6-BA0.01～3.0mg/L+NAA0.01～0.1mg/L+琼脂5～10g/L+蔗糖30～90g/L+多效唑0.1～3.0mg/L或矮壮素100～1000mg/L；
所述保存后恢复生长步骤为：取出离体保存后的材料，切取微型块茎转入恢复生长培养基中培养30～40天，获得恢复生长的芽苗；所得芽苗按常规方法进行增殖培养和生根培养，获得完整小植株；其中：所述的恢复生长培养基配方为：MS+6-BA0.01～2.0mg/L或KT0.01～2.0mg/L+NAA0.01～0.2mg/L或IBA0.01～0.2mg/L+蔗糖20～50g/L+琼脂0或5～10g/L。
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