CN104062413A - 一种叶螨生物测定方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明“一种叶螨生物测定方法及其应用”，属于植物虫害防治领域。该方法中，将被供试药剂浸泡过的叶碟放置在相同的供试药剂浸泡过的药管中，然后放入室内饲养的或者田间直接采集的叶螨进行培养，一段时间后计算叶螨的死亡情况从而评估该药剂的对叶螨的毒杀活性，本发明的方法和操作过程具有简便、快速、可靠、实用的特点，解决了现有常用的叶螨生物测定方法中存在的缺陷和不足。

Description

一种叶螨生物测定方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种叶螨生物测定方法，属于植物虫害防治领域。

背景技术

叶螨属节肢动物门(Arthropoda)、蛛形纲(Arachnida)、蜱螨亚纲(Acari)、真螨目(Acariformes)、叶螨总科(Tetranychoidea)，叶螨属(Tetranychus)。叶螨在田间发生种类繁多，如二斑叶螨Tetranychus urticae、朱砂叶螨T.cinnabarinus和截形叶螨T.truncatus等，叶螨分布广泛、寄主植物种类多，是一种世界性的农业害螨。田间防治不及时，常可造成经济损失15％-20％。

生产上对叶螨的防治主要以化学防治措施为主。防治叶螨的高效低毒药剂的筛选基础是基于叶螨生物测定的结果进行评价的。常用的叶螨生物测定方法是联合国粮农组织所推荐使用的标准方法—玻片浸渍法(FAO，1980)，需要用零号毛笔将叶螨背部小心地粘贴在双面胶带上，再浸渍在不同浓度的药液中(唐小凤等，2014)，也是目前很多实验室常用的叶螨生测方法。但该技术明显的缺点是操作技术相对复杂，易对螨体造成损伤，操作者需要进行较长时间的技术练习才能操作成功；而且这种方法主要测试的触杀和内吸性能，而药剂的胃毒特性则不易测试。第二种方法是叶碟喷雾法，该方法是将健康活泼的雌成螨挑于干净的寄主植物叶片做成的叶碟上，待叶螨种群稳定后，将其及叶碟一起置于Potter喷雾塔下进行喷雾处理，而后晾干饲养即可(Tsagkarakou et al.,2009)。该技术的优点是较为接近田间的实际农药施用过程，操作简单，对螨体损伤小，缺点是喷在叶碟上的药液量多少对杀螨效果影响较大，另外仪器相对昂贵，且对于仪器的要求较为严格。叶片残毒法也称为药膜法，是将寄主植物叶片先浸渍于药液中，取出晾干后再将叶螨挑于叶片上，但是药膜的薄厚对于实验结果有一定的影响，而且由于害螨只是通过螨足接触药剂，不能确定具体的施药量，对室内研究来说具有一定的局限性(陈丽丽等，2005)，而且叶螨也常出现逃逸，影响计数。近几年国外学者推荐使用瓶膜法(Residual Coated Vial，简称RCV)(Kwon et al.,2010；Feng et al.,2011；Wanget al.,2014)，但是这种方法在使用过程中，需要从收集叶螨卵开始，采用3-5天内孵化的成螨进行测试(减少其吐丝结网的比例)，因此试虫准备时间较长，同时由于药剂的胁迫压力，叶螨仍会出现应急反应而吐丝、缠绕等，造成的试验误差较大；另外，该方法仅能测试药剂的触杀活性，药剂的胃毒、内吸活性则难以测定。

发明内容

针对上述生物测定方法中存在的问题和缺点，本发明提供一种新的叶螨生物测定方法，技术方案如下：

一种叶螨生物测定方法，包括如下步骤：

(1)配药：将供试药剂配制成设定浓度的药液；

(2)浸管：将所述药液转入管状容器中，使得管状容器完全被药液浸满，不留空隙；

(3)晾管：浸管后倒掉管内药液，将管状容器倒置，室温下晾干；

(4)叶片浸药：将新鲜的寄主植物叶片制成大小均一的圆形叶片，放入所述药液中浸泡，然后室温晾干；

(5)装管：将所述药液浸过的叶片夹入浸管后的所述管状容器中，所述叶片平整斜向且叶背向上放置，然后再放入受试叶螨，盖上管状容器的盖子；

(6)培养箱饲养：将装管后的所述管状容器放置在温度为26±1℃，光暗周期L:D＝16h:8h的昆虫培养箱中饲养；

(7)结果检查：检查受试叶螨的死亡与成活情况，记录其死亡数和成活数。

所述浸管的参数为：室温下，浸泡2个小时。

所述叶片浸药的时间为10秒钟。

所述管状容器为1.5～2ml的塑料离心管；所述叶片的直径为1.5cm的圆形叶片。

每个所述离心管放入30头雌成螨进行生物测定；放入叶螨的方法是将叶螨放入折叠成漏斗形状的称量纸中，叶螨通过漏斗底部小口进入离心管中。

上述任一方法在叶螨生物测定中的应用。

一种筛选有效防治叶螨的药剂的方法，其特征在于：采用上述任一所述的方法；

所述设定浓度指设定为系列梯度浓度；

所述供试药剂为一至多种；

对每种供试药剂的每个设定浓度下的药液进行步骤(1)～(7)的操作，根据步骤7的结果检查筛选出对叶螨有毒杀活性的有效药剂种类，进而明确叶螨对各药剂的敏感度。

本发明提供一种新的叶螨生物测定方法，所述方法不仅在离心管内壁全部涂有药剂，且放置的植物叶蝶也在药液中浸过，因此称为药管浸叶法。该方法能够对药剂可能具有的胃毒、触杀、内吸活性同时进行综合测定。结果显示在测试药剂的杀螨活性时，药剂不同系列浓度与叶螨的死亡率之间的线性关系良好，测试结果可靠。

与用于叶螨生物测定常用的玻片浸渍法相比，本发明的方法操作简单，且不会损伤受试叶螨虫体，减小了因虫体本身损伤导致的试验误差，且能够对药剂的胃毒特性进行测定。与叶碟喷雾法和药膜法相比，所述方法不需要任何昂贵仪器，所用材料常见其成本极其低廉，不同批次试验中每个叶片上的药量相对一致，提高了试验结果的稳定性，且不存在叶螨逃逸、淹死等其它影响试验结果的问题。与瓶膜法(RCV)相比，本发明的药管浸叶法主要具有以下优点：第一，测试所用材料采用实验室内常见的1.5～2ml的塑料离心管，材料易得，且成本低；第二，用药液将离心管浸满无空隙，放置2h，而不需要采用特制的旋转器进行转动1h；第三，药管内加入浸过药液的叶螨寄主植物叶蝶，增加对药剂胃毒作用的测试；第四，测试叶螨的挑取，不需要采用3～5天内孵化的雌成螨，可以采集田间种群进行直接测试，而不担心叶螨吐丝缠绕的问题。

综上，本发明的叶螨生物测定方法具有以下明显的技术优点：(1)简便性：采用药管浸叶法进行叶螨的生物测定，技术操作简便，不需要像采用玻片浸渍法一样反复练习才能掌握其操作步骤；(2)快速性：叶螨可以随时采集随时进行生物测定，不需如瓶膜法(RCV)中必须采用孵化前3-5天的雌成螨进行；(3)可靠性：由于螨体不会受到损伤，且加入了可供叶螨取食的寄主叶片，测试过程中叶螨不会结网，结果检查比较容易，减小了试验误差，提高了测试结果的可靠性和稳定性；(4)实用性：加入可供叶螨取食的浸药叶片可同时测试药剂的胃毒、触杀、内吸活性，解决了常规的玻片浸渍法(Slide-dip method)和瓶膜法(RCV)中主要测试药剂的触杀活性而不能测试其它特性的问题，测试过程与田间叶螨种群的受药过程更为接近，因此试验结果更科学。

附图说明

图1.采用本发明方法获得的阿维菌素的剂量对数值与叶螨死亡率机率值之间的线性关系；

其中，纵坐标表示截形叶螨死亡率的机率值，横坐标表示阿维菌素各测试浓度的对数值。

图2.采用本发明方法获得的哒螨灵的剂量对数值与叶螨死亡率机率值之间的线性关系；

其中，纵坐标表示截形叶螨死亡率的机率值，横坐标表示哒螨灵各测试浓度的对数值。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明进行解释，需要说明的是，本发明的保护范围并不局限于此。

试验材料的来源：

截形叶螨室内相对敏感种群：由南京农业大学植物保护学院洪晓月教授惠赠，从2009年室内饲养至今；由“碧丰”品种的无虫菜豆苗叶片作为寄主进行继代饲养，期间未接触任何杀虫剂，采用培养皿海绵水隔离台法饲养，即在20cm直径的培养皿中放置一层海绵，海绵上放置一层滤纸，滤纸上面正面朝下放置清洁无污染的菜豆叶片，每5天更换一次新鲜叶片；培养箱温度为26±1℃，光周期为L:D＝16h:8h。该种群本实验室亦有保存，申请人声明自申请日起二十年内，可向公众发放用于必要的验证试验。

田间叶螨种群：于2014年6月份采集于北京顺义的黄瓜寄主上，经鉴定为截形叶螨(王少丽等，2013)；室内饲养一代后用于杀虫杀螨剂的生物测定试验。

菜豆叶片：“碧丰”品种的无虫菜豆苗叶片。

供试药剂：

1.8％阿维菌素乳油(北京中农大生物技术股份有限公司产品)；

10％联苯菊酯乳油(拜耳作物科学(中国)公司产品)；

73％克螨特乳油(美国科聚亚公司产品)；

10％溴虫腈悬浮剂(德国巴斯夫股份有限公司产品)；

15％哒螨灵乳油(江苏克胜集团股份有限公司产品)。

本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，或采用本领域常规方法配制而得，可商购获得，规格为实验室纯级即可。

实施例1、药管浸叶法和玻片浸渍法对叶螨种群的生物测定结果比较

分别采用药管浸叶法和玻片浸渍法测定3种杀虫剂对采集于北京顺义地区的田间截形叶螨雌成螨的毒力。

1、采用药管浸叶法进行叶螨的生物测定

(1)配药：在预备试验的基础上，将供试药剂的原药或者制剂配制成5～7个系列浓度梯度，同时以溶剂处理作为对照组CK；

(2)浸管：测试所用离心管为实验室内常见的1.5～2ml的塑料离心管。将各系列浓度梯度的药液转入离心管中进行浸管，保证离心管被全部浸满无任何空隙，每个浓度浸4个离心管(重复)，室温下浸管2个小时；

(3)晾管：浸管2h后，倒掉管内药液，将离心管倒置在一张干净滤纸上，室温下晾干2h，(此时间可根据测试环境湿度的高低而进行调整)；

(4)叶片打孔与浸药：将新鲜的寄主植物叶片(豆苗叶片或花生叶片)打成直径为1.5cm的圆形叶片，分别在每个浓度的药液中浸叶10s，浸叶过程中为避免高浓度药液对低浓度药液的影响，应先浸对照组叶片，然后再从低浓度到高浓度依次进行，最后在干净滤纸上室温晾叶1.5小时；

(5)装管与挑虫：标记离心管后，用干净的小镊子将各叶片夹入已浸相应药液浓度的离心管中，平整斜向且叶背向上放置，该步骤也应先进行对照组，然后从低浓度向高浓度依次进行；把称量纸做成漏斗型，用零号毛笔将叶螨挑放在称量纸上，然后轻弹纸漏斗，叶螨即被弹入离心管中，每管大约接30头雌成螨；

(6)培养箱饲养：盖紧装有试螨的离心管盖子，放置在温度为26±1℃，光暗周期L:D＝16h:8h的昆虫培养箱中饲养；

(7)结果检查：24h(也可根据杀螨剂的特性或者测试目的进行适当调整)后，检查记录测试叶螨的死亡数和成活数，死亡标准是以毛笔尖轻触成螨，其足不动的视为死亡。

2、采用玻片浸渍法进行叶螨的生物测定

(1)将双面胶带剪成2～3cm长，贴在载玻片一端，用镊子揭去双面胶带上的纸片，用零号毛笔挑选大小一致、行动活泼的截形叶螨雌成螨，将其背部粘在双面胶带上，不粘住螨足、螨须和口器，每片胶带粘3行，每行大约粘15头。

(2)在温度为26±1℃、相对湿度为80％左右的人工气候培养箱中放置4h后，在解剖镜下观察，剔除死亡或不太活泼以及体位不正确的叶螨个体。

(3)药剂在预试验的基础上稀释5～7个浓度，将带螨玻片端浸入不同浓度的药液中，轻轻摇动5s后取出，快速用吸水纸吸干螨体及其周围的多余药液。以浸渍清水作为对照处理，每个处理重复4次。

(4)铺一层湿润纱布在一个白色瓷缸内，将浸过药液的玻片平整放置于湿润纱布上，瓷缸上面再覆盖一层湿润纱布，在纱布上面盖上玻璃板，同时确保纱布不会下滑落在带螨玻片上，且能够达到较好的保湿效果。

(5)24h后用双目解剖镜检查结果。用毛笔轻触螨体，以螨足不动者计为死亡，空白对照死亡率在10％以下为有效试验。

3、数据处理

药管浸叶法和玻片浸渍法对测试叶螨雌成螨的b±SE、LC₅₀值及其95％置信区间等采用Polo Plus Version1.0软件进行处理。LC₅₀的95％置信区间重叠则视为差异不显著，不重叠则视为差异显著。试验结果如表1所示，表格中的不同字母代表差异显著。

表1.药管浸叶法和玻片浸渍法测定3种药剂对截形叶螨的毒力

由表1可以看出，采用药管浸叶法和玻片浸渍法对同一种药剂的测试结果不同，两种方法之间差异显著。测试药剂包括溴虫腈、联苯菊酯和克螨特，分别属于新型吡咯类杀虫杀螨剂、菊酯类杀虫杀螨剂和亚硫酸酯类杀螨剂。三种不同类型的杀虫剂在采用药管浸叶法时的半数致死浓度LC₅₀值均显著低于采用玻片浸渍法时的LC₅₀值，这是由于药管浸叶法更能实现对药剂的触杀、内吸及胃毒特性的综合效果测试，而玻片浸渍法则主要测试药剂的触杀和内吸活性。本发明的叶螨生物测定方法与传统的玻片浸渍法相比更具有科学性和实用性。

实施例2、药管浸叶法生物测定结果的线性分析

以阿维菌素和哒螨灵为供试药剂，计算截形叶螨室内相对敏感种群在不同浓度的药剂处理下的校正死亡率，分析药剂浓度的对数值与死亡率机率值之间的线性关系。

1、以阿维菌素为供试药剂进行叶螨的生物测定

将阿维菌素配制成7个梯度浓度：0.08mg/L、0.04mg/L、0.02mg/L、0.01mg/L、0.005mg/L、0.0025mg/L、0.00125mg/L，按照实施例1所述的药管浸叶法进行生物测定，计算得到各药剂浓度下叶螨的校正死亡率(表2)。

如图1所示，阿维菌素各测试浓度的对数值与对应的截形叶螨死亡率的机率值之间的线性相关系数为0.9975，说明线性关系良好，采用本发明的叶螨生物测定方法获得的试验数据可靠。

表2.以阿维菌素为供试药剂进行叶螨的生物测定

测试浓度(mg/L)	测试样本数	死亡数	校正死亡率(％)
				0.08	98	90	91.31
0.04	94	76	79.62
				0.02	103	72	67.96
0.01	133	75	53.58
				0.005	95	42	40.61
0.0025	97	32	28.67

0.00125

101

20

14.63

2、以哒螨灵为供试药剂进行叶螨的生物测定

将哒螨灵配制成6个梯度浓度：400mg/L、200mg/L、100mg/L、50mg/L、25mg/L、12.5mg/L，按照实施例1所述的药管浸叶法进行生物测定，计算得到各药剂浓度下叶螨的校正死亡率(表3)。

如图2所示，哒螨灵各测试浓度的对数值与对应的截形叶螨死亡率的机率值之间的线性相关系数为0.9758，说明线性关系良好，采用本发明的叶螨生物测定方法获得的试验数据可靠。

表3.以哒螨灵为供试药剂进行叶螨的生物测定

Claims (7)

1.一种叶螨生物测定方法，包括如下步骤：

(1)配药：将供试药剂配制成设定浓度的药液；

(2)浸管：将所述药液转入管状容器中，使得管状容器完全被药液浸满，不留空隙；

(3)晾管：浸管后倒掉管内药液，将管状容器倒置，室温下晾干；

(4)叶片浸药：将新鲜的寄主植物叶片制成大小均一的圆形叶片，放入所述药液中浸泡，然后室温晾干；

(5)装管：将所述药液浸过的叶片夹入浸管后的所述管状容器中，所述叶片平整斜向且叶背向上放置，然后再放入受试叶螨，盖上管状容器的盖子；

(6)培养箱饲养：将装管后的所述管状容器放置在温度为26±1℃，光暗周期L:D＝16h:8h的昆虫培养箱中饲养；

(7)结果检查：检查受试叶螨的死亡与成活情况，记录其死亡数和成活数。

2.根据权利要求1所述的方法，所述浸管的参数为：室温下，浸泡2个小时。

3.根据权利要求1所述的方法，所述叶片浸药的时间为10秒钟。

4.根据权利要求1所述的方法，所述管状容器为1.5～2ml的塑料离心管；所述叶片的直径为1.5cm的圆形叶片。

5.根据权利要求4所述的方法，每个所述离心管放入30头雌成螨进行生物测定；放入叶螨的方法是将叶螨放入折叠成漏斗形状的称量纸中，叶螨通过漏斗底部小口进入离心管中。

6.权利要求1～5所述的方法在叶螨生物测定中的应用。

7.一种筛选有效防治叶螨的药剂的方法，其特征在于：采用权利要求1～5任一所述的方法；

所述设定浓度指设定为系列梯度浓度；

所述供试药剂为一至多种；

对每种供试药剂的每个设定浓度下的药液进行步骤(1)～(7)的操作，根据步骤7的结果检查筛选出对叶螨有毒杀活性的有效药剂种类，进而明确叶螨对各药剂的敏感度。