CN108721636A - 联硒键连接的具有双重响应性的药物递送材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种联硒键连接的具有双重响应性的药物递送材料及其制备方法和应用，该材料采用3,3’‑二硒代二丙酸关环后形成的酸酐与端羟基聚(N‑异丙基丙烯酰胺)、紫杉醇先后进行酯化反应而成，制备简单，条件温和；该材料可在水溶液中自组装为由联硒键连接的“核(紫杉醇)‑壳(聚(N‑异丙基丙烯酰胺))”胶束。由于含有疏水的紫杉醇单元，通过物理负载药物可大幅提高药物含量。本发明的药物递送材料稳定性好，对癌变部位的温度和所含的高浓度氧化、还原性物质可灵敏响应，因含有微量元素硒而具有良好的生物相容性，在体内抗癌活性研究中获得了良好的治疗效果。因此，可作为新型药物递送体系用于肿瘤治疗。

Description

联硒键连接的具有双重响应性的药物递送材料及其制备方法 和应用
技术领域
本发明属于生物医药材料技术领域，具体涉及到一种生物相容性好、可对癌变组织温度及其所含的氧化、还原性物质灵敏响应、稳定性好的药物递送材料，以及该材料的制备方法和抗癌应用。
背景技术
近年来，具有良好生物相容性、稳定性和高药物含量的药物递送体系成为药物控释领域的研究热点。硒作为人体所需微量元素之一，其生物相容性好，且联硒键较二硫键键能低，因此，可对癌变部位所含的高浓度氧化、还原性物质快速响应。然而，含硒药物载体存在水溶性、稳定性差，合成方法有限，修饰难，分子量分布宽等问题，极大的限制了其实际应用。此外，药物含量低的载体无法获得良好的抑瘤效果。传统药物载体的稳定性差，在到达病灶部位前药物会提前泄露，对人体正常组织产生严重损伤，同时会引起多重耐药性，不利于肿瘤治疗。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种联硒键连接的对温度、氧化还原性物质灵敏响应的药物递送材料，解决了含硒药物载体溶解性、稳定性差，制备困难，分子量分布宽的问题，并为该材料提供一种制备方法和应用。
解决上述技术问题所采用的药物递送材料的结构式如下所示：
式中m的取值为5～25，优选7～21。
上述药物递送材料的制备方法由下述步骤组成：
1、制备3,3’-二硒代二丙酸酐
将式I所示的3,3’-二硒代二丙酸(根据文献“Cheng,G.；He,Y.；Xie,L.；Nie,Y.；He,B.；Zhang,Z.；Gu,Z.Development of a reduction-sensitive diselenide-conjugated oligoethylenimine nanopaticulate system as a genecarrier.International Journal of Nanomedicine,2012,7,3991–4006”合成)与乙酰氯回流，得到式II所示的3,3’-二硒代二丙酸酐。
2、制备端羟基聚(N-异丙基丙烯酰胺)
将N-异丙基丙烯酰胺溶于无水四氢呋喃，加入2-巯基乙醇和偶氮二异丁腈，在氮气保护下55～65℃聚合20～28小时，反应液浓缩后分离提纯，得到式III所示的端羟基聚(N-异丙基丙烯酰胺)。
3、制备含联硒键的端羧基聚(N-异丙基丙烯酰胺)
将步骤1得到的3,3’-二硒代二丙酸酐与步骤2制备的端羟基聚(N-异丙基丙烯酰胺)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入4-二甲氨基吡啶和三乙胺，在氮气保护下30～40℃反应20～28小时，反应结束后，分离提纯，得到式IV所示的含联硒键的端羧基基聚(N-异丙基丙烯酰胺)。
4、制备药物递送材料
在氮气保护下，将步骤3得到的含联硒键的端羧基聚(N-异丙基丙烯酰胺)与N-羟基琥珀酰亚胺溶于无水二氯甲烷，然后加入N,N-二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液，在室温下活化20～28小时，分离除掉不溶物，收集滤液；在氮气保护下，将所得滤液加入紫杉醇的无水二氯甲烷溶液中，并加入4-二甲氨基吡啶，室温反应44～52小时，反应结束后分离纯化产物，得到基于化学共价作用的含联硒键的聚(N-异丙基丙烯酰胺)-紫杉醇药物递送材料，即联硒键连接的具有双重响应性的药物递送材料。
上述步骤1中，优选3,3’-二硒代二丙酸与乙酰氯的摩尔比为1:14～15。
上述步骤2中，优选2-巯基乙醇与N-异丙基丙烯酰胺、偶氮二异丁腈于的摩尔比为1:12～13:0.04～0.13。
上述步骤3中，优选端羟基聚(N-异丙基丙烯酰胺)与3,3’-二硒代二丙酸酐、4-二甲氨基吡啶、三乙胺的摩尔比为1:1.5～2.5:1.5～2.5:1.5～2.5。
上述步骤4中，优选含联硒键的端羧基聚(N-异丙基丙烯酰胺)与N-羟基琥珀酰亚胺、N,N-二环己基碳二亚胺、紫杉醇、4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:6～10:1～3:1～3:1～3。
本发明药物递送材料在制备抗癌药物紫杉醇载药胶束中的用途。具体方法为：将药物递送材料与紫杉醇按照质量比3:1的比例溶于N,N-二甲基甲酰胺中并搅拌过夜，装入截留分子量为1000的透析袋中，置于蒸馏水中透析72小时，其间每3小时更换蒸馏水一次。结束后低速离心除去游离紫杉醇，冷冻干燥后获得具有温度、氧化还原响应性的高药物含量的紫杉醇载药胶束。
本发明的有益效果如下：
本发明制备了一种由联硒键连接的具有温度、氧化还原响应性和高紫杉醇含量的药物递送材料，该材料可在水环境中自组装为核壳结构的胶束，临界胶束浓度小、稳定性好，对癌变部位的温度及高浓度还原型谷胱甘肽和活性氧可快速响应。此外，还可通过药物的物理包覆以获得高药物含量的药物载体。体外细胞毒性和体内抗癌试验结果表明，该材料生物相容性好，可应用于癌症治疗领域。
本发明由联硒键连接的具有温度、氧化还原响应性和高紫杉醇含量的药物递送材料水溶性好，分子量分布窄，且制备简便，条件温和。
附图说明
图1是实施例1制备的含联硒键的端羧基聚(N-异丙基丙烯酰胺)的核磁共振氢谱图。
图2是紫杉醇的核磁共振氢谱图。
图3是实施例1制备的联硒键连接的聚(N-异丙基丙烯酰胺)-紫杉醇药物递送材料的核磁共振氢谱图。
图4是实施例1制备的联硒键连接的聚(N-异丙基丙烯酰胺)-紫杉醇药物递送材料的红外谱图。
图5是实施例1制备的联硒键连接的聚(N-异丙基丙烯酰胺)-紫杉醇药物递送材料的凝胶渗透色谱曲线。
图6是实施例1制备的联硒键连接的聚(N-异丙基丙烯酰胺)-紫杉醇药物递送材料所形成胶束的临界胶束浓度分析图。
图7是实施例1制备的联硒键连接的聚(N-异丙基丙烯酰胺)-紫杉醇药物递送材料所形成胶束的低临界溶液温度分析图。
图8是实施例1制备的联硒键连接的聚(N-异丙基丙烯酰胺)-紫杉醇药物递送材料所形成胶束的透射电子显微镜图片。
图9是实施例1制备的联硒键连接的聚(N-异丙基丙烯酰胺)-紫杉醇药物递送材料所形成胶束未经过氧化还原(曲线A)、经10mM谷胱甘肽室温还原24小时(曲线B)、经100μM双氧水室温氧化24小时(曲线C)的粒径分布图以及实施例4所得载药胶束的粒径分布图(曲线D)。
图10是紫杉醇和实施例4所得载药胶束的细胞毒性图。
图11是实施例1制备的联硒键连接的聚(N-异丙基丙烯酰胺)-紫杉醇药物递送材料所形成的胶束在pH 7.4PBS 37℃(曲线A)、pH 5.6PBS 42℃(曲线B)、含有10mM谷胱甘肽的pH 5.6PBS 42℃(曲线C)、含有100μM双氧水的pH 5.6PBS 42℃(曲线D)的释放曲线。
图12是实施例1制备的联硒键连接的聚(N-异丙基丙烯酰胺)-紫杉醇药物递送材料所形成胶束的粒径(曲线a)、其中药物载药量随时间变化趋势(曲线b)图。
图13是肿瘤体积随治疗时间变化趋势图，其中曲线A是紫杉醇治疗后肿瘤体积变化趋势、曲线B是0.9％生理盐水治疗后肿瘤体积变化趋势、曲线C是PBS治疗后肿瘤体积变化趋势、曲线D是实施例1制备的联硒键连接的聚(N-异丙基丙烯酰胺)-紫杉醇药物递送材料所形成胶束治疗后肿瘤体积变化趋势。
图14是小鼠体重随治疗时间变化趋势图，其中曲线A是紫杉醇治疗后肿瘤小鼠体重变化趋势、曲线B是0.9％生理盐水治疗后小鼠体重变化趋势、曲线C是PBS治疗后小鼠体重变化趋势、曲线D是实施例1制备的联硒键连接的聚(N-异丙基丙烯酰胺)-紫杉醇药物递送材料所形成胶束治疗后小鼠体重变化趋势。
图15是治疗后小鼠主要器官切片染色图(放大倍数：200倍)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
1、制备3,3’-二硒代二丙酸酐
将0.912g(3mmol)式I所示的3,3’-二硒代二丙酸与3mL(42.4mmol)乙酰氯在65℃下回流反应2小时，反应结束后，旋转蒸发并在过量乙醚中沉淀数次，收集沉淀物30℃真空干燥24小时，得到式II所示的3,3’-二硒代二丙酸酐，产率49.3％。
2、制备端羟基聚(N-异丙基丙烯酰胺)
将5.66g(50mmol)N-异丙基丙烯酰胺溶于16mL无水四氢呋喃中，进行“冷冻-抽真空-解冻”操作三次后，加入293μL(4mmol)2-巯基乙醇和28.3mg(0.172mmol)偶氮二异丁腈，在氮气保护下60℃聚合24小时，反应结束后将反应液浓缩并在过量乙醚中沉淀数次，收集沉淀物室温真空干燥24小时，得到式III-1所示的端羟基聚(N-异丙基丙烯酰胺)，产率91.1％。
3、制备含联硒键的端羧基聚(N-异丙基丙烯酰胺)
将1.171g(0.5mmol)式III-1所示的端羟基聚(N-异丙基丙烯酰胺)和286mg(1mmol)式II所示的3,3’-二硒代二丙酸酐溶于5mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入122mg(1mmol)4-二甲氨基吡啶和140μL(1mmol)三乙胺，在氮气保护下35℃酯化反应24小时，反应结束后将反应液在过量乙醚中沉淀数次，收集沉淀物室温真空干燥至恒重，得到式IV-1所示的含联硒键的端羧基聚(N-异丙基丙烯酰胺)，产率82.3％。
4、制备药物递送材料
在氮气保护下，将262.6mg(0.1mmol)式IV-1所示的含联硒键的端羧基聚(N-异丙基丙烯酰胺)和92.1mg(0.8mmol)N-羟基琥珀酰亚胺溶于6mL无水二氯甲烷，然后逐滴加入4mL含41.3mg(0.2mmol)N,N-二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液，在室温下活化24小时，过滤除去不溶物，收集滤液。将170.8mg(0.2mmol)紫杉醇溶于5mL二氯甲烷，在氮气保护下逐滴将滤液加入反应体系，并加入24.4mg(0.2mmol)4-二甲氨基吡啶后，室温反应48小时，反应结束后将反应液用二氯甲烷稀释并用质量分数为1％的HCl水溶液和蒸馏水洗涤，收集有机相并用无水硫酸钠干燥过夜，过滤并浓缩后在过量乙醚中沉淀，沉淀物真空30℃干燥24小时，得到式V-1所示的基于化学共价作用的含联硒键的聚(N-异丙基丙烯酰胺)-紫杉醇药物递送材料，产率31.2％。
图1中3.05、2.72ppm处二硒代二丙酸酐中亚甲基吸收峰、6.51ppm处聚(N-异丙基丙烯酰胺)中-NH的特征吸收峰证明联硒键连接的端羧基聚(N-异丙基丙烯酰胺)的合成；与紫杉醇的核磁谱图(图2)相比，图3中4.73ppm处羟基的特征峰消失同时在5.92ppm处出现次甲基的特征峰，且与联硒键相连的亚甲基的特征峰依然存在，说明含联硒键的聚(N-异丙基丙烯酰胺)-紫杉醇药物递送材料成功制备。如图4所示，所制备的药物递送材料中-C-Se-、-Se-Se-键的特征吸收峰分别位于524、800cm-1，1724cm-1处属于羰基吸收峰，1549、3295cm-1处的吸收峰为聚(N-异丙基丙烯酰胺)中-C-H、-N-H伸缩振动引起，紫杉醇中所含苯环结构的特征峰位于3046、1643cm-1，上述特征峰位进一步说明含联硒键的聚(N-异丙基丙烯酰胺)-紫杉醇药物递送材料成功制备。如图5所示，实施例1制备的药物递送材料的凝胶渗透色谱曲线的峰形对称、无肩峰，说明材料的合成过程可控，纯度高，其重均、数均分子量分别为9433和6724g mol-1，多分散性指数(PDI)为1.403。
实施例2
1、制备3,3’-二硒代二丙酸酐
将0.912g(3mmol)式I所示的3,3’-二硒代二丙酸与3mL(42.4mmol)乙酰氯在65℃下回流反应2小时，反应结束后，旋转蒸发并在过量乙醚中沉淀数次，收集沉淀物30℃真空干燥24小时，得到式II所示的3,3’-二硒代二丙酸酐，产率49.3％。
2、制备端羟基聚(N-异丙基丙烯酰胺)
将5.66g(50mmol)N-异丙基丙烯酰胺溶于16mL无水四氢呋喃中，进行“冷冻-抽真空-解冻”操作三次后，加入293μL(4mmol)2-巯基乙醇和56.6mg(0.345mmol)偶氮二异丁腈，在氮气保护下60℃聚合24小时，反应结束后将反应液浓缩并在过量乙醚中沉淀数次，收集沉淀物室温真空干燥24小时，得到式III-2所示的端羟基聚(N-异丙基丙烯酰胺)，产率78.3％。
3、制备含联硒键的端羧基聚(N-异丙基丙烯酰胺)
将0.888g(0.5mmol)式III-2所示的端羟基聚(N-异丙基丙烯酰胺)和286mg(1mmol)式II所示的3,3’-二硒代二丙酸酐溶于5mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入122mg(1mmol)4-二甲氨基吡啶和140μL(1mmol)三乙胺，在氮气保护下35℃酯化反应24小时，反应结束后将反应液在过量乙醚中沉淀数次，收集沉淀物室温真空干燥至恒重，得到式IV-2所示的含联硒键的端羧基聚(N-异丙基丙烯酰胺)，产率73.6％。
4、制备药物递送材料
在氮气保护下，将206mg(0.1mmol)式IV-2所示的含联硒键的端羧基聚(N-异丙基丙烯酰胺)和92.1mg(0.8mmol)N-羟基琥珀酰亚胺溶于4.5mL无水二氯甲烷，然后逐滴加入4mL含41.3mg(0.2mmol)N,N-二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液，在室温下活化24小时，过滤除去不溶物，收集滤液。将170.8mg(0.2mmol)紫杉醇溶于5mL二氯甲烷，在氮气保护下逐滴将滤液加入反应体系，并加入24.4mg(0.2mmol)4-二甲氨基吡啶后，室温反应48小时，反应结束后将反应液用二氯甲烷稀释并用质量分数为1％的HCl水溶液和蒸馏水洗涤，收集有机相并用无水硫酸钠干燥过夜，过滤并浓缩后在过量乙醚中沉淀，沉淀物真空30℃干燥24小时，得到式V-2所示的基于化学共价作用的含联硒键的聚(N-异丙基丙烯酰胺)-紫杉醇药物递送材料，产率30.2％。
实施例3
1、制备3,3’-二硒代二丙酸酐
将0.912g(3mmol)式I所示的3,3’-二硒代二丙酸与3mL(42.4mmol)乙酰氯在65℃下回流反应2小时，反应结束后，旋转蒸发并在过量乙醚中沉淀数次，收集沉淀物30℃真空干燥24小时，得到式II所示的3,3’-二硒代二丙酸酐，产率49.3％。
2、制备端羟基聚(N-异丙基丙烯酰胺)
将5.66g(50mmol)N-异丙基丙烯酰胺溶于16mL无水四氢呋喃中，进行“冷冻-抽真空-解冻”操作三次后，加入293μL(4mmol)2-巯基乙醇和84.9mg(0.517mmol)偶氮二异丁腈，在氮气保护下60℃聚合24小时，反应结束后将反应液浓缩并在过量乙醚中沉淀数次，收集沉淀物室温真空干燥24小时，得到式III-3所示的端羟基聚(N-异丙基丙烯酰胺)，产率67.6％。
3、制备含联硒键的端羧基聚(N-异丙基丙烯酰胺)
将0.435g(0.5mmol)式III-3所示的端羟基聚(N-异丙基丙烯酰胺)和286mg(1mmol)式II所示的3,3’-二硒代二丙酸酐溶于3mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入122mg(1mmol)4-二甲氨基吡啶和140μL(1mmol)三乙胺，在氮气保护下35℃酯化反应24小时，反应结束后将反应液在过量乙醚中沉淀数次，收集沉淀物室温真空干燥至恒重，得到式IV-3所示的含联硒键的端羧基聚(N-异丙基丙烯酰胺)，产率84.6％。
4、制备药物递送材料
在氮气保护下，将199mg(0.1mmol)式IV-3所示的含联硒键的端羧基聚(N-异丙基丙烯酰胺)和92.1mg(0.8mmol)N-羟基琥珀酰亚胺溶于6mL无水二氯甲烷，然后逐滴加入4mL含41.3mg(0.2mmol)N,N-二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液，在室温下活化24小时，过滤除去不溶物，收集滤液。将170.8mg(0.2mmol)紫杉醇溶于5mL二氯甲烷，在氮气保护下逐滴将滤液加入反应体系，并加入24.4mg(0.2mmol)4-二甲氨基吡啶后，室温反应48小时，反应结束后将反应液用二氯甲烷稀释并用质量分数为1％的HCl水溶液和蒸馏水洗涤，收集有机相并用无水硫酸钠干燥过夜，过滤并浓缩后在过量乙醚中沉淀，沉淀物真空30℃干燥24小时，得到式V-3所示的基于化学共价作用的含联硒键的聚(N-异丙基丙烯酰胺)-紫杉醇药物递送材料，产率40.3％。
实施例4
实施例1制备的药物递送材料在制备抗癌药物紫杉醇载药胶束中的用途，具体方法如下：
将30mg药物递送材料和10mg紫杉醇溶于10mL N,N-二甲基甲酰胺中并搅拌12小时，装入截留分子量为1000的透析袋中，置于蒸馏水中透析72小时，其间每3小时更换蒸馏水一次。结束后低速离心除去游离紫杉醇，冷冻干燥24小时后得到本发明药物递送材料包载紫杉醇的载药胶束，其载药量、包覆率及药物含量见表1所示。同时以未包覆紫杉醇直接由实施例1制备的药物递送材料形成的胶束做空白对照。
表1实施例1制备的药物递送材料物理包覆紫杉醇后所得载药胶束的相关参数
样品 物理包覆载药量 物理包覆率 化学结合药物含量 药物总量
实施例1 35.46％ 72.25％ 18.58％ 54.04％
本发明载药胶束是由化学连接和物理包覆两种方法获得高药物含量。其中，通过化学连接法使紫杉醇含量达到18.58％，然后经物理包覆使药物总含量达到54.04％，包覆率高达72.25％。由此表明，实施例1制备的由联硒键连接的具有温度、氧化还原响应性的药物递送材料也可作为药物载体，且通过物理包覆紫杉醇，该药物递送体系中药物含量有了极大的提高。
由图6可见，所得递送材料形成的胶束的临界胶束浓度小(23.9mgL-1)，说明胶束的稳定性好，可在体内长循环时稳定存在。由图7可见，该胶束的低临界溶液温度(LCST)为41.1℃，该温度高于人体正常体温且与癌变组织温度接近，表明在低于41.1℃时作为胶束外壳的聚(N-异丙基丙烯酰胺)呈舒展态，保护其内部的紫杉醇在体循环中不会泄露；当环境温度高于41.1℃时，聚(N-异丙基丙烯酰胺)外壳收紧，通过挤压使其内部的紫杉醇释放至病灶部位。由图8可见，所得胶束具有核壳球状结构，粒径约为200nm，该数值较动态光散射测定的结果小，原因是制样过程中已将胶束中水分蒸发完全，胶束处于脱水状态。由图9的动态光散射测定结果可见，所得胶束的粒径为254.25±5.15nm，经过10mM谷胱甘肽室温还原24小时后粒径减小至129.30±3.20nm，如曲线B所示；由曲线C可知，胶束经过100μM双氧水室温氧化24小时后粒径变为109.50±8.27nm，上述结果表明氧化、还原过程使得胶束中所含的联硒键断裂，紫杉醇脱离原有的结构。曲线D所示的包覆紫杉醇后所得载药胶束的粒径为491.62±15.38nm，这一数值较未包覆药物的胶束粒径大，说明紫杉醇载药胶束的成功制备。
为了证明本发明的有益效果，发明人对上述实施例4中由实施例1制备的药物递送材料形成的胶束(以下简称空白胶束)以及包覆紫杉醇后形成的载药胶束进行了各种实验，具体实验情况如下：
1、细胞毒性实验
将紫杉醇和实施例4制备的载药胶束分别配制成浓度范围为0.1～20μg mL-1和1～500μg mL-1的溶液。采用MTT分析法检测载药胶束和紫杉醇的细胞毒性，具体测试方法为：将肝癌细胞HepG2细胞株接种至含10％胎牛血清的DMEM培养基上并在5％CO2湿润环境37℃培养，待细胞生长至指数阶段后按照1×105/孔的密度接种在96孔板并用200μL含有10％胎牛血清的DMEM培养液在5％CO2氛围下37℃培养24小时，然后用新鲜的含有200μL不同浓度载药胶束的DMEM培养液替换现有培养基并继续培养48小时。结束后，细胞用PBS冲洗三次，180μL DMEM培养基和MTT原液(5mg mL-1)加入96孔板，继续培养4小时。取150μL DMSO加入培养基后震荡10分钟。将接种在DMEM培养基且在同样条件下培养后的HepG2细胞作为对照组。溶液吸光度用通用酶标仪(Bio-Rad laboratories(UK)Ltd.)在570nm处读取，每孔结果检测六次并表示为平均值±S.D.值。细胞存活率按照如下公式计算：
细胞存活率(％)＝(OD待测样/OD对照样)×100％
OD对照样：不加胶束的光密度
OD待测样：加入载药胶束后所得数值。
由图10可见，所得载药胶束在1～500μg mL-1的浓度范围内细胞毒性为20％，说明HepG2细胞中的谷胱甘肽刺激导致一定量的药物释放出来，同时也对正常组织表现出可忽略的副作用和良好的生物相容性；而用0.1～20μg mL-1紫杉醇培养的细胞，细胞生长的抑制效果明显，其半抑制浓度为1.9μg mL-1。上述结果表明，所得载药胶束可对在还原性生理环境产生响应，随后释放的药物可有效的缓解紫杉醇的提前释放等行为所带来的副作用。
2、药物释放实验
将空白胶束分别模拟人体正常组织和肿瘤部位进行体外释放，具体实施方法为：将4mg空白胶束分别用4mL pH值为7.4或5.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液(PBS)溶解，装入截留分子量为1000的透析袋，置于200mL含相应pH值的缓冲液中，在释放开始时向透析外液中不加或加入10mM谷胱甘肽或100μM双氧水以模拟癌变组织生理微环境。在间隔时间内取一定量透析外液并补充等量同pH值的缓冲液，测试取出液体的紫外吸光度，测试结果见图11，其中曲线A是载药胶束在pH 7.4、37℃时模拟人体正常组织生理环境下的药物释放曲线；曲线B是载药胶束在pH 5.6、42℃时的释放曲线；曲线C、D依次是载药胶束在含10mM谷胱甘肽、100μM双氧水42℃时模拟癌变组织生理环境的药物释放曲线。
由图11中曲线A可见，空白胶束在模拟正常机体组织生理环境下92小时内紫杉醇的释放量仅为19％，说明少量紫杉醇的释放不会给正常组织造成副作用。通过对比，曲线B所示的仅在42℃的温度刺激下，紫杉醇的释放量略有增加，达到26％；在42℃、10mM谷胱甘肽双重刺激下，紫杉醇释放了44％；在42℃、100μM双氧水双重刺激下，药物释放量约为33％；结果表明，在单一的温度刺激下，药物的释放量低于双重刺激下的紫杉醇释放量，且在模拟癌变组织生理环境的释放量均高于模拟正常组织的释放结果，证实该胶束可有效改善紫杉醇对正常组织的副作用，且能实现药物在病变组织的靶向定点释放。
3、稳定性试验
将空白胶束在暗处9℃保存30天，监测其流体动力学直径和紫杉醇含量随时间的变化情况。由图12可见，所得空白胶束在暗处9℃保存30天，胶束粒径和其中的紫杉醇含量基本保持不变，证明该材料具有良好的生物稳定性。
4、体内抑瘤试验
将小鼠乳腺癌细胞4T1接种至补充有10％胎牛血清的RPMI1640培养基上，在含5％CO2的湿润氛围下37℃培养。雄性BALB/c小鼠(体重：20±2g)在55％湿度的氛围下室温饲养。将负荷4T1肿瘤的小鼠分为四组，每组三只，按照紫杉醇浓度为5mg kg-1的剂量在第0、3、6、9、12、15天时分别静脉注射游离紫杉醇、空白胶束、0.9％生理盐水、PBS缓冲溶液。治疗期间每三天测定一次肿瘤体积和小鼠体重，结果见图13和14。在肿瘤体积达到100mm3时开始治疗，肿瘤体积根据如下公式计算：体积＝(长度×宽度2)/2，在治疗结束后，收集四组小鼠的心、肝、脾、肺、肾，将其浸泡在福尔马林中一段时间后用石蜡固化，随后切割为5μm厚的切片并用苏木精和伊红染色，用光学显微镜拍摄组织照片进行病理学分析，结果见图15。
从图13中曲线B、C看出，对照组(0.9％生理盐水和PBS缓冲溶液治疗组)肿瘤体积表现出明显的增长趋势，在曲线A中紫杉醇具有不明显的抑瘤效果，由于只有有限的药物被肿瘤渗透吸收。从曲线D发现，空白胶束表现出更好的肿瘤抑制效果，空白胶束在受到肿瘤部位的温度及其所含的高浓度氧化、还原物质刺激后使得紫杉醇靶向释放至病灶部位，起到杀死癌细胞的作用。如图14曲线D所示，经过空白胶束治疗的小鼠体重有显著增长，通过对比，采用紫杉醇治疗的小鼠体重增长(曲线A)较少，是由于药物在病灶部位累积量少和药物自身毒性所导致，从曲线B、C发现，生理盐水和PBS缓冲液不具备治疗肿瘤的效果。如图15所示，除紫杉醇治疗组小鼠的心脏损伤外，其余治疗组小鼠的主要器官未见明显异常，说明本发明药物输送材料形成的胶束可避免紫杉醇对正常器官的副作用，且能实现药物的靶向释放，最终达到治疗肿瘤的目的。

Claims (8)

1.一种联硒键连接的具有双重响应性的药物递送材料，其特征在于该药物递送材料的结构式如下所示：
式中m的取值为5～25。
2.根据权利要求1所述的药物递送材料，其特征在于：m的取值为7～21。
3.一种权利要求1所述的药物递送材料的制备方法，其特征在于该方法由下述步骤组成：
(1)制备3,3’-二硒代二丙酸酐
将式I所示的3,3’-二硒代二丙酸与乙酰氯回流，得到式II所示的3,3’-二硒代二丙酸酐；
(2)制备端羟基聚(N-异丙基丙烯酰胺)
将N-异丙基丙烯酰胺溶于无水四氢呋喃，加入2-巯基乙醇和偶氮二异丁腈于反应瓶内，在氮气保护下55～65℃聚合20～28小时，反应液浓缩后分离提纯，得到式III所示的端羟基聚(N-异丙基丙烯酰胺)；
(3)制备含联硒键的端羧基聚(N-异丙基丙烯酰胺)
将3,3’-二硒代二丙酸酐与端羟基聚(N-异丙基丙烯酰胺)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入4-二甲氨基吡啶和三乙胺，在氮气保护下30～40℃反应20～28小时，反应结束后，分离提纯，得到式IV所示的含联硒键的端羧基聚(N-异丙基丙烯酰胺)；
(4)制备药物递送材料
在氮气保护下，将含联硒键的端羧基聚(N-异丙基丙烯酰胺)与N-羟基琥珀酰亚胺溶于无水二氯甲烷，然后加入N,N-二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液，在室温下活化20～28小时，分离除掉不溶物，收集滤液；在氮气保护下，将所得滤液加入紫杉醇的无水二氯甲烷溶液中，并加入4-二甲氨基吡啶，室温反应44～52小时，反应结束后分离纯化产物，得到基于化学共价作用的含联硒键的聚(N-异丙基丙烯酰胺)-紫杉醇药物递送材料，即联硒键连接的具有双重响应性的药物递送材料。
4.根据权利要求3所述的药物递送材料的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述3,3’-二硒代二丙酸与乙酰氯的摩尔比为1:14～15。
5.根据权利要求3所述的药物递送材料的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述2-巯基乙醇与N-异丙基丙烯酰胺、偶氮二异丁腈于的摩尔比为1:12～13:0.04～0.13。
6.根据权利要求3所述的药物递送材料的制备方法，其特征在在于：步骤(3)中，所述的端羟基聚(N-异丙基丙烯酰胺)与3,3’-二硒代二丙酸酐、4-二甲氨基吡啶、三乙胺的摩尔比为1:1.5～2.5:1.5～2.5:1.5～2.5。
7.根据权利要求3所述的药物递送材料的制备方法，其特征在在于：步骤(4)中，所述含联硒键的端羧基聚(N-异丙基丙烯酰胺)与N-羟基琥珀酰亚胺、N,N-二环己基碳二亚胺、紫杉醇、4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:6～10:1～3:1～3:1～3。
8.权利要求1所述的药物递送材料在制备抗癌药物紫杉醇载药胶束中的用途。
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