CN108739044A - 一种家蚕幼虫感染母种菌株及北冬虫夏草人工栽培方法 - Google Patents

Abstract

一种家蚕幼虫感染母种菌株及北冬虫夏草人工栽培方法，该菌株为北冬虫夏草广A8号‑8，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2017692；采用无创伤感染技术进行感染幼虫，感染5‑7天，幼虫身体体表长出菌丝，8‑10天经体表气孔肛门进入体内吸收营养；同时采用幼虫自食虫草菌法感染技术，随着幼虫的活动，大量血氧带着虫草孢子进入幼虫各个器官，30‑40天将幼虫全身长透，开始进入幼虫僵硬期，80‑100天后进入转色期，再进行光照诱导和定向培养，140‑160天进入出草期。本发明经检测其子实体营养与药用成份与天然冬虫夏草基本相似，经济与社会效益巨大。

Description

一种家蚕幼虫感染母种菌株及北冬虫夏草人工栽培方法

技术领域

本发明属于食用菌栽培技术领域，具体涉及一种家蚕幼虫感染母种菌株及家蚕幼虫无创伤感染北冬虫夏草人工栽培方法。

背景技术

冬虫夏草属子囊菌门、核菌纲、麦角菌目、麦角菌科、虫草属，是一营腐寄生菌，它是子囊菌中一个大属，全世界已知此属的有350多种，我国已知有 58种，在我国已知的58种，由于它寄主不同，又有不同物名。

我国野生冬虫夏草主要生长在西藏、四川、云南、甘肃等海拔3500-5000 米高山雪地中，这些地带既寒冷又相对温凉，因为虫草有严格的寄生性，所以必须有大量的寄主昆虫。据专家研究，野生蝙蝠蛾一个世代需要3-5年，幼虫期需要2.5年-3年。幼虫生活在土土壤又不能太湿太干，又要有营养，同时还要有良好的植被为幼虫提供食料，在自然界中，虫草孢子侵染蝙蝠蛾幼虫后，染菌幼虫钻入土中过冬，虫草菌在幼虫体内繁殖，造成幼虫死亡，菌丝继续发育将虫体营养耗尽，只剩外皮，最后菌丝形成菌核，菌核再发育毁坏了幼虫内部器官，但虫体角质保持完好，外表保持原来虫形，这就是冬虫；夏季幼虫尸体头部长出子座，露出土面像一棵小草，这就是夏草，其完整的复合体，就是冬虫夏草。虽然过程简单，但生理过程相当复杂。

众所周知，世界上最珍稀昂贵菌类就是冬虫夏草，市场销价每公斤近40-60 万元人民币以上，并每年还在以20-30％速度不断上涨，冬虫夏草的畅销在产区造成采挖过量，资源逐年减少，已到了频临灭绝境地，有专家预测再不给予保护，20年后将会进入灭绝阶段，随着人类生活不断提高，这种高档营养品、药品需求量将会是越来越大。因此，人们下在努力地探索其的生长规律，想方设法地通过人工栽培产品来替代这野生资源。

国内很多地方采用大米、小麦、玉米等为培养基像生产大宗食用菌一样待菌丝长透后出草就是大型食用菌子实体叫虫草花，由于没有昆虫寄主，外形根本不像虫草，也不是真正意义上的虫草，另外还有一些食用菌专家用蚕蛹，蚕幼虫试验性生产少量北虫草，采用创伤感染法感染幼虫或蚕蛹，大部分感染其它细菌，但易得败血病，幼虫僵化率很低，很难形成大规模生产，最多只是小试验而已。

发明内容

本发明的目的在于提供一种家蚕幼虫感染母种菌株及家蚕幼虫无创伤感染北冬虫夏草人工栽培方法。

本发明的一种家蚕幼虫感染母种菌株，该菌株为北冬虫夏草(Cordycepsmilitaris)广A8号-8，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，保藏编号CCTCC NO：M2017692；该菌株从天然野生北虫草采用子座分离法分离到第一代母种编上号，然后再将每支母种做成液体栽培种，找到一支适合蚕幼虫感染，经小试中试实验，发现8号适合蚕幼虫感染。

本发明的家蚕幼虫无创伤感染北冬虫夏草人工栽培方法，采用无创伤感染技术进行北冬虫夏草菌感染幼虫，感染5-7天，幼虫身体体表长出菌丝，8-10 天经体表气孔肛门进入体内吸收营养；同时采用幼虫自食虫草菌法感染技术，伴随幼虫吃进虫草菌，幼虫吃进的带有虫草菌的营养载体也在肚内大量繁殖；随着幼虫的活动，大量血氧带着虫草孢子进入幼虫各个器官，30-40天将幼虫全身长透，开始进入幼虫僵硬期，80-100天后进入转色期，再进行光照诱导和定向培养，140-160天进入出草期。

所述无创伤感染技术，即幼虫体无伤口，自然感染；技术方法为：将经过逐条消毒过幼虫，放入净化接种台，用紫外线再消毒灭菌5-10分钟，用毛笔沾上液体种，搽幼虫体多遍，尤其是幼虫气孔和肛门处，再放入已长菌丝的液体种培养载体上，自行再沾上载体上菌丝，完成一次无创伤感染。

在完成无创伤一次感染后，根据感染情况，再进行二次或多次无创伤感染，每次无创伤感染后放入新的培养载体上，以利于幼虫自食虫草菌感染。

幼虫自食虫草菌法感染技术为：幼虫在接种感染前多天不给食，让幼虫处于饥饿状态，幼虫放入已长菌丝的液体种培养载体上，幼虫因饥饿会大量啃食培养载体，连同北虫草菌一起吞进肚内，进入肚内后，加上幼虫活动又带进大量血氧连同虫草菌进入幼虫体内各器官快速生长；幼虫感染后，幼虫体菌丝开始萌发，调好培养室温度10-12℃，湿度55-65％；5-7天内幼虫全身开始萌发菌丝，12-15天后幼虫表面长成雪白菌丝，20天后菌丝已通过气孔进入体内； 25-35天幼虫开始僵化，幼虫开始僵化时，保持温度12-14℃、相对空气湿度 68-72％，黑暗培养。

采用光照诱导和定向培养方法为：光照诱导：增加光照，光照度约150-200 勒克斯光，温度调到13-15℃，早中晚一天三次通风；定向培养：将已僵化幼虫头与头排好，头在外，尾深埋土中埋好，晚上开日光灯照射4-6小时；保持光照300-400勒克斯光，温度调到14-16℃，相对空气湿度80-90％，一天三次通风，增加氧气，有利于子实体正常生长。

所述液体种是在菌种营养基上接入母种后培养而得到的：

菌种营养基包括以下重量份的原料：土豆200±20份、葡萄糖20±2份、麦麸30±3份、腐殖土20±2份、硫酸镁1.5±0.15份、磷酸二氢钾3±0.3 份、蛋白胨2±0.2份、牛肉膏1±0.1份、水1000份。上述菌种营养基的制备：先将土豆用水煮25分钟后过滤，将其它原料加入土豆过滤液中煮5分钟，过滤，过滤液即为菌种培养基，用高压1.5公斤压力灭菌1小时后，冷却到 20-24℃接入母种，三天静止培养后，摇动培养菌丝72-96小时后得到液体种。

所述液体种培养载体包括以下重量份的原料：桑叶180-220份葡萄糖 20-25份，蛋白胨2-2.5份，土豆50-60份，琼脂20-23份，水1000份。液体种培养载体的制备：先将桑叶和土豆用水煮25分钟后过滤，再将其它原料加入桑叶和土豆过滤液中煮5分钟，再过滤，过滤液即为培养基，再倒入生产所需容器中，高压灭菌1.5公斤压力下灭菌40-50分钟，冷却后接入液体种，得到液体种培养载体。

本发明采用无创伤自然感染和培养箱内放载体进行二次感染，待幼虫僵化转色时再采用“光照定向”诱导出草，生产的北冬虫夏草除子座桔黄偏红外(不是自然的黑色)，其它与天然野生冬虫夏草完全相似，解决了当时用家蚕幼虫菌核与虫体不结实的历史性难题问题。本发明经检测其子实体营养成份与药用成份与天然冬虫夏草不相上下，基本相似，十分接近，经济与社会效益巨大。

具体实施方式

实施例：

一、幼虫挑选与消毒：

先将操作所需器械容器用75％酒精消毒，再放入零下低温冷却到2-4℃待用，然后将幼虫逐条用75％酒精消毒灭菌。

二、载体生产，营养载体配比：

液体种培养载体包括以下重量份的原料：桑叶180-220份葡萄糖20-25 份，蛋白胨2-2.5份，土豆50-60份，琼脂20-23份，水1000份。液体种培养载体的制备：先将桑叶和土豆用水煮25分钟后过滤，再将其它原料加入桑叶和土豆过滤液中煮5分钟，再过滤，过滤液即为培养基，再倒入生产所需容器中，高压灭菌1.5公斤压力下灭菌40-50分钟，冷却后接入液体种，得到液体种培养载体。

三、菌种生产的具体做法与配比如下：

液体种是在菌种营养基上接入母种后培养而得到的，母种菌株为北冬虫夏草(Cordyceps militaris)广A8号-8，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，保藏编号CCTCC NO：M2017692；

菌种营养基包括以下重量份的原料：土豆200±20份，葡萄糖20±2份，麦麸30±3份，腐殖土20±2份，硫酸镁1.5±0.15份，磷酸二氢钾3±0.3 份，蛋白胨2±0.2份，牛肉膏1±0.1份，水1000份；先将土豆用水煮25分钟后过滤，再将其它原料加入土豆过滤液中煮5分钟，过滤，过滤液即为培养基，再装入三角瓶中用高压1.5公斤压力灭菌1小时后，再冷却到20-24℃接入母种，三天静止培养后，开始用摇床摇动培养菌丝72-96小时后得到液体种，液体种再接入虫体。

四、无创伤一次感染：无创伤感染技术，即幼虫体无伤口，自然感染：将经过逐条消毒过幼虫，放入净化接种台，用紫外线再消毒灭菌5-10分钟，用毛笔沾上液体种，搽幼虫体多遍，尤其是幼虫气孔和肛门处，再放入已长菌丝的液体种培养载体上，自行再沾上载体上菌丝，完成一次无创伤感染。幼虫自食虫草菌法感染：幼虫在接种感染前多天不给食，让幼虫处于饥饿状态，幼虫放入已长菌丝的液体种培养载体上，幼虫因饥饿会大量啃食培养载体，连同北虫草菌一起吞进肚内，进入肚内后，加上幼虫活动又带进大量血氧连同虫草菌进入幼虫体内各器官快速生长；调好培养室温度10-12℃，湿度60％左右。5-7 天内幼虫全身开始萌发菌丝，12-15天后幼虫表面长成雪白菌丝，20天后菌丝已通过汽孔进入体内，30天左右幼虫开始僵化。

五、放入载体二次感染法：二次无创伤感染后放入新的培养载体上，以利于幼虫自食虫草菌法感染；主要是幼虫体刚沾上液体种，全身湿湿的，容易沾上载体上长出的菌丝，这又增加了再次感染机会，可减少虫体不感染结果，又增加了营养，又保证了幼虫在几十天培养内不失水的把握，也更易出草。

六、菌丝定植管理：幼虫感染后，幼虫体菌丝开始萌发，调好培养室温度 10-12℃，湿度60-75％，早晚通风5-10分钟增加室内氧气，有利于菌丝生长定植；5-7天内幼虫全身开始萌发菌丝，12-15天后幼虫表面长成雪白菌丝，20 天后菌丝已通过汽孔进入体内；25-35天幼虫开始僵化，进入幼虫后期和出草管理。

七、幼虫僵化管理：幼虫经二次感染后它全身长菌白，菌丝也有部分通过汽孔进入体内吸收幼虫营养，全身上下内外已长菌丝也已开始僵化；这时，保持温度12-14℃、相对空气湿度68-72％，黑暗培养。

八、菌核形成管理：

菌丝在幼虫体内吸收营养，温度调到8-10℃，多通风增加氧气进入，有利于菌核形成；这时菌丝在幼虫体内吸收营养，造成幼虫死亡关键时候，温度稍低一点，可调到8-10℃为好，多通风增加氧气进入，有利于菌核形成。

九、光照诱导管理：

这时可适当增加光照，光照度约150-200勒克斯光，温度调到13-15℃，早中晚一天三次通风，如光照不够装日光灯照亮。

十、定向出草管理：将已僵化幼虫头与头排好，头在外，尾深埋土中埋好，晚上开日光灯照射4-6小时；保持光照300-400勒克斯光，温度调到14-16度，相对空气湿度80-90％，一天三次通风，增加氧气，有利于子实体正常生长。

十一、出草管理：这时可适应增加温度，增加温度到18-20度，相对空气湿度90-95％，一天四次通风，光照要较好，光照400勒克斯以上，土壤湿度含水量60-65％。

本实施例得到的北冬虫夏草经过分析检测为：

分析检测结果 ResuIts

Claims (6)

1.一种家蚕幼虫感染母种菌株，其特征在于：该菌株为北冬虫夏草Cordycepsmilitaris 广A8号-8，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2017692；

该菌株从天然野生北虫草采用子座分离法分离到第一代母种编上号，然后再将每支母种做成液体栽培种，找到其中一支适合蚕幼虫感染菌株。

2.一种北冬虫夏草人工栽培方法，其特征在于：将经过逐条消毒过幼虫，放入净化接种台，用紫外线再消毒灭菌5-10分钟，用毛笔沾上液体种，搽幼虫体多遍，尤其是幼虫气孔和肛门处，再放入已长菌丝的液体种培养载体上，自行再沾上载体上菌丝，完成无创伤感染，调好培养室温度10-12℃，湿度55-65%，感染5-7天内幼虫全身开始萌发菌丝；同时采用幼虫自食虫草菌法感染，伴随幼虫吃进如权利要求1所述的虫草菌，幼虫吃进的带有虫草菌的营养载体也在肚内大量繁殖，大量血氧带着虫草孢子进入幼虫各个器官， 20-30天将幼虫全身长透，开始进入幼虫僵硬期，僵硬期保持温度12-14℃、相对空气湿度68-72%，黑暗培养；60-80天后进入转色期，再进行光照诱导和定向培养，140-160天进入出草期。

3.根据权利要求2所述的北冬虫夏草人工栽培方法，其特征在于：在完成无创伤一次感染后，进行二次或多次无创伤感染；每次无创伤感染后放入新的培养载体上，以利于幼虫自食虫草菌法感染。

4.根据权利要求2所述的北冬虫夏草人工栽培方法，其特征在于：所述液体种是在菌种营养基上接入如权利要求1中所述母种后培养而得到，菌种营养基包括以下重量份的原料：土豆200±20份、葡萄糖20±2份、麦麸30±3份、腐殖土20±2份、硫酸镁1.5±0.15份、 磷酸二氢钾3±0.3份、蛋白胨2±0.2份、牛肉膏1±0.1份、水1000份；先将土豆用水煮25分钟后过滤，将其它原料加入土豆过滤液中煮5分钟，过滤，过滤液即为菌种培养基，用1.5公斤压力灭菌1小时后，冷却到20-24℃接入母种，三天静止培养后，摇动培养菌丝72-96小时后得到液体种；所述液体种培养载体包括以下重量份的原料：桑叶180-220份、葡萄糖20-25份、蛋白胨2-2.5份、土豆50-60份、琼脂20-23份、水1000份；液体种培养载体的制备，将桑叶和土豆用水煮25分钟后过滤，再其它原料加入桑叶和土豆过滤液中煮5分钟，过滤，过滤液即为培养基，再倒入生产所需容器中， 1.5公斤压力下灭菌40-50分钟，冷却后接入液体种，得到液体种培养载体。

5.根据权利要求2所述的北冬虫夏草人工栽培方法，其特征在于：所述光照诱导为：光照度约150-200勒克斯光，温度调到13-15℃，早中晚一天三次通风。

6.根据权利要求2所述的北冬虫夏草人工栽培方法，其特征在于：所述定向培养为，将已僵化幼虫头与头排好，头在外，尾深埋土中埋好，晚上开日光灯照射4-6小时，保持光照300-400勒克斯光，温度调到14-16℃，相对空气湿度80-90%，一天三次通风。