CN108728425B

CN108728425B - 调节根瘤植物的固氮能力的基因及其应用

Info

Publication number: CN108728425B
Application number: CN201710239950.3A
Authority: CN
Inventors: 谢芳; 孔祥晓; 李晓琳
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2017-04-13
Filing date: 2017-04-13
Publication date: 2021-12-03
Anticipated expiration: 2037-04-13
Also published as: CN108728425A

Abstract

本发明涉及调节根瘤植物的固氮能力的基因及其应用。本发明揭示一个新的编码LRR类受体激酶的基因，命名为RINRK基因。RINRK基因可以调节根瘤植物的固氮能力，从而可以将RINRK基因应用于植物的培育中，选育出改良的植物新品种；或者，可以将RINRK基因应用于植物根瘤固氮的科学研究。

Description

调节根瘤植物的固氮能力的基因及其应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，更具体地，本发明涉及调节根瘤植物的固氮能力的基因及其应用。

背景技术

随着世界人口的增长，人们对粮食的需求也与日俱增。在耕地有限的情况下，提高农作物产量就格外重要。氮是植物生长发育过程中最重要的营养元素，也是作物产量的限制性因素之一。氮素主要来源于空气中的氮气，但这种含量丰富的氮气却不能被植物直接吸收利用，而需要被还原为氨，即氮气的固定，才能被植物吸收利用。固氮作用主要有化学固氮和生物固氮两种方式。在过去的近百年中，通过Haber–Bosch方法生产并大量施用工业氮肥，大幅度提高了农作物的产量。但当前，包括我国在内的众多国家，氮肥用量已经远远超过了作物高产的需要，氮肥过量施用产生了一系列的负面影响，如土壤板结酸化、水资源污染以及近海赤潮等已经成为不争的事实。与此同时，氮肥的生产也耗费了大量的不可再生能源。因此，在能源短缺、环境日益恶化的今天，少施肥并稳定产量是亟待解决的问题。

除工业氮肥外，生物固氮作用(包括自生、共生和联合固氮三种)为地球生态系统提供了主要的(超过2/3)氮素。而豆科植物与根瘤菌之间的共生固氮，是固氮效率最高、研究最为深入的体系。豆科植物包括大豆、豌豆、鹰嘴豆、绿豆、三叶草和苜蓿等主要的粮食和饲料作物。世界上的豆科植物大约有19,700多种，是世界上第三大被子植物，第二大粮食和饲料作物，其中己知的可以结瘤固氮的约有2,800多种，约占15％。目前，全球豆科植物的种植面积达1.8亿公顷，占地球可耕地面积的12-15％，其每年产量大约为2.47亿吨，约占世界主要农作物产量的25％。豆科植物非凡的共生固氮能力使其成为人类食物蛋白的一个重要来源，同时也是自然界和农业生态系统的主要氮素来源之一。据联合国粮农组织统计，全球每年生物固氮约2亿吨，豆科植物与根瘤菌间的共生固氮量约占65％～80％，提供豆科植物生长发育所需50～100％的氮素。

豆科植物与根瘤菌间的共生固氮是一个对共生双方都有利的过程，共生双方对此过程都有着精细的调控机制。宿主植物为根瘤菌提供其光合作用的产物-碳水化合物，为根瘤菌所需；反之，根瘤菌在根瘤中将空气中的氮气还原为氨，为宿主植物提供生长发育所需的氮源。豆科植物形成根瘤的基本过程包括：1)豆科植物与根瘤菌间早期分子对话：豆科植物的根系分泌类黄酮类的物质到土壤，被特定的根瘤菌感知并激活根瘤菌的转录因子NodD表达，NodD进而激活NodA、B、C的表达并合成一种多糖信号分子，被称作结瘤因子(Nodfactor)。2)植物中的结瘤因子受体(LjNFR1，LjNFR5)感知并识别结瘤因子信号，从而激活根瘤菌侵染和根瘤器官形成两个过程。3)根瘤菌附着在根毛顶端，引起根毛膨胀变形，并包裹根瘤菌，进而宿主植物质膜内陷，形成一管状结构-侵染线，根瘤菌沿着侵染线从表皮细胞向皮层细胞延伸，最后到达根瘤原基，将根瘤菌从侵染线中释放出来，形成可以固氮的类菌体。而根瘤菌能否成功侵入宿主植物，是共生固氮能否完成的限制性步骤之一。

在过去近20年中，利用模式豆科植物百脉根和蒺藜苜蓿，通过大规模遗传突变体的筛选，通过对这些突变体的表型观察及基因的定位和功能的研究，初步建立了结瘤因子信号转导通路，但对根瘤菌侵染的了解还相对较少。

发明内容

本发明的目的在于提供调节根瘤植物的固氮能力的基因及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种调节根瘤植物的固氮能力的方法，所述方法包括：调节根瘤植物中RINRK蛋白的表达。

在一个优选例中，所述方法包括：上调根瘤植物中RINRK蛋白的表达，从而提高根瘤植物的固氮能力，促进根瘤植物与根瘤菌之间的共生固氮。

在另一优选例中，所述的根瘤植物是RINRK蛋白表达不足的植物。

在另一优选例中，所述的RINRK蛋白表达不足包括：RINRK蛋白低表达(如表达量比正常植株低20％或更低)或不表达。

在另一优选例中，所述的上调根瘤植物中RINRK蛋白的表达是：上调根瘤植物的根系中RINRK蛋白的表达。

在另一优选例中，所述的根系包括：根毛和根瘤。

在另一优选例中，所述上调植物中RINRK蛋白的表达包括：将RINRK蛋白的编码序列转入植物细胞、组织或器官，从而上调RINRK蛋白的表达。

在另一优选例中，所述方法包括：下调根瘤植物中RINRK蛋白的表达，从而降低根瘤植物的固氮能力，抑制根瘤植物与根瘤菌之间的共生固氮。

在另一优选例中，所述下调植物中RINRK蛋白的表达包括：下调或敲除植物中RINRK基因，或下调植物中RINRK蛋白的表达或活性。

在另一优选例中，所述的根瘤植物是豆科植物。

在另一优选例中，所述的RINRK蛋白的选自下组：

(a)如SEQ ID NO:2氨基酸序列的蛋白；

(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-15个；更佳地1-10个，如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或

(c)与(a)限定的蛋白序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。

在本发明的另一方面，提供一种RINRK蛋白或其编码基因用途，用于调节(包括上调或下调)根瘤植物的固氮能力。

在一个优选例中，所述的RINRK蛋白与结瘤因子受体NFR1、NFR5和/或共生类受体激酶SYMRK相互作用，形成受体复合体并特异的调控根瘤菌的侵染过程，从而调节根瘤植物的固氮能力。

在另一优选例中，藉由NIN结合到RINRK蛋的编码基因的启动子区，激活RINRK的表达。

在另一优选例中，所述的根瘤植物是豆科植物。

在本发明的另一方面，提供一种RINRK蛋白或其编码基因用途，用于作为鉴定根瘤植物的固氮能力的分子标记。

在一个优选例中，若经检测植物组织中RINRK蛋白表达高于一个特定值，则相对而言，所述植物具有固氮能力或固氮能力强；若经检测植物组织中RINRK蛋白表达低于一个特定值，则相对而言，所述植物的固氮能力弱或没有固氮能力。其中，除非另外说明，所述的“特定值”是指植物中RINRK蛋白表达量的平均值。

在本发明的另一方面，提供一种蛋白复合体，该复合体包括：RINRK蛋白和结瘤因子受体；其中，所述的结瘤因子受体包括：NFR1、NFR5和/或SYMRK。

在本发明的另一方面，提供所述的蛋白复合体的用途，用于调控根瘤菌的侵染过程和根瘤器官发育。

在另一优选例中，所述的RINRK蛋白和结瘤因子受体构成复合体，感知结瘤因子信号，从而调控根瘤菌侵染和根瘤器官发育。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1.rinrk-1早期侵染表型的观察与统计。(A)接种M.loti R7A三周后Gifu与rinrk-1成株植物的表型。(B-E)侵染线表型。接种M.loti R7A/LacZ(或GFP)一星期后，共聚焦显微镜观察野生型根毛内形成正常的侵染线(B)，而rinrk-1中只形成了很多侵染点(E)和少量弥散的侵染(C)，F图为接M.loti R7A/lacZ后7天和14天的侵染事件的统计结果(n>15)。标尺为1cm(A)，20μm(B-E)。

图2.rinrk-1突变体根瘤表型观察及根瘤数目统计。(A)野生型与rinrk-1接种M.loti 3-6周后典型根瘤。(B-D)根瘤切片，(B)为野生型接种3周后根瘤，(C-D)分别是rinrk-1接种3周和5周后根瘤切片。(E)野生型与rinrk-1平均根瘤数目(±SE,n>20)。

图3.rinrk-1的图位克隆及突变位点，RINRK基因及蛋白结构。(A)利用网站http://www.kazusa.or.jp/lotus/index.html提供的SNP引物进行了图位克隆。(B)rinrk-1的突变位点。(C)RINRK基因结构，RINRK包括2个外显子，一个内含子。(D)RINRK蛋白结构，N-端具有一个信号肽和3个LRR结构域，C-端胞内具有一Ser/Thr激酶域。

图4.互补实验。在rinrk-1中表达RINRK基因能够回复rinrk-1突变体的表型。(A，C)rinrk-1中表达空载体对照，没有正常可以固氮的根瘤形成。(B，D)rinrk-1中表达RINRK基因，形成可以固氮的粉红色根瘤。(A，B)白光显微观察，(C，D)红色荧光显微观赏，表明所观察根系转基因成功。标尺＝5mm。

图5.突变体rinrk-1中早期侵染结瘤Marker基因转录水平检测。用荧光半定量PCR来检测野生型(实线)和rinrk-1(虚线)中的marker基因LjNIN(A)，LjNPL(B)，LjENOD40-1(C)和LjRbohA(D)在接菌后3、7、14天的表达情况。

图6.NIN与NPL启动子在突变体rinrk-1中的表达模式。(A)pNIN::GUS表达在野生型与rinrk-1突变体中，接种M.loti 7天后染色观察。(B)pNPL:GUS在野生型与rinrk-1中的表达情况。接种M.loti R7A 2、7、14天后染色3小时或过夜，检测NPL的表达模式。标尺＝150μm。

图7.转录因子NIN直接调控RINRK的表达。(A)通过荧光半定量PCR来检测RINRK在nin-1和野生型中接种M.loti R7A后0、4、7天的转录水平，(**p<0.05，t-test)。(B)烟草转录激活实验表明NIN可以激活RINRK。(C)EMSA实验检测NIN与RIRNK的启动子结合情况。(D-G)pRINRK-GUS在野生型(D，E)和nin-1(F，G)中的表达模式，接种M.loti R7A 5天后进行GUS染色观察RINRK启动子的活性。标尺＝500μm(D,E)，100μm(F，G)。

图8.RINRK的表达模式。(A，B)荧光定量PCR研究表明结瘤因子(NF)和M.loti都可以诱导RINRK的表达。(A)10nM的结瘤因子处理12，24，48小时后的RINRK诱导表达，(B)接种M.loti R7A后1,3,7,14天的RINRK诱导表达情况。(C-H)RINRK启动子启动GUS检测RINRK在百脉根中的时空表达模式，其中(C-E)接种M.loti R7A后5天，RINRK特异表达在受侵染的根毛及表皮细胞，(F-H)接菌14天后，RINRK表达在幼小根瘤和成熟根瘤中(F),切片显微观察发现，RINRK表达在幼小根瘤的所有细胞层(G)，而在成熟根瘤中，RINRK只表达在没有根瘤菌的根瘤器官外层，紫红色为根瘤菌。标尺＝50μm(C-E)，200μm(F)，200μm(G)和150μm(H)。

图9.RINRK蛋白的亚细胞定位。(A)RINRK-GFP(绿色荧光)和细胞膜marker(pm-rkCD3-1007，红色荧光)共表达在烟草细胞中，共聚焦显微镜观察，表明RINRK定位在细胞膜上，与质膜marker很好的共定位。对应的下排图片是0.5M NaCl处理了6分钟的质壁分离结果，箭头指向质壁分离。(B,C)RINRK-GFP表达在百脉根根中，显微观察表明RINRK定位于根与根毛的质膜上。标尺＝10μm(A)，100μm(B)，50μm(C)。

图10.RINRK与共生受体相互作用在酵母体系中。(A)Split-ubiquitin酵母双杂交系统检测全长的RINRK与NFR1、NFR5和SYMRK之间的互作情况。其中CubG-LjSYMREM1andNub-NFR1的互作为正对照。(B)Gal4酵母双杂交体系检查RINRK与NFR1、NFR5和SYMRK相互作用的结构域。RINRK的胞外LRR域与NFR1、NFR5和SYMRK的胞外LysM结构域可以相互作用SV40和p53的互作为正对照，SV40and Lam的互作为负对照。

图11.植物体内检测RINRK与NFR1、NFR5和SYMRK之间的相互作用。(A,B)免疫共沉淀检测RINRK与NFR1、NFR5和SYMRK可以相互作用。RIRNK的全长(RINRK-Flag)以及RINRK的胞外域(RINRK-N-Flag)与NFR1、NFR5和SYMRK共表达在烟草中，通过免疫共沉淀和westernblot检测它们之间的互作情况。(B)双分子荧光互补实验(BiFC)检测RINRK可以与NFR1、NFR5、SYMRK相互作用，而不能与EPS受体EPR3相互作用。标尺＝25μm。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，发现一个新的编码LRR类受体激酶的基因，命名为RINRK基因。RINRK基因可以调节根瘤植物的固氮能力，从而可以将RINRK基因应用于植物的培育中，选育出改良的植物新品种；或者，可以将RINRK基因应用于研究非豆科植物结瘤并固氮的科学问题。

豆科植物与根瘤菌间共生固氮对环境和作物产量来说都非常重要，研究共生固氮的机制有助于解决两方面的问题，一方面可以提高豆科植物自身的固氮效率，另一方面为探索非豆科植物共生固氮的潜能提供科学依据。目前本领域对豆科植物共生固氮的分子机理的了解还很有限，如结瘤因子信号途径中各信号分子的作用机理，宿主植物是如何调控侵染线的形成及根瘤器官的发育等。本发明发现了一个全新的类受体激酶，其能调控根瘤菌的侵染，本发明人将该基因命名为RINRK(Rhizobia Infection Receptor-likeKinase)，其突变体的侵染线不能正常形成，从而只能形成不能固氮的无效根瘤。

如本文所用，所述的“根瘤植物(作物)”是指具有根瘤或能够产生根瘤的植物。较佳的，所述的根瘤植物是豆科植物。例如，所述的豆科植物选自：百脉根，苜蓿、大豆、豌豆、花生、菜豆、绿豆、赤豆、蚕豆、豇豆、紫云英、甘草或黄芪。

本发明所述的RINRK蛋白还包括RINRK蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的RINRK蛋白相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；如5个，3个)保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；如5个，3个)氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白等。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

任何一种RINRK蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，RINRK蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种蛋白，其仍然能保持全长的RINRK蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长RINRK蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长RINRK蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

在本发明中，术语“RINRK蛋白”指具有RINRK蛋白活性的SEQ ID NO:2序列的蛋白。该术语还包括具有与RINRK蛋白相同功能的、SEQ ID NO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；如5个，3个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。

编码RINRK蛋白或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列(编码序列)也可以应用到本发明中。编码成熟RINRK蛋白的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的序列基本上相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质，但与SEQ ID NO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

术语“编码基因”可以是包括编码所述蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

上述多核苷酸的变异体也是可用的，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白或蛋白的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。

应理解，虽然本发明的RINRK基因优选获自豆科植物，但是获自其它植物的与该RINRK基因高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

包含所述编码序列的载体，以及用所述的载体或RINRK蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞也包括在本发明中。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含RINRK蛋白编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。包含上述的适当编码序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞通常是植物细胞。转化植物一般可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法等；优选的是农杆菌法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得相对于野生型而言性状发生改变的植物。

基于本发明人的新发现，本发明提供了所述的RINRK蛋白或其编码基因的用途，用于调节(包括上调或下调)植物固氮能力，调节根瘤植物与根瘤菌之间的共生固氮。在一种方式下，上调根瘤植物中RINRK蛋白的表达，从而提高根瘤植物的固氮能力，促进根瘤植物与根瘤菌之间的共生固氮。在另一种方式下，下调根瘤植物中RINRK蛋白的表达，从而降低根瘤植物的固氮能力，抑制根瘤植物与根瘤菌之间的共生固氮。因此，可基于RINRK蛋白对于植物性状的影响作用来改变植物，从而达到根据实际生产需要改良植物品质的目的。

本发明还涉及RINRK蛋白或其编码基因的上调剂或下调剂(如反义的RINRK基因或如miRNA)及其用途。由于RINRK的上调剂或下调剂可调节RINRK的表达和/或调节RINRK的活性等，因此，所述的RINRK的上调剂或下调剂也可通过对RINRK的影响来调节植物性状，从而达到改良植物的目的。

任何可调节RINRK蛋白的活性、调节RINRK蛋白的稳定性、促进或抑制RINRK蛋白的表达、延长或减少RINRK蛋白有效作用时间、或促进或降低RINRK基因的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于调节植物固氮能力的有效物质。

在得知了所述的RINRK蛋白的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的RINRK蛋白的表达。比如可通过一定的途径将携带RINRK编码基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的RINRK蛋白。此外，也可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低RINRK蛋白的表达或使之缺失表达，比如将携带反义RINRK基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达RINRK蛋白；或将RINRK基因进行敲除。

作为本发明的一种实施方式，将RINRK蛋白的编码基因通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述RINRK蛋白的植物细胞中，使所述的植物细胞表达RINRK蛋白。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得过量表达RINRK蛋白的植物。优选的，利用农杆菌转化法将RINRK蛋白的编码基因或反义基因转入植物中。

如本文所用，所述的正向连接是指：RINRK的编码基因与表达载体的连接是正义的连接，即编码基因按照5’→3’的方向连接于载体上。通常，RINRK的编码基因位于表达载体中启动子的下游，也即启动子的3’端下游连接该编码基因的5’端。所述的编码基因是可操作性地连接到表达载体上的。所述的“操作性连接”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

如本文所用，所述的反向连接是指：RINRK的编码基因与表达载体的连接是反义的连接，即编码基因按照3’→5’的方向连接于载体上。通常，RINRK的编码基因位于表达载体中启动子的下游，也即启动子的3’端下游连接该编码基因的3’端。

可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。其它增加RINRK表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强RINRK的表达。或者通过增强子来增强该RINRK基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35s启动子、水稻、玉米的Ubi启动子等。

本发明还涉及利用RINRK蛋白或其编码基因作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用RINRK蛋白或其编码基因作为一种分子标记，通过检测植物中RINRK蛋白的表达情况，早期确定植物的固氮能力。

此外，本发明还提供了一种蛋白复合体，该复合体包括：RINRK蛋白和结瘤因子受体；其中，所述的结瘤因子受体包括：NFR1、NFR5和/或SYMRK。所述的RINRK蛋白和结瘤因子受体构成复合体，感知结瘤因子信号，从而调控根瘤菌侵染和根瘤器官发育。本发明的蛋白复合体可以应用于研究根瘤菌侵染过程的机理机制，进而应用于研究非豆科植物结瘤并固氮的问题。

本发明首次公布了RINRK的研究进展，发现RINRK与结瘤因子受体相互作用，形成受体复合体并特异调控根瘤菌侵染过程，这对共生固氮机理的研究开辟了新的视角，对本发明人以后彻底解开共生固氮机制来说也具有非常积极的意义。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、RINRK编码一个LRR类受体激酶

本发明对模式豆科植物百脉根(Lotus japonicus)通过甲基磺酸乙酯诱变，筛选到一个侵染线有缺陷的突变体。对该突变体的表型进行了详细的观察与统计。

1、rinrk-1的共生表型的观察

接种百脉根的根瘤菌Mesorhizobium lotiR7A到该突变体幼苗(发芽后7天的幼苗)。三周后，野生型与突变体成株植物生长无显著性差异(图1，A)。对其根瘤观察却发现野生型能够形成粉色可以固氮的根瘤(图2，A)，而同时期突变体只有白色根瘤器官的形成(图2，A)。对这些根瘤切片分析后发现，野生型中根瘤菌能够正常定植，而突变体中没有根瘤菌的存在(图2，B-E)，这表明根瘤菌可能没有正常地侵入宿主植物。

进一步对早期侵染事件观察发现，野生型植物接菌后7天，能形成大量正常的侵染线(图1，B，F)，但是突变体基本不能形成正常的侵染线(图1，C，E，F)，大多数根瘤菌被包裹在根毛卷曲内，偶尔在根毛中有一些弥散的根瘤菌(图1，C)。

上述结果表明，该突变体能够感知根瘤菌分泌的结瘤因子信号诱导根毛卷曲变形，但是侵染线不能正常形成。

2、目的基因的确定

本发明人将该突变体与Lotus burttii杂交，获得F1代植物，接种根瘤菌后能够形成正常的根瘤，表明该表型是隐性基因突变引起的。对F1自交获得的F2代植物接种观察后发现野生型与突变体表型比为3:1，表明该突变体是单基因控制的。最后结合图位克隆与测序的方法，定位了该基因，是一LRR类受体激酶内的一个碱基发生突变，从而导致该蛋白提前终止(图3，A-D)。

进一步将SEQ ID NO:1及上游的启动子部分(SEQ ID NO:3)克隆到pUB-GW-GFP表达载体上，并通过发根转化方法，转化该突变体，获得的转基因突变体中，侵染的缺陷不再产生，并形成可以固氮的粉色根瘤(图4)。因此，突变体中丧失的功能被回补。

对该蛋白的结构进行分析，发现该蛋白编码一个富亮氨酸受体激酶LRR-RLK(Leucine Rich Repeat-receptor like kinase)，胞外有一个信号肽(SP，signalpeptide)和三个LRR结构域，中间有一个跨膜域，胞内为类受体激酶(图3C-D)。根据其蛋白结构以及其突变体在根瘤菌侵染过程中的表型，本发明人将该基因重新命名为RINRK(Rhizobia Infection Receptor-like Kinase)，该突变体也重新命名为rinrk-1。

3、共生特异的报告基因诱导表达依赖于RINRK

在共生固氮过程中，根瘤菌诱导一系列基因的表达，调控根瘤菌的侵染和根瘤器官的形成。本发明人通过荧光实时定量PCR技术，研究这些报告基因的诱导表达是否依赖于RINRK的存在。研究发现，根瘤菌诱导表达的NIN，NPL，ENOD40和RbohA等基因，在rinrk-1突变体中不能正常被诱导表达(图5A-D)。

进一步地，将proNIN:GUS和proNPL:GUS表达在野生型与rinrk-1突变体中，接种根瘤菌后发现，NIN启动子(为NIN基因ATG前2200bp)与NPL启动子(为NPL基因ATG前880bp)能够被根瘤菌诱导，特异驱动GUS表达在侵染区的根毛及根瘤中，但在rinrk-1突变体中NIN与NPL虽然还能够驱动表达，但表达量显著低于野生型中(图6A，B)，这说明RINRK是共生特异报告基因诱导表达所需，表明RINRK能作为一种信号组分，调控根瘤菌早期侵染过程。

4、共生特异转录因子NIN直接激活RINRK的表达

RWP-RK类转录因子NIN是第一个被鉴定出来的共生特异的基因，它特异调控根瘤菌侵染和根瘤器官发育。对RINRK启动子分析发现，在RINRK启动子中存在着保守的NIN的结合位点。EMSA实验表明NIN可以直接结合到RINRK的启动子区域(图7C)，而且烟草中的转录激活实验也表明NIN蛋白可以激活pRINRK-GUS的表达(图7B)。

进一步地，通过qRT-PCR分析表明根瘤菌诱导RINRK的表达在nin-1突变体中受到了明显的抑制(图7A)，proRINRK:GUS在nin-1突变体中几乎没有表达(图7D-G)。

这些实验结果证明，NIN能够直接结合到RINRK的启动子区，激活RINRK的表达。结合之前NIN的诱导表达也依赖于RINRK的存在(图5A与图6A)，表明RINRK与NIN之间可能存在一个正反馈调节过程。

实施例2、RINRK表达模式的研究

结瘤因子(NF)是从根瘤菌M.loti R7A中分离纯化出来的脂壳多糖。这里，本发明人将NF均匀地喷洒到植物根上，处理12-24hr后，取植物的根并提取RNA。

本发明人利用荧光实时定量PCR分析了RINRK是否受根瘤菌或结瘤因子的诱导。研究表明，处理结瘤因子(NF)12小时，RINRK的表达就开始上调，24小时后表达量进一步提高，这表明结瘤因子能够诱导RINRK的表达(图8A)。而接种根瘤菌M.loti R7A后，RINRK的表达量也显著上调(图8B)，这表明结瘤因子和根瘤菌都能诱导RINRK的表达。

为了进一步探索RINRK的时空表达模式，本发明人构建了RINRK启动子融合GUS报道基因，发根转化将其表达在野生型植物的根中，接种M.loti R7A lacZ 5、14天后，取材染色观察。结果表明，接菌5天后RINRK表达在受侵染的根毛(图8C，D)和表皮细胞(图8E)中，接菌14天后表达在幼嫩的瘤里(图8F～G)以及成熟瘤中未侵染的外围细胞中(图8H)。

通过RINRK-GFP构建，对RINRK的蛋白亚细胞定位进行了观察。首先，本发明人在烟草中表达RINRK-GFP，发现RINRK表达在细胞膜上，与细胞膜标记分子(PM-RFP)很好地重合在一起；用0.5M NaCl处理烟草细胞6分钟后再观察，发现质壁分离后RINRK依旧在细胞膜上表达，进一步说明了RINRK定位于细胞膜上(图9A)。同时，本发明人也将RINRK-GFP表达在百脉根的根中，显微观察表明，RINRK定位于根和根毛的细胞膜上(图9B-C)。

综上所述，RINRK表达在细胞膜上，是一个膜定位的蛋白。

实施例3、RINRK与结瘤因子受体相互作用，形成受体复合体

由于RINRK编码一定位于细胞膜上的类受体激酶，也是一些早期侵染结瘤的报告基因诱导表达所需，而结瘤因子受体NFR1、NFR5及共生类受体激酶SYMRK也都定位于细胞膜上，形成蛋白复合体感知结瘤因子信号从而调控根瘤菌侵染和根瘤器官发育。因此，本发明人推测RINRK是否是作为该受体复合体中的一个组分，传递结瘤因子信号从而调控根瘤菌侵染。为了验证这个假设，本发明人首先通过split-ubiquitin酵母双杂系统来检测RINRK能否与NFR1、NFR5、SYMRK相互作用。研究表明，RINRK可以与NFR1、NFR5、SYMRK蛋白相互作用的(图10A)。进一步的Gal4酵母双杂交实验表明RINRK的胞外部分(extro-domain)可以分别与NFR1、NFR5和SYMRK的胞外域相互作用(图10B)。双分子荧光互补实验也验证了RINRK能够与NFR1、NFR5和SYMRK的互作(图11C-F)。

最后，本发明人通过免疫共沉淀来进一步验证了RINRK与NFR1、NFR5和SYMRK的互作的真实性(图11A-B)。研究发现RINRK的全长都能够通过免疫共沉淀来检测到与NFR1、NFR5和SYMRK的互作，而RINRK的胞外域只检测到了与NFR5和SYMRK的互作。

综上，本发明人通过了多种实验体系和多种实验方法验证了RINRK能够与受体NFR1、NFR5和SYMRK之间进行互作，表明RINRK与结瘤因子受体形成复合体，进而调控根瘤菌的侵染过程。

讨论

豆科植物与根瘤菌间的共生固氮过程不仅能为宿主植物提供充足的氮素，还能通过轮作和互作等栽培方式，为其他非豆科作物提供氮源。尽管这是一种古老而有效的方式，但豆科植物为什么能够与根瘤菌共生互作，从而形成可以固定氮素的根瘤，其分子机制还了解的非常有限。在根瘤菌侵染中起作用的基因目前报道的主要为细胞骨架相关(NAP、PIR、SCARN和ARPC1)和细胞壁重排等功能型基因，及一些功能未知的蛋白。本发明第一次报道了RINRK类受体激酶，与结瘤因子受体NFR1、NFR5和SYMRK相互作用，形成受体复合体并特异的调控根瘤菌的侵染过程，这也是共生固氮研究中发现的第一个侵染特异的信号组分。这些结果表明不同于其他侵染相关的蛋白，RINRK很可能是作为一个信号元件，传递结瘤因子信号，从而调控根瘤菌侵染的过程。而RINRK激酶域并不保守，并不具有激酶活性，因此它很可能是通过与其他蛋白相互作用，来调控侵染线的形成过程。

通过对RINRK启动子表达模式的研究，本发明人也有新的发现。首先在根瘤菌早期侵染过程中，RINRK的启动子表达于根毛、表皮以及幼嫩的根瘤中，而在成熟的根瘤中RINRK表达于根瘤的外围区域，这种表达模式也与之前的报道很不一样，因此对于RINRK的启动子开发利用也非常有意义。

NIN作为一个重要的转录因子调控根瘤菌侵染和根瘤器官的发育，根据不同的实验方法证明了NIN能直接结合到RINRK的启动子中激活RINRK的表达，实验也证明了RINRK对于NIN的诱导也是重要的，因此本发明人首次证明了RINRK与NIN之间存在一个正反馈机制，这对根瘤菌侵染机制的研究提供了新思路。

综上所述，RINRK基因作为一个新发现的LRR-RLK，在根瘤菌侵染过程中起作用，本发明具有极高的创新性与应用潜能。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 调节根瘤植物的固氮能力的基因及其应用

<130> 171524

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1881

<212> DNA

<213> 百脉根(Lotus japonicus)

<400> 1

atgagcctaa aaccattctg ggcactcttg attcccattt ttatgtcttt tctgatggct 60

aattctgagg aacaagtggt ggtgaaggcc ttggtgaaat tcatggaaaa acttgcacca 120

gagaatggat caaaaaatgc catgtggggt tggaacctca cttctgatcc atgcactgat 180

cactggcatg gtgtgatctg ctactcaaac aaccaatatg tgaagaacat tattcttgag 240

aatctcaaat tcagcggggt tgttgatgcg aattctcttt gcgtagcgaa aagtatccaa 300

atacttagcc tgaggaacaa caatttgcag ggtttgatat ctgaggatat aggaaattgc 360

aagctcttga ctcacttgct cttaagtggg aaccgattct ccggcgatct tcctctttct 420

gttgctgaat tgaagaactt gaagcggctt catgttaatg acaactactt cactggacag 480

cttcctaaca tggctcgcat ttcgagcttg atatcatttc ttgctcaaaa caacaacttc 540

tctggtgaaa ttcctgattt tcagttctcg aatctcgatg cattcaatgt ctccaacaac 600

aagttaactg gtcaagttcc tgatgtcaga ggaagatttc atgcagaaag cttttctggt 660

aatgctaact tgtgtggaaa gccactttca aaggcatgtc caaatcctcc acaatcacat 720

gtgaagaaag acaagaaatc attcagtgag gatcttccaa tttattcagg ttacataatt 780

ctaagcttca ttctcctgct tttcttagtc tataaatgta tgaggaaatg ccagacaaaa 840

gaaaaagcat tggttgctga aaagaaggac atggcagaag atactagtgg tgataacaac 900

aaggctagtg aaacttcaat ttccattaat ggatctaaga attggctgaa tgggtttaaa 960

tccgagtgtt cgttgacatc attggaaagt gggatgacta catctggtct tgttcttttt 1020

tcgagtcgga ggctgagagg gatgcaattt gaggacttgc ttagtgctcc tgctgagttg 1080

attaggagag gaaaacatgg aagcctctac aaggttatgc ttgacaatgg gatggtgttg 1140

gcagtgaaga ggatcaagga ttggggaatt tcgaagcagg attttcagag aaggatgaac 1200

atgatagcag atgtgaagca tccacttgtc atgccacctg tcgcatacta ttgctctcag 1260

caagagaagc ttctggcata tgagtttctg cagaatggta gcctcttcat gttactctat 1320

ggatctcaaa gtgggaactc tcttgactgg ggaagcagac taaatgttgc tgcaaaggta 1380

tctaaggctt tggcatatat gcatgaggag ctcagtgaga gtggaatagc acatggtaac 1440

ttaaaatcaa gtaacatttt gtttgacaag aatatggatc cgcgaataag cgaatatggc 1500

ctaatggtag ctgaagatga ctccatttct cgtaagaaaa gtcgggataa cagaaacccg 1560

attgcagcca ccttcaaagc tgatgtatat gcctttggtg tgatgcttct ggagctgctt 1620

acagggaaag tagttaagaa tgatggattc gatctggttc aatgggtgga ttcagtggtc 1680

agagaggaat ggactgtgga agtttttgac aagttcctaa tctcacaaag tatttctgaa 1740

gagaggatga tgaacttgtt gcagatagca ttaaaatgca taagtgcttc tccaaatgat 1800

aggccaagta tgagtcaagt tgcagtgatg acaaatgcat tgaaagagga agatgaaaaa 1860

tccatatcat ttgacacatg a 1881

<210> 2

<211> 626

<212> PRT

<213> 百脉根(Lotus japonicus)

<400> 2

Met Ser Leu Lys Pro Phe Trp Ala Leu Leu Ile Pro Ile Phe Met Ser

1 5 10 15

Phe Leu Met Ala Asn Ser Glu Glu Gln Val Val Val Lys Ala Leu Val

20 25 30

Lys Phe Met Glu Lys Leu Ala Pro Glu Asn Gly Ser Lys Asn Ala Met

35 40 45

Trp Gly Trp Asn Leu Thr Ser Asp Pro Cys Thr Asp His Trp His Gly

50 55 60

Val Ile Cys Tyr Ser Asn Asn Gln Tyr Val Lys Asn Ile Ile Leu Glu

65 70 75 80

Asn Leu Lys Phe Ser Gly Val Val Asp Ala Asn Ser Leu Cys Val Ala

85 90 95

Lys Ser Ile Gln Ile Leu Ser Leu Arg Asn Asn Asn Leu Gln Gly Leu

100 105 110

Ile Ser Glu Asp Ile Gly Asn Cys Lys Leu Leu Thr His Leu Leu Leu

115 120 125

Ser Gly Asn Arg Phe Ser Gly Asp Leu Pro Leu Ser Val Ala Glu Leu

130 135 140

Lys Asn Leu Lys Arg Leu His Val Asn Asp Asn Tyr Phe Thr Gly Gln

145 150 155 160

Leu Pro Asn Met Ala Arg Ile Ser Ser Leu Ile Ser Phe Leu Ala Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Phe Ser Gly Glu Ile Pro Asp Phe Gln Phe Ser Asn Leu

180 185 190

Asp Ala Phe Asn Val Ser Asn Asn Lys Leu Thr Gly Gln Val Pro Asp

195 200 205

Val Arg Gly Arg Phe His Ala Glu Ser Phe Ser Gly Asn Ala Asn Leu

210 215 220

Cys Gly Lys Pro Leu Ser Lys Ala Cys Pro Asn Pro Pro Gln Ser His

225 230 235 240

Val Lys Lys Asp Lys Lys Ser Phe Ser Glu Asp Leu Pro Ile Tyr Ser

245 250 255

Gly Tyr Ile Ile Leu Ser Phe Ile Leu Leu Leu Phe Leu Val Tyr Lys

260 265 270

Cys Met Arg Lys Cys Gln Thr Lys Glu Lys Ala Leu Val Ala Glu Lys

275 280 285

Lys Asp Met Ala Glu Asp Thr Ser Gly Asp Asn Asn Lys Ala Ser Glu

290 295 300

Thr Ser Ile Ser Ile Asn Gly Ser Lys Asn Trp Leu Asn Gly Phe Lys

305 310 315 320

Ser Glu Cys Ser Leu Thr Ser Leu Glu Ser Gly Met Thr Thr Ser Gly

325 330 335

Leu Val Leu Phe Ser Ser Arg Arg Leu Arg Gly Met Gln Phe Glu Asp

340 345 350

Leu Leu Ser Ala Pro Ala Glu Leu Ile Arg Arg Gly Lys His Gly Ser

355 360 365

Leu Tyr Lys Val Met Leu Asp Asn Gly Met Val Leu Ala Val Lys Arg

370 375 380

Ile Lys Asp Trp Gly Ile Ser Lys Gln Asp Phe Gln Arg Arg Met Asn

385 390 395 400

Met Ile Ala Asp Val Lys His Pro Leu Val Met Pro Pro Val Ala Tyr

405 410 415

Tyr Cys Ser Gln Gln Glu Lys Leu Leu Ala Tyr Glu Phe Leu Gln Asn

420 425 430

Gly Ser Leu Phe Met Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Ser Gly Asn Ser Leu

435 440 445

Asp Trp Gly Ser Arg Leu Asn Val Ala Ala Lys Val Ser Lys Ala Leu

450 455 460

Ala Tyr Met His Glu Glu Leu Ser Glu Ser Gly Ile Ala His Gly Asn

465 470 475 480

Leu Lys Ser Ser Asn Ile Leu Phe Asp Lys Asn Met Asp Pro Arg Ile

485 490 495

Ser Glu Tyr Gly Leu Met Val Ala Glu Asp Asp Ser Ile Ser Arg Lys

500 505 510

Lys Ser Arg Asp Asn Arg Asn Pro Ile Ala Ala Thr Phe Lys Ala Asp

515 520 525

Val Tyr Ala Phe Gly Val Met Leu Leu Glu Leu Leu Thr Gly Lys Val

530 535 540

Val Lys Asn Asp Gly Phe Asp Leu Val Gln Trp Val Asp Ser Val Val

545 550 555 560

Arg Glu Glu Trp Thr Val Glu Val Phe Asp Lys Phe Leu Ile Ser Gln

565 570 575

Ser Ile Ser Glu Glu Arg Met Met Asn Leu Leu Gln Ile Ala Leu Lys

580 585 590

Cys Ile Ser Ala Ser Pro Asn Asp Arg Pro Ser Met Ser Gln Val Ala

595 600 605

Val Met Thr Asn Ala Leu Lys Glu Glu Asp Glu Lys Ser Ile Ser Phe

610 615 620

Asp Thr

625

<210> 3

<211> 2063

<212> DNA

<213> 百脉根(Lotus japonicus)

<400> 3

acaatgaggt acggagaaag tggatctcct tgccgaagac ctctatgggg aataaaagaa 60

tctgttctat ccccattaaa gcacacttga tacctgcaag aagacacaca ttgcataata 120

agagagcaca tatgatcatc taacccaatg agcctcaagg tatcaaggag aaaggaccag 180

ctcaatctat catacacctt ctctagatcc actttcatag ccatccaccc cttagctccc 240

ttcctagatt gcatggaatg gaaaacctcc tgagcaataa ttatgttatc tgaactgtgt 300

ctcccaggaa caaaactgca ctggttagga gagaccaagt cccccatagc tgatctcaac 360

ctattagtaa taactttggt aatcgtcttg taaatcacat tacacagaga gatgggccta 420

taatgtgtaa ttctctatgg actatctatc ttaggtatca gaacaatcaa ggtctcattc 480

acctggctga taagagaagg gtccgcaaaa caccgcatga caaagtcaat tgttgagtca 540

cccacaatat gccattgaga gtgaaaaaag ataggttgaa acccatctgg gtccggggct 600

ttgagaggac ccatgctgaa cgctgcatcc ttaatctcac tagcatcaaa ctctgcttgg 660

aagtgattca gaaaagctgc agggagggga gaaaaggacg tagaacaagt aagactccct 720

ccaccaccct catccatgta gctatccctg aaaaaaacaa aggtaagctc cttaagagca 780

ttataatcag tgattagatc accatcctga ctcaaaagag cctcaatctt gttcctcttt 840

ctacgaacca gagttgctgt atggaaaaaa gaagtgttcc gatctccaaa ttggagccat 900

aaacacctca atttctgcat ccaaaggagc tccacctgaa ccaagacggc gttacactcc 960

ttccaaagag acctctgaag ggtatctagg cccctatcaa aggccatgct aagcctctga 1020

ttaatcccct caagcctcct aatcaaccgc ctctttcttt tgagaatatt gccaaacacc 1080

tcctggttcc aaacaagcac atcctcacgg aagccattag aagagtgaag ccagtcatca 1140

cctcgctgcc atgactcctc caccacccgg ggaaaatcat catgggttaa ctagctagcc 1200

agaaacctga acgggcgcac aaagtgacgc tgctccacaa tgcctgaaga tgccataaga 1260

ataggcttat gatcagactt caactgaggg cgcaccaact acttttcttc ttattttgat 1320

ttatgactcg aatctttgat tattttgaag tatattttat gatatatcaa atatgagttc 1380

attattcaat ttatgacaca atttttctta caatacataa aatcatttga ttcaggattt 1440

gtaaaatgtc tttcccattc acaaaatgaa tttcaatttg ataaccatgg tttcaacccg 1500

ttttttccca aattatattc ttgtaaagta taagtaaaca ctaactttaa cattttcttt 1560

ctaacactct cttattaatt ggttaaaatt tatgtaggat tcactgaaaa tatggatctc 1620

atgtccaact tagtggtgat cagattaatc aaataataaa caagagaata tttgaaagtg 1680

agtgttaaaa gttaatgttg ttaccactcc tcttatattc ttttagttta gattgaagtg 1740

tctactgtct agtaagtaac tttgactaag acagatccaa catagaaaat gcttcattca 1800

tactagtcca tgcaggcgag ccaagcaatt ccattccttt tcaaaacgcc ggcagctaaa 1860

atagctaata ttgttacttt ctgccctttg gctcatttcc acagcttctc accatcaatg 1920

gcatcttcaa cattacacaa cataatttcc atttcattac ccattcggca atgtattgag 1980

acacccttaa gctatgaacc ttgttaccct tcttcattga ctatactaac ttcacaattc 2040

aacaaaaaaa tacagagcaa aaa 2063

Claims

1.一种调节根瘤植物的固氮能力的方法，其特征在于，所述方法为：调节根瘤植物中RINRK蛋白的表达；所述根瘤植物是豆科的根瘤植物；所述RINRK蛋白是氨基酸序列如SEQID NO:2所示的蛋白。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法为：上调根瘤植物中RINRK蛋白的表达，从而提高根瘤植物的固氮能力，促进根瘤植物与根瘤菌之间的共生固氮。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的根瘤植物是RINRK蛋白表达不足的植物。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的上调根瘤植物中RINRK蛋白的表达是：上调根瘤植物的根系中RINRK蛋白的表达。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述上调植物中RINRK蛋白的表达包括：

将RINRK蛋白的编码序列转入植物细胞、组织或器官，从而上调RINRK蛋白的表达。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的组织或器官包括：根系。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的根系包括：根毛和根瘤。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，利用SEQ ID NO:3所示序列的启动子或其活性片段作为启动子。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法为：下调根瘤植物中RINRK蛋白的表达，从而降低根瘤植物的固氮能力，抑制根瘤植物与根瘤菌之间的共生固氮。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述下调植物中RINRK蛋白的表达为：下调或敲除植物中RINRK基因，或下调植物中RINRK蛋白的表达或活性。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述下调植物中RINRK蛋白的表达为：下调植物根系中RINRK蛋白的表达。

12.一种RINRK蛋白或其编码基因用途，用于调节根瘤植物的固氮能力；所述根瘤植物是豆科的根瘤植物；所述RINRK蛋白是氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白。

13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的RINRK蛋白与结瘤因子受体NFR1、NFR5和/或共生类受体激酶SYMRK相互作用，形成受体复合体并特异的调控根瘤菌的侵染过程，从而调节根瘤植物的固氮能力。

14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，藉由NIN结合到RINRK蛋白的编码基因的启动子区，激活RINRK的表达。

15.一种RINRK蛋白或其编码基因用途，用于作为鉴定根瘤植物的固氮能力的分子标记；所述根瘤植物是豆科的根瘤植物；所述RINRK蛋白是氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白。