CN108719210A - 一种检测农药对蜜蜂胚胎发育影响的试验方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定农药对蜜蜂胚胎发育影响的试验方法，包括，控制蜂王产卵至便携式蜜蜂收集装置中，结合室内毒理学暴露方法，分析评价农药对蜜蜂胚胎发育的影响。本发明通过搭建由立式隔王箱和蜜蜂胚胎收集板组成便携式蜜蜂收集装置，克服了人工移虫耗时长、胚胎易损伤、存活率低的问题，满足了试验对生物样本数量和质量的要求，提高了试验方法的准确性；通过将免人工移虫技术与室内毒理学暴露方法相结合，通过利用SPSS软件Probit模型分析试验结果，方法科学，操作简单，能完成相应的毒性测定工作，理论和实际意义重大。

Description

一种检测农药对蜜蜂胚胎发育影响的试验方法

技术领域

本发明涉及农药毒性检测技术领域，具体涉及一种测定农药对蜜蜂胚胎发育影响的试验方法。

背景技术

研究表明，世界上超过80％的重要作物都可通过昆虫授粉增加产量，蜜蜂作为世界上最重要的一种授粉昆虫，不仅在维持植物多样性和生态平衡方面发挥着不可替代的作用，而且对农业生产和农业经济发展也具有极大的贡献。据统计，蜜蜂等授粉昆虫通过作物授粉增加的产值占全球农产品总值的9.5％。

近年来，不断发展的蜂群崩溃综合症使得一些国家和地区的蜂群数量不断下降，极大的影响了蜜蜂产业的发展。造成蜜蜂种群数量下降的原因有很多，其中，农药的使用被认为是造成蜜蜂数量下降的一个重要因素。

在农业生产中，当使用农药等化学药剂杀灭害虫保护作物的同时，不可避免的会对蜜蜂等传粉昆虫造成影响。一般而言，采集蜂是最容易接触农药等风险因子而产生中毒的，但是，当采集蜂将含有残留药剂的花粉、蜜露带回蜂巢作为蜂粮储存或被其他蜜蜂直接食用时，残留药剂对整个蜂巢不同级型的蜜蜂均可能产生风险。蜜蜂胚胎是蜜蜂可能接触农药的早期生理形态，而在卵期接触药剂后对蜜蜂后续生活史可能产生不同程度的影响，在室内评估农药等化合物在蜜蜂胚胎期暴露处理对其后续生长发育的影响试验中，蜜蜂胚胎的人工收集难度大、易损伤，死亡率高且且耗时长，不能满足常规试验对生物样本数量和质量的基本要求，因此相关影响试验的研究报道尚不完善。

综上所述，如何在现有的研究基础上，提出一种能避免人工移虫的检测农药对蜜蜂胚胎发育潜在毒性影响的试验方法是本领域亟需解决的关键技术问题。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种测定农药对蜜蜂胚胎发育影响的试验方法。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种测定农药对蜜蜂胚胎发育影响的试验方法，其不同之处在于，控制蜂王产卵至便携式蜜蜂收集装置中，结合室内毒理学暴露方法，分析评价农药对蜜蜂胚胎发育的影响。

在上述技术方案中，所述测定农药对蜜蜂胚胎发育影响的试验方法，包括以下步骤：

S1、构建便携式蜜蜂收集装置，控制蜂王产卵至便携式蜜蜂收集装置中；

S2、将蜜蜂胚胎在室内暴露于农药溶液中，并置于人工气候箱中继续培养，统计不同阶段的蜜蜂胚胎的孵化和死亡情况；

S3、对步骤S2中蜜蜂胚胎的死亡和孵化情况进行分析，利用Probit分析模型评估农药对蜜蜂胚胎发育的影响。

优选地，在上述技术方案中，步骤S1具体包括：

S11、设计搭建由立式隔王箱和蜜蜂胚胎收集板组成的便携式蜜蜂收集装置，所述蜜蜂胚胎收集板包括至少2个胚胎收集盒；

S12、将蜜蜂胚胎收集板置于立式隔王箱内，并转移至健康蜂群的蜂箱中，控制蜂王在立式隔王箱的内侧，使其在蜜蜂胚胎收集板上自由产卵；

S13、蜂王产卵12h后将其移出立式隔王箱，继续保持蜂脾在蜂箱中放置12h，以使蜜蜂胚胎得到工蜂的饲喂和清理。

进一步优选地，在上述技术方案中，所述蜂王的控制产卵时间为12h。

再进一步优选地，移出蜂王后，所述蜜蜂胚胎在蜂箱中生长时间为12h。

优选地，在上述技术方案中，步骤S2具体包括：

S21、配制梯度浓度的农药溶液；

S22、采用微量点滴器将不同浓度的农药溶液分别滴加至各胚胎收集盒的蜜蜂胚胎的上端，并将胚胎收集盒转移至人工气候箱内继续培养；

S23、统计蜜蜂胚胎在72h后的孵化和死亡情况。

进一步优选地，在上述技术方案中，

步骤S22中，还包括，在采用微量点滴器滴加农药溶液前，剔除各胚胎收集盒中明显不健康的蜜蜂胚胎，并统计各胚胎收集盒的剩余胚胎数量，各胚胎收集盒中含有胚胎数目控制为50±10枚为优。

再进一步优选地，在上述技术方案中，步骤S22中，控制各胚胎收集盒的农药溶液滴加的操作时间小于10min。

更进一步优选地，在上述技术方案中，步骤S23具体包括：在采用微量点滴器滴加农药溶液后，每12h观测一次各胚胎收集盒中蜜蜂胚胎的发育和死亡情况，统计滴加农药溶液72h后蜜蜂胚胎的最终孵化率。

优选地，在上述技术方案中，步骤S3中，根据不同浓度的农药溶液对蜜蜂胚胎的发育和死亡试验结果，利用SPSS软件Probit分析模型计算农药对蜜蜂胚胎孵化率的半数抑制中浓度(EC₅₀)，评估其对蜜蜂胚胎发育的毒性作用。

本发明的优点：

(1)本发明所提供的测定农药对蜜蜂胚胎发育影响的试验方法，通过搭建由立式隔王箱和蜜蜂胚胎收集板组成便携式蜜蜂收集装置，从而有效克服了人工移虫耗时长，蜜蜂胚胎易损伤和存活率低的问题，满足了试验对生物样本数量和质量的基本要求，从而提高了检测试验方法的准确性；

(2)本发明所提供的测定农药对蜜蜂胚胎发育影响的试验方法，通过将免人工移虫技术与室内毒理学暴露方法相结合，配合使用微量点滴器精确控制不同浓度的农药溶液的滴加量，进一步提高了蜜蜂胚胎在孵化阶段的发育和死亡试验结果的准确性；

(3)本发明所提供的测定农药对蜜蜂胚胎发育影响的试验方法，通过利用Probit模型计算农药对蜜蜂胚胎孵化率的半数抑制中浓度(EC₅₀)，能有效满足不同农药对蜜蜂胚胎暴露处理的毒理学实验要求，方法科学合理，操作简单可控，能完成相应的风险评估工作，理论和实际意义重大。

附图说明

图1为本发明实施例中测定农药对蜜蜂胚胎发育影响的试验方法的工艺流程图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。

本发明实施例提供了一种测定农药对蜜蜂胚胎发育影响的试验方法，包括以下步骤：

S1、构建便携式蜜蜂收集装置，控制蜂王产卵至便携式蜜蜂收集装置中；

S2、将蜜蜂胚胎在室内暴露于农药溶液中，并置于人工气候箱中继续培养，统计不同阶段的蜜蜂胚胎的孵化和死亡情况；

S3、对步骤S2中蜜蜂胚胎的死亡和孵化情况进行分析，利用Probit分析模型评估农药对蜜蜂胚胎发育的影响。

具体地，步骤S1具体包括：

S11、设计搭建由立式隔王箱和蜜蜂胚胎收集板组成的便携式蜜蜂收集装置，所述蜜蜂胚胎收集板包括至少2个胚胎收集盒；

S12、将蜜蜂胚胎收集板置于立式隔王箱内，并转移至健康蜂群的蜂箱中，控制蜂王在立式隔王箱的内侧，使其在蜜蜂胚胎收集板上自由产卵；

S13、蜂王产卵12h后将其移出立式隔王箱，继续保持蜂脾在蜂箱中放置12h，以使蜜蜂胚胎得到工蜂的饲喂和清理。

详细地，所述便携式蜜蜂收集装置包括立式隔王箱和蜜蜂胚胎收集板，所述蜜蜂胚胎收集板活动套设在所述立式隔王箱内。

所述立式隔王箱至少包括两块侧板和两块端板，所述两块侧板和所述两块端板围成具有中空内腔的箱体结构，所述两块侧板上均匀布设有隔蜂网孔，所述立式隔王箱的顶部为开口结构，所述开口结构上设有起密封作用的抽拉板。

详细地，所述蜜蜂胚胎收集板包括两个配合设置的卡紧框架和卡设在所述卡紧框架内的胚胎收集盒，所述胚胎收集盒的数量至少为2个。

详细地，所述立式隔王箱和所述蜜蜂胚胎收集板可采用有机高分子材料或不锈钢材料制成，其具体尺寸可根据实际检测需要进行调整。

为了达到既能允许工蜂正常出入，保证蜂群的正常清洁和幼虫喂养，又能在工蜂正常造房时将蜂王控制在立式隔王箱的外侧的目的，控制所述隔蜂网孔为直径4-6mm的圆形孔。

详细地，为了确保在检测农药对蜜蜂发育潜在毒性的便携式试验结果的准确性，控制所述胚胎收集盒的深度为5-8mm。

具体地，步骤S2具体包括：

S21、配制不同浓度的吡唑醚菌酯溶液；

S22、采用微量点滴器将不同浓度的农药溶液滴加1μL至各胚胎收集盒的蜜蜂胚胎的顶部，并将处理后的胚胎收集盒转移至人工气候箱内继续培养；

S23、统计蜜蜂胚胎在孵化阶段的发育和死亡情况。

详细地，步骤21中，还包括，准确称取98％吡唑醚菌酯原药51.020mg至50mL容量瓶中，采用丙酮充分溶解后定容至刻度，则得到浓度为1000mg/L的储备液I。随后以丙酮为溶剂，将储备液I逐级稀释至10，50，100，500，1000mg/L，即获得不同浓度的农药试验溶液；设置丙酮为溶剂对照，无处理组为空白对照。每个胚胎收集盒为一个重复，含有的胚胎数目为50±5个/盒，每个处理设置三个重复。

具体地，步骤S22中，还包括，蜜蜂胚胎收集板转移至室内之前在蜂箱中继续生长12h。

详细地，步骤S22中，还包括，在采用微量点滴器滴加农药溶液前，剔除各胚胎收集盒中明显不健康的蜜蜂胚胎，并统计各胚胎收集盒的剩余胚胎数量，各胚胎收集盒中含有胚胎数目控制为50±10枚为优。

详细地，为了减少环境条件变化对胚胎发育的影响，步骤S22中，控制各胚胎收集盒的农药溶液滴加的操作时间小于10min。

详细地，步骤22中，还包括，取出一个胚胎收集盒置于超净工作台上，微量点滴器吸取50μL 10mg/L吡唑醚菌酯药液，排出空气后，向胚胎收集盒中的胚胎顶端逐个滴加1μL药剂，处理完后将其标记清晰并放入人工气候箱内培养，覆盖黑色纱布，设置温度为35±1℃，相对湿度95±2％。依据药液浓度设置，吡唑醚菌酯的最终点滴量为1×10^-2，5×10^-2，0.1，0.5，1.0μg/胚胎。每个处理3个重复，以丙酮为溶剂对照，去离子水为空白对照。

具体地，步骤S23具体包括：在采用微量点滴器滴加农药溶液后，每12h观察一次各胚胎收集盒中蜜蜂胚胎的发育和死亡情况，统计吡唑醚菌酯药剂处理72h后各胚胎收集盒中的最终孵化率。

最终孵化率＝孵化幼虫数/处理胚胎数×100％

具体地，步骤S3具体包括，根据不同浓度的吡唑醚菌酯溶液对蜜蜂胚胎在孵化阶段的发育和死亡试验结果，利用Probit分析模型计算农药对蜜蜂胚胎的半数抑制中浓度，评估其对蜜蜂胚胎发育的影响和毒性作用。

详细地，步骤S3中还包括，不同浓度吡唑醚菌酯药液处理蜜蜂胚胎后，各处理组中蜜蜂胚胎的孵化率结果见附表1。

表1不同浓度吡唑醚菌酯处理组中蜜蜂胚胎的孵化率结果

采用SPSS软件Probit方法分析后，吡唑醚菌酯对蜜蜂胚胎孵化率的半数抑制中浓度为206.650mg/L，95％置信区间为154.150～284.476mg/L，剂量-效应关系的线性方程为Y＝2.23-0.96X，线性相关系数为0.973。

本发明实施例所提供的检测农药对蜜蜂胚胎发育毒性影响的试验方法，设计并搭建了由立式隔王箱和蜜蜂胚胎收集板组成便携式蜜蜂收集装置，有效克服了人工移虫工作量大、耗时长，蜜蜂胚胎易损伤和存活率低的问题，满足了试验对生物样本数量和质量的基本要求，试验方法的准确性高；将免人工移虫技术与室内毒理学暴露方法相结合，配合使用微量点滴器精确控制不同浓度的农药溶液的滴加量，提高了蜜蜂胚胎在孵化阶段的发育和死亡试验结果的准确性；利用SPSS软件Probit模型分析蜜蜂胚胎在不同阶段的发育和死亡的试验结果，计算农药对蜜蜂胚胎孵化率的半数抑制中浓度，方法科学合理，操作简单可控，能完成相应的风险评估工作，理论和实际意义重大。

最后，以上仅为本发明的较佳实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种测定农药对蜜蜂胚胎发育影响的试验方法，其特征在于，控制蜂王产卵至便携式蜜蜂收集装置中，结合室内毒理学暴露方法，分析评价农药对蜜蜂胚胎发育的影响。

2.根据权利要求1所述的试验方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、构建便携式蜜蜂收集装置，控制蜂王产卵至便携式蜜蜂收集装置中；

S2、将蜜蜂胚胎在室内暴露于农药溶液中，并置于人工气候箱中继续培养，统计不同阶段的蜜蜂胚胎的孵化和死亡情况；

S3、对步骤S2中蜜蜂胚胎的死亡和孵化情况进行分析，利用Probit分析模型评估农药对蜜蜂胚胎发育的影响。

3.根据权利要求2所述的试验方法，其特征在于，步骤S1中，具体包括：

S11、设计搭建由立式隔王箱和蜜蜂胚胎收集板组成的便携式蜜蜂收集装置，所述蜜蜂胚胎收集板包括至少2个胚胎收集盒；

S12、将蜜蜂胚胎收集板置于立式隔王箱内，并转移至健康蜂群的蜂箱中，控制蜂王在立式隔王箱的内侧，使其在蜜蜂胚胎收集板上自由产卵；

S13、蜂王产卵12h后将其移出立式隔王箱，继续保持蜂脾在蜂箱中放置12h，以使蜜蜂胚胎得到工蜂的饲喂和清理。

4.根据权利要求1-3任一项所述的试验方法，其特征在于，所述蜂王的控制产卵时间为12h。

5.根据权利要求1-3任一项所述的试验方法，其特征在于，移出蜂王后，所述蜜蜂胚胎在蜂箱中生长时间为12h。

6.根据权利要求2所述的试验方法，其特征在于，步骤S2中，具体包括：

S21、配制梯度浓度的农药溶液；

S22、采用微量点滴器将不同浓度的农药溶液分别滴加至各胚胎收集盒的蜜蜂胚胎的上端，并将胚胎收集盒转移至人工气候箱内继续培养；

S23、统计蜜蜂胚胎在72h后的孵化和死亡情况。

7.根据权利要求6所述的试验方法，其特征在于，步骤S22中，还包括，在采用微量点滴器滴加农药溶液前，剔除各胚胎收集盒中明显不健康的蜜蜂胚胎，并统计各胚胎收集盒的剩余胚胎数量。

8.根据权利要求5所述的试验方法，其特征在于，步骤S22中，控制各胚胎收集盒的农药溶液滴加的操作时间小于10min。

9.根据权利要求4-8任一项所述的试验方法，其特征在于，步骤S23具体包括：在采用微量点滴器滴加农药溶液后，每12h观测一次各胚胎收集盒中蜜蜂胚胎的发育和死亡情况，统计滴加农药溶液72h后蜜蜂胚胎的最终孵化率。

10.根据权利要求2所述的试验方法，其特征在于，步骤S3中，根据不同浓度的农药溶液对蜜蜂胚胎的发育和死亡试验结果，利用SPSS软件Probit分析模型计算农药对蜜蜂胚胎孵化率的半数抑制中浓度，评估其对蜜蜂胚胎发育的毒性作用。