CN108732347A - 一种检测唾液中hcv抗体的检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测唾液中HCV抗体的检测试剂盒及其制备方法，属于生物检测技术领域。本发明的检测试剂盒，包括卡壳、唾液垫、测试条，所述测试条包括底板、样品垫、金标垫、NC膜、吸水纸，所述样品垫、金标垫、NC膜、吸水纸依次粘贴于底板上；所述金标垫上包被有胶体金标记物；所述NC膜上分别包被有HCV重组抗原和二抗；唾液垫与样品垫连接；胶体金标记物为HCV重组抗原‑胶体金标记物和鼠IgG‑胶体金标记物的混合物或结合蛋白proteinG‑胶体金标记物。本发明的检测试剂盒，利用唾液垫完成唾液的采集并输送至样品垫，通过侧向层析同金标垫上胶体金标记物及NC膜上的重组抗原发生免疫反应，显示出肉眼可见的结果。

Description

一种检测唾液中HCV抗体的检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种检测唾液中HCV抗体的检测试剂盒及其制备方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

丙型病毒性肝炎，简称为丙型肝炎(Hepatitis C)、丙肝，是一种由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的病毒性肝炎，主要经输血、针刺、吸毒等传播，根据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约为2.8％，估计约1.85亿人感染了HCV，每年因HCV感染导致的死亡病例约35万例。

由于HCV感染具有隐匿性，多数感染者并不知道感染了HCV，潜伏期内，很大一部分患者没有明显的症状，因此，针对丙型肝炎及时和有效的诊断非常重要。HCV抗体的检测作为一种快速诊断测试方法可用来初步筛查丙型肝炎，主要方法有胶体金法、化学发光法、酶联免疫法等。

目前国内市场上的检测产品多为血液中HCV抗体检测，尚无唾液检测HCV抗体产品上市。唾液和血液同作为人体体液的一部分，成分大多相似。临床检测中目标物质在唾液和血液中的出现较为一致，仅浓度存在差异。由于唾液检测较于血液检测有无需采血、安全无创等诸多优点，急需研制唾液检测丙型肝炎病毒抗体的产品。

现市场流通的唾液检测试剂大多是先采用海绵棒取样、再与稀释液混合、待混匀后方可加样测试，该检测方法存在以下不足：1、唾液取样过程较为繁琐；2、容易出现稀释液混合不彻底现象；3、因个人加样方式不同，存在加样过猛或不足等问题。

授权公告号为CN 203101399U的实用新型专利公开了一种使用拭子采集体液检测丙型肝炎的检测试剂盒，塑料支撑板一端连接上样垫，上样垫的一端紧密压接含有标记丙型肝炎病毒特异性的抗原的胶体金垫，胶体金垫一端紧密压接硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜包被有相互分离的检测T线和质控C线，检测线T为包被在硝酸纤维素膜上的抗人IgG抗体，质控C线为包被在硝酸纤维素膜上的抗丙型肝炎病毒特异性的抗原的抗体，硝酸纤维素膜的另一端连接吸样垫形成试纸。该专利公开的检测试剂盒需先采用口腔拭子尼龙垫端从嘴的牙龈取样，之后将口腔拭子浸入样本缓冲液中，先后让拭子的两面紧贴试管壁，上下刮擦，管内液体即为口腔液样本，然后将试纸条平放，在上样垫上加入100μL样品进行检测，该专利存口腔液取样繁琐，溶液出现与缓冲液混合不彻底等问题而影响检测结果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测唾液中HCV抗体的检测试剂盒，该试剂盒可以一步法快速检测人唾液中HCV抗体且取样方便。

本发明的第二个目的在于提供一种上述检测唾液中HCV抗体的检测试剂盒的制备方法。

为实现以上目的，本发明的技术方案是：

一种检测唾液中HCV抗体的检测试剂盒，包括卡壳、唾液垫、测试条，所述测试条包括底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，所述样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴于底板上，所述金标垫上包被有胶体金标记物，所述硝酸纤维素膜上分别包被有HCV重组抗原和二抗；所述唾液垫与所述测试条的样品垫连接；所述胶体金标记物为HCV重组抗原-胶体金标记物和鼠IgG-胶体金标记物的混合物或结合蛋白proteinG-胶体金标记物；所述二抗为羊抗人IgG或羊抗鼠IgG。

所述硝酸纤维素膜上靠近金标垫的一端包被有HCV重组抗原。

所述硝酸纤维素膜上靠近吸水纸的一端包被有二抗。

所述结合蛋白proteinG-胶体金标记物、HCV重组抗原-胶体金标记物或鼠IgG-胶体金标记物由包括以下步骤的制备方法制得：将胶体金溶液与碳酸钾溶液混匀后加入结合蛋白proteinG或HCV重组抗原或鼠IgG，之后加入BSA溶液封闭，然后离心，弃去上清液，将余液用缓冲液重悬即得。

上述胶体金溶液由包括以下步骤的制备方法制得：加热1L超纯水至沸腾，向沸水中加入1ml质量分数为10％的氯金酸溶液，快速加入1.5ml质量分数为10％的柠檬酸三钠溶液，搅拌混匀；保继续持溶液沸腾，直到液体呈酒红色即停止加热，冷却至室温即得。

上述碳酸钾溶液的浓度为0.1mol/L。

上述胶体金溶液和碳酸钾溶液的体积比为100:1。

上述加入结合蛋白proteinG或HCV重组抗原或鼠IgG至使结合蛋白proteinG或HCV重组抗原或鼠IgG的浓度为0.003～0.02mg/ml。

上述加入结合蛋白proteinG或HCV重组抗原或鼠IgG后搅拌30min。

上述加入BSA溶液封闭具体为：加入2ml质量分数为10％的BSA溶液封闭15min。

上述离心为12000～15000r/min的转速离心30分钟。

所述缓冲液主要由以下成分配成：0.1mol/l的TBS溶液，BSA，PVP，PEG，蔗糖；所述TBS溶液、BSA、PVP、PEG、蔗糖的质量比为100:0.1～1:0.1～1:0.1～1：2.5～20。所述缓冲液的pH为8.0。

所述卡壳包括主壳体和盖设于主壳体一端的端盖，所述主壳体包括上盖和与所述上盖相互卡合的下盖。

所述上盖的外表面上还凹设有显示区，所述视窗设于所述显示区内。

上述唾液垫由聚酯纤维垫经处理液浸泡10min，后经室温干燥得到。所述处理液为由50mmol/L的PBS溶液和薄荷香精组成；所述PBS溶液和薄荷香精的质量比为100:0.1。所述处理液的pH为8.0。

上述检测唾液中HCV抗体的检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1)取样品垫处理液浸润玻璃纤维或聚酯纤维，干燥，得样品垫；

2)取胶体金标记物浸润玻璃纤维，干燥，得金标垫；

3)在硝酸纤维素膜上分别包被HCV重组抗原作为检测区、包被二抗作为质控区；

4)将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴于底板上，得测试条。

上述制备方法，还包括以下步骤：将步骤4)所得的测试条装于所述卡壳的下盖上，装上唾液垫、上盖及盖端即得。

步骤1)中的样品垫处理液主要由以下成分配成：0.1mol/L的PBS溶液，PVP，PEG；所述PBS溶液、PVP、PEG的质量比为100:0.1～1:0.1～1。所述样品垫处理液的pH为8.0。

步骤1)中的干燥为常温干燥12h。

步骤2)中的干燥为50℃过夜干燥。

步骤2)中的胶体金标记物为HCV重组抗原-胶体金标记物和鼠IgG-胶体金标记物的混合物或结合蛋白proteinG-胶体金标记物；所述结合蛋白proteinG-胶体金标记物、HCV重组抗原-胶体金标记物或鼠IgG-胶体金标记物由包括以下步骤的制备方法制得：将胶体金溶液与碳酸钾溶液混匀后加入结合蛋白proteinG或HCV重组抗原或鼠IgG，之后加入BSA溶液封闭，然后离心，弃去上清液，将余液用缓冲液重悬即得。

所述加入结合蛋白proteinG或HCV重组抗原或鼠IgG使所述结合蛋白proteinG或HCV重组抗原或鼠IgG的浓度为0.003～0.02mg/ml。

上述结合蛋白proteinG由长沙博优生物科技有限公司提供。

优选的，上述硝酸纤维素(NC)膜由Sartorius Stedim Biotech GmbH公司提供。

上述胶体金溶液由包括以下步骤的制备方法制得：加热1L超纯水至沸腾，向沸水中加入1ml质量分数为10％的氯金酸溶液，快速加入1.5ml质量分数为10％的柠檬酸三钠溶液，搅拌混匀；保继续持溶液沸腾，直到液体呈酒红色即停止加热，冷却至室温即得。

上述碳酸钾溶液的浓度为0.1mol/L。

上述胶体金溶液和碳酸钾溶液的体积比为100:1。

上述加入结合蛋白proteinG或HCV重组抗原或鼠IgG后搅拌30min。

上述加入BSA溶液封闭具体为：加入2ml质量分数为10％的BSA溶液封闭15min。

上述离心为12000～15000r/min的转速离心30分钟。

所述缓冲液主要由以下成分配成：0.1mol/l的TBS溶液，BSA，PVP，PEG，蔗糖；所述TBS溶液、BSA、PVP、PEG、蔗糖的质量比为100:0.1～1:0.1～1:0.1～1：2.5～20。所述缓冲液的pH为8.0。

步骤3)中HCV重组抗原的浓度为0.5～2.0mg/ml，二抗的浓度为0.25～1.5mg/ml。

步骤3)中的HCV重组抗原为经PBS溶液稀释后的HCV重组抗原。所述PBS溶液的浓度为0.01mol/L。优选的，稀释前的HCV重组抗原由常州歆新生物科技有限公司提供。

步骤3)中的二抗为羊抗人IgG或羊抗鼠IgG。

上述羊抗人IgG为经PBS溶液稀释后的羊抗人IgG。所述PBS溶液的浓度为0.01mol/L。

上述羊抗鼠IgG为经PBS溶液稀释后的羊抗人IgG。所述PBS溶液的浓度为0.01mol/L。

优选的，稀释前的羊抗人IgG或稀释前的羊抗鼠IgG由长沙博优生物科技有限公司提供。

步骤3)中HCV重组抗原及二抗的包被具体为：采用划膜仪将HCV重组抗原、二抗包被到NC膜上，之后常温干燥。

上述步骤4)中样品垫与金标垫之间、金标垫与硝酸纤维素膜之间、硝酸纤维素膜与吸水纸之间均重叠2mm。然后压紧后4mm裁条。

步骤5)中的唾液垫由聚酯纤维垫经处理液浸泡10min，后经室温干燥得到。所述处理液为由50mmol/L的PBS溶液和薄荷香精组成；所述PBS溶液和薄荷香精的质量比为100:0.1。所述处理液的pH为8.0。本发明唾液垫利于对唾液的采集及输送。

本发明的检测唾液中HCV抗体的检测试剂盒，利用胶体金免疫层析技术，采用免疫夹心法检测唾液中HCV抗体，当待测样品中含有的HCV抗体浓度等于或高于最低检测限时，HCV抗体先和结合蛋白proteinG-胶体金标记物或HCV重组抗原-胶体金标记物形成复合物，在层析作用下复合物沿着硝酸纤维膜向前移动，与检测区(T区)预包被的HCV重组抗原结合，最终在T区形成一条肉眼可见的红色反应线，此时结果为阳性；相反，当待测样品中不含HCV抗体或者浓度低于最低检测限时，则在T区无肉眼可见红色反应线形成，此时结果为阴性。无论待测样品中是否含有HCV抗体，质控区(C区)包被的二抗都会形成一条红色反应线作为质控线。

本发明的检测唾液中HCV抗体的检测试剂盒，只需检测人将唾液垫含于口腔内舌下，放置1-5分钟，至肉眼可见唾液样本爬上检测区，即可取出，开始检测，10-15min即可观察结果。使得整个检测过程更加方便，无需考虑不同检测人带来的差异。

本发明的检测唾液中HCV抗体的检测试剂盒，利用唾液垫完成唾液的吸收、采集、输送至样品垫端，通过侧向层析分别同金标垫上的胶体金标记物及NC膜上的重组抗原发生免疫反应，显示出肉眼可见的结果。较之先取样后混合后加样的繁琐步骤更为快速方便，唾液检测具有安全无创、高效准确等特点。

本发明的检测唾液中HCV抗体的检测试剂盒具有以下有益效果：

1)安全无创伤：操作人仅需将唾液垫置于口腔内舌下，对口腔黏膜刺激非常小，几乎不会造成口腔黏膜损伤，减少检测人员职业暴露的几率与风险；

2)方便快速：唾液样本通过唾液垫收集富集作用，直接将样本输送至样品垫，无需其他步骤，不受检测者影响，无需专业技能，无需辅助设备，对结果影响最小，整个检测过程只需要10-15分钟，简单方便，无需采血，无创，安全，实现方便快速检测唾液中HCV抗体；

3)高效准确：唾液垫采集和输送的唾液量满足检测需要，且在检测试纸条的金标垫和NC膜上分别包埋了胶体金标记物和HCV重组抗原，提高检测有效率，保证了灵敏度和特异性。

附图说明

图1为本发明的检测唾液中HCV抗体的检测试剂盒的主视图；

图2为图1所示试剂盒的部分分解图；

图3为图2所示试剂盒的上盖的结构示意图；

图4为使用本发明的试剂盒时取样的示意图；

图5为使用本发明的检测试剂盒的结果判断示意图。

图中零部件名称及编号分别为：

试剂盒1 主壳体2 端盖3

唾液垫4 上盖5 下盖6

测试条7 样品垫8 金标垫9

硝酸纤维素膜10 吸水纸11 显示区12

视窗13 上卡合部14 下卡合部15

开口16 卡合孔17 卡合凸起18

凸条19 配合孔20 凸台21

安装部22

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的检测唾液中HCV抗体的检测试剂盒及其制备方法作进一步详细说明。

本发明下述实施例中的检测唾液中HCV抗体的检测试剂盒如图1-图3所示，检测试剂盒1包括主壳体2、盖设于主壳体2一端的端盖3、收容于主壳体2内部的唾液垫4、测试条7。主壳体2包括上盖5和与上盖5相互卡合的下盖6。上盖5上开设有视窗13。本实施方式中，上盖5的外表面上还凹设有显示区12，视窗13设于显示区12内。上盖5的一端设置有上卡合部14，上盖5的内表面设置有两个凸条19，两个凸条19分布于视窗13的两侧。上卡合部14上开设有卡合孔17，上卡合部14和上盖5的内表面上分别凸设有多个凸台21，每一个凸台21的端面开设有一个配合孔20。

下盖6的一端对应上卡合部14设置有下卡合部15。下卡合部15和下盖6的内表面上设置有用于安装测试条7的安装部22及能够与配合孔20相卡合的卡合凸起18。

端盖3大致呈一端具有开口16的筒状，端盖3的内壁上对应卡合孔17凸设置有卡持部(图未示)。

测试条7包括样品垫8、金标垫9、硝酸纤维素膜10、吸水纸11和底板(图中未示出)；所述样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴于底板上。硝酸纤维素膜10靠近金标垫9的一端设置有由预包被的HCV重组抗原形成的检测区(T线)，硝酸纤维素膜10靠近吸水纸11的一端设置有由预包被的二抗形成的质控区(C线)。

金标垫9由玻璃纤维浸泡胶体金标记物干燥后制成。

本发明检测唾液中HCV抗体的检测试剂盒1检测HCV抗体的检测原理为，利用胶体金免疫层析技术，采用间接法检测唾液中HCV抗体，待测样品经唾液垫4吸取后经样品垫8到达金标垫9，当待测样品中含有的HCV抗体浓度等于或高于最低检测限时，HCV抗体先和金标垫9上标记的胶体金标记物形成复合物，在层析作用下复合物沿着硝酸纤维膜10向前移动，与检测区(T区)预包被的HCV重组抗原结合，最终在T区形成一条肉眼可见的红色反应线，此时结果为阳性；相反，当待测样品中不含HCV抗体或者浓度低于最低检测限时，则在T区无肉眼可见红色反应线形成，此时结果为阴性。无论待测样品中是否含有HCV抗体，质控区(C区)包被的二抗都会形成一条红色反应线作为质控线。

实施例1

本实施例的检测唾液中HCV抗体的检测试剂盒，包括塑料卡壳、唾液垫、测试条，测试条包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和底板，所述样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴于底板上，样品垫与金标垫之间、金标垫与硝酸纤维素膜之间、硝酸纤维素膜与吸水纸之间均重叠2mm；所述金标垫上包被有结合蛋白proteinG-胶体金标记物，所述硝酸纤维素膜上靠近金标垫的一端包被有HCV重组抗原作为检测区，所述硝酸纤维素膜上靠近吸水纸的一端包被有羊抗人IgG作为质控区；所述唾液垫与所述测试条的样品垫连接。具体结构如图1-3所示。

本实施例的检测唾液中HCV抗体的检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1)样品垫的制备

取样品垫处理液浸润玻璃纤维，常温干燥12h，制得样品垫；上述样品垫处理液主要由以下成分配成：0.1mol/L的PBS溶液，PVP，PEG；所述PBS溶液、PVP、PEG的质量比为100:1:1；所述样品垫处理液的pH为8.0；

2)结合蛋白proteinG-胶体金标记物的制备

a)加热1L超纯水至沸腾，向沸水中加入1ml质量分数为10％的氯金酸溶液，快速加入1.5ml质量分数为10％的柠檬酸三钠溶液，搅拌混匀；保继续持溶液沸腾，直到液体呈酒红色即停止加热，冷却至室温后补足失水，得胶体金溶液；

b)取100ml胶体金溶液，加入1ml0.1M的碳酸钾溶液，混合均匀，缓慢加入结合蛋白proteinG使其终浓度为0.01mg/ml，继续搅拌30分钟，加入2ml10％的BSA溶液封闭15分钟，以12000r/min的转速离心30分钟，弃去上清液，用50ml缓冲液重悬得结合蛋白proteinG-胶体金标记物；上述缓冲液主要由以下成分配成：0.1mol/l的TBS溶液，BSA，PVP，PEG，蔗糖；TBS溶液、BSA、PVP、PEG、蔗糖的质量比为100:1:0.1:0.1：10；上述缓冲液的pH为8.0；

3)金标垫的制备

用步骤2)制得的结合蛋白proteinG-胶体金标记物浸润玻璃纤维，50℃过夜真空干燥制得金标垫；

4)取0.01M PBS(pH8.0)稀释HCV重组抗原至0.5mg/ml作为T线工作液、稀释羊抗人IgG至0.5mg/ml作为C线工作液，采用划膜仪将其包被到NC膜上，常温干燥；

5)按照合适尺寸将金标垫和样品垫进行裁条，依次将样品垫、金标垫、NC膜、吸水纸粘贴在PVC板上，样品垫与金标垫之间、金标垫与NC膜之间、NC膜与吸水纸之间均重叠2mm，压紧后4mm裁条，得测试条；

6)将测试条装于所述下盖上，装上唾液垫、上盖及盖端即得；唾液垫由聚酯纤维经处理液浸泡10min后经室温干燥得到；上述处理液为由50mmol/L的PBS溶液和薄荷香精组成；PBS溶液和薄荷香精的质量比为100:0.1；上述处理液的pH为8.0。

样品采集及测试：

检测人用试剂盒上的唾液垫轻轻擦拭上下牙龈数次，然后含于口腔内舌下，放置1-5分钟，至肉眼可见唾液样本爬上检测区，即可取出，开始检测。产品取样检测方法如图4所示。

检测结果判断：

如图5所示，检测线和质控线均为红色为阳性；质控线为红色，检测线无颜色为阴性；质控线无色为无效，质控线和检测线均无色为无效。

实施例2

本实施例的检测唾液中HCV抗体的检测试剂盒，包括塑料卡壳、唾液垫、测试条，测试条包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和底板，所述样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴于底板上，样品垫与金标垫之间、金标垫与硝酸纤维素膜之间、硝酸纤维素膜与吸水纸之间均重叠2mm；所述金标垫上包被有HCV重组抗原-胶体金标记物和鼠IgG-胶体金标记物的混合物，所述硝酸纤维素膜上靠近金标垫的一端包被有HCV重组抗原作为检测区，所述硝酸纤维素膜上靠近吸水纸的一端包被有羊抗鼠IgG作为质控区；所述唾液垫与所述测试条的样品垫连接。

本实施例的检测唾液中HCV抗体的检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1)样品垫的制备

取样品垫处理液浸润聚酯纤维，常温干燥12h，制得样品垫；上述样品垫处理液主要由以下成分配成：0.1mol/L的PBS溶液，PVP，PEG；所述PBS溶液、PVP、PEG的质量比为100:0.1:0.1；所述样品垫处理液的pH为8.0；

2)HCV重组抗原-胶体金标记物及鼠IgG-胶体金标记物的制备

a)加热1L超纯水至沸腾，向沸水中加入1ml质量分数为10％的氯金酸溶液，快速加入1.5ml质量分数为10％的柠檬酸三钠溶液，搅拌混匀；保继续持溶液沸腾，直到液体呈酒红色即停止加热，冷却至室温后补足失水，得胶体金溶液；

b)取100ml胶体金溶液，加入1ml 0.1M的碳酸钾溶液，混合均匀，缓慢加入HCV重组抗原使其终浓度为0.008mg/ml，继续搅拌30分钟，加入2ml 10％的BSA溶液封闭15分钟，以12000r/min的转速离心30分钟，弃去上清液，用50ml缓冲液重悬得HCV重组抗原-胶体金标记物；

c)取100ml胶体金溶液，加入1ml 0.1M的碳酸钾溶液，混合均匀，缓慢加入鼠IgG使其终浓度为0.004mg/ml，继续搅拌30分钟，加入2ml 10％的BSA溶液封闭15分钟，以12000r/min的转速离心30分钟，弃去上清液，用10ml缓冲液重悬得鼠IgG-胶体金标记物；步骤b)和步骤c)中的缓冲液均主要由以下成分配成：0.1mol/l的TBS溶液，BSA，PVP，PEG，蔗糖；TBS溶液、BSA、PVP、PEG、蔗糖的质量比为100:0.1:1:1：2.5；上述缓冲液的pH为8.0；

3)将步骤2)制得的HCV重组抗原-胶体金标记物和-鼠IgG-胶体金标记物混合后浸润玻璃纤维，50℃过夜真空干燥制得金标垫；

4)取0.01M PBS(pH8.0)稀释HCV重组抗原至1.2mg/ml作为T线工作液、稀释羊抗鼠IgG至0.8mg/ml作为C线工作液，采用划膜仪将其包被到NC膜上，常温干燥；

5)按照合适尺寸将金标垫和样品垫进行裁条，依次将样品垫、金标垫、NC膜、吸水纸粘贴在PVC板上，样品垫与金标垫之间、金标垫与NC膜之间、NC膜与吸水纸之间均重叠2mm，压紧后4mm裁条，得测试条；

6)将测试条装于所述下盖上，装上唾液垫、上盖及盖端即得；唾液垫由聚酯纤维垫经处理液浸泡10min后经室温干燥得到；上述处理液为由50mmol/L的PBS溶液和薄荷香精组成；PBS溶液和薄荷香精的质量比为100:0.1；上述处理液的pH为8.0。

实施例3

本实施例的检测唾液中HCV抗体的检测试剂盒，包括塑料卡壳、唾液垫、测试条，测试条包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和底板，所述样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴于底板上，样品垫与金标垫之间、金标垫与硝酸纤维素膜之间、硝酸纤维素膜与吸水纸之间均重叠2mm；所述金标垫上包被有结合蛋白proteinG-胶体金标记物，所述硝酸纤维素膜上靠近金标垫的一端包被有HCV重组抗原作为检测区，所述硝酸纤维素膜上靠近吸水纸的一端包被有羊抗人IgG作为质控区；所述唾液垫与所述测试条的样品垫连接。

本实施例的检测唾液中HCV抗体的检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1)样品垫的制备

取样品垫处理液浸润玻璃纤维，常温干燥12h，制得样品垫；上述样品垫处理液主要由以下成分配成：0.1mol/L的PBS溶液，PVP，PEG；所述PBS溶液、PVP、PEG的质量比为100:0.5:0.5；所述样品垫处理液的pH为8.0；

2)结合蛋白proteinG-胶体金标记物的制备

a)加热1L超纯水至沸腾，向沸水中加入1ml质量分数为10％的氯金酸溶液，快速加入1.5ml质量分数为10％的柠檬酸三钠溶液，搅拌混匀；保继续持溶液沸腾，直到液体呈酒红色即停止加热，冷却至室温后补足失水，得胶体金溶液；

b)取100ml胶体金溶液，加入1ml0.1M的碳酸钾溶液，混合均匀，缓慢加入结合蛋白proteinG使其终浓度为0.003mg/ml，继续搅拌30分钟，加入2ml 10％的BSA溶液封闭15分钟，以12000r/min的转速离心30分钟，弃去上清液，用50ml缓冲液重悬得结合蛋白proteinG-胶体金标记物；上述缓冲液主要由以下成分配成：0.1mol/l的TBS溶液，BSA，PVP，PEG，蔗糖；TBS溶液、BSA、PVP、PEG、蔗糖的质量比为100:0.5:0.5:0.5：20；上述缓冲液的pH为8.0；

3)用步骤2)制得的结合蛋白proteinG-胶体金标记物浸润玻璃纤维，50℃过夜真空干燥制得金标垫；

4)取0.01M PBS(pH8.0)稀释HCV重组抗原至1.0mg/ml作为T线工作液、稀释羊抗人IgG至0.5mg/ml作为C线工作液，采用划膜仪将其包被到NC膜上，常温干燥；

5)按照合适尺寸将金标垫和样品垫进行裁条，依次将样品垫、金标垫、NC膜、吸水纸粘贴在PVC板上，样品垫与金标垫之间、金标垫与NC膜之间、NC膜与吸水纸之间均重叠2mm，压紧后4mm裁条，得测试条；

6)将测试条装于所述下盖上，装上唾液垫、上盖及盖端即得；唾液垫由聚酯纤维垫经处理液浸泡10min后经室温干燥得到；上述处理液为由50mmol/L的PBS溶液和薄荷香精组成；PBS溶液和薄荷香精的质量比为100:0.1；上述处理液的pH为8.0。

实验例

将检测唾液中HCV抗体检测试剂盒在医护人员的指导下，检测临床确诊断为丙型肝炎病毒抗体阳性的患者(200名，编号为P-001～P-200)和丙型肝炎病毒抗体阴性的人员(200名，编号为N-001～N-200)。分别将唾液垫擦拭上下牙龈多次后含于口腔内舌下，放置1-5min，至肉眼可见唾液样本移动至硝酸纤维素膜处，取出开始检测，10-15min判读结果。结果显示，阳性患者的200份试纸中，199份试纸的检测线和质控线均为红色，1份试纸的质控线为红色，检测线无颜色，即阳性患者的200份试纸中，199份检测为阳性，1份为阴性；阴性人员的200份试纸中，质控线为红色，检测线无颜色，即阴性人员的200份试纸中，均检测为阴性。本发明中试剂盒检测的准确率为99.75％。

本发明检测人唾液中HCV抗体检测试剂盒，可广泛用于医疗机构临床科室对患者进行的HCV抗体初筛试验，也可用于疾控中心等单位对高危人群进行的HCV抗体初筛试验，还可用于高危人群自行HCV抗体自查。

对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测唾液中HCV抗体的检测试剂盒，其特征在于，包括卡壳、唾液垫、测试条，所述测试条包括底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，所述样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴于底板上，所述金标垫上包被有胶体金标记物，所述硝酸纤维素膜上分别包被有HCV重组抗原和二抗；所述唾液垫与所述测试条的样品垫连接；所述胶体金标记物为HCV重组抗原-胶体金标记物和鼠IgG-胶体金标记物的混合物或结合蛋白proteinG-胶体金标记物；所述二抗为羊抗人IgG或羊抗鼠IgG。

2.根据权利要求1所述的检测唾液中HCV抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述结合蛋白proteinG-胶体金标记物、HCV重组抗原-胶体金标记物或鼠IgG-胶体金标记物由包括以下步骤的制备方法制得：将胶体金溶液与碳酸钾溶液混匀后加入结合蛋白proteinG或HCV重组抗原或鼠IgG，之后加入BSA溶液封闭，然后离心，弃去上清液，将余液用缓冲液重悬即得。

3.根据权利要求1所述的检测唾液中HCV抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述卡壳包括主壳体和盖设于主壳体一端的端盖，所述主壳体包括上盖和与所述上盖相互卡合的下盖。

4.一种如权利要求1所述的检测唾液中HCV抗体的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取样品垫处理液浸润玻璃纤维或聚酯纤维，干燥，得样品垫；

2)取胶体金标记物浸润玻璃纤维，干燥，得金标垫；

3)在硝酸纤维素膜上分别包被HCV重组抗原作为检测区、包被二抗作为质控区；

4)将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴于底板上，得测试条。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：将步骤4)所得的测试条装于所述卡壳的下盖上，装上唾液垫、上盖及盖端即得。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中的样品垫处理液主要由以下成分配成：0.1mol/L的PBS溶液，PVP，PEG；所述PBS溶液、PVP、PEG的质量比为100:0.1～1:0.1～1。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中的胶体金标记物为HCV重组抗原-胶体金标记物和鼠IgG-胶体金标记物的混合物或结合蛋白proteinG-胶体金标记物；所述结合蛋白proteinG-胶体金标记物、HCV重组抗原-胶体金标记物或鼠IgG-胶体金标记物由包括以下步骤的制备方法制得：将胶体金溶液与碳酸钾溶液混匀后加入结合蛋白proteinG或HCV重组抗原或鼠IgG，之后加入BSA溶液封闭，然后离心，弃去上清液，将余液用缓冲液重悬即得。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述加入结合蛋白proteinG或HCV重组抗原或鼠IgG使所述结合蛋白proteinG或HCV重组抗原或鼠IgG的浓度为0.003-0.02mg/ml。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液主要由以下成分配成：0.1mol/l的TBS溶液，BSA，PVP，PEG，蔗糖；所述TBS溶液、BSA、PVP、PEG、蔗糖的质量比为100:0.1～1:0.1～1:.0.1～1:2.5～20。

10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中HCV重组抗原的浓度为0.5～2.0mg/ml，二抗的浓度为0.25～1.5mg/ml。