CN108739680B - 一种测定农药对蜜蜂幼虫发育影响的试验方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定农药对蜜蜂幼虫毒性的试验方法，包括，控制蜂王产卵至便携式蜜蜂收集装置中，结合室内毒理学暴露方法和室内养蜂技术，分析评价农药对蜜蜂幼虫发育的影响。本发明通过搭建由立式隔王箱和蜜蜂胚胎收集板组成的便携式蜜蜂收集装置，克服了人工移虫工作量大、耗时长，蜜蜂幼虫易损伤、存活率低的问题，满足了试验对生物样本数量和质量的要求，提高了试验方法的准确性；通过将便携式移虫技术与室内毒理学暴露方法和养蜂技术相结合，进一步提高了观测蜜蜂幼虫在各阶段发育和死亡试验结果的准确性；通过利用SPSS软件Probit分析方法评估试验结果，方法科学，操作简单，能完成相应的风险评估工作，理论和实际意义重大。
Description
技术领域
本发明涉及农药毒性检测技术领域，具体涉及一种测定农药对蜜蜂幼虫发育影响的试验方法。
背景技术
研究表明，世界上超过80％的重要作物都可通过昆虫授粉增加产量，蜜蜂作为世界上最重要的一种授粉昆虫，不仅在维持植物多样性和生态平衡方面发挥着不可替代的作用，而且对农业生产和农业经济发展也具有极大的贡献。据统计，蜜蜂等授粉昆虫通过作物授粉增加的产值占全球农产品总值的9.5％。
近年来，不断发展的蜂群崩溃综合症使得一些国家和地区的蜂群数量不断下降，极大的影响了蜜蜂产业的发展。造成蜜蜂种群数量下降的原因有很多，其中，农药的使用被认为是造成蜜蜂数量下降的一个重要因素。
在农业生产中，当使用农药等化学药剂杀灭害虫保护作物的同时，不可避免的会对蜜蜂等传粉昆虫造成影响。一般而言，采集蜂是最容易接触农药等风险因子而产生中毒的，但是，当采集蜂将含有残留药剂的花粉、蜜露带回蜂巢作为蜂粮储存或被其他蜜蜂直接食用时，残留药剂对整个蜂巢不同级型的蜜蜂均可能产生风险。当蜜蜂幼虫接触药剂后对蜜蜂后续生活史可能产生不同程度的影响，在室内评估农药等化合物在蜜蜂幼虫期暴露处理对其后续生长发育的影响试验中，由于人工移虫工作量大、耗时长，蜜蜂幼虫易损伤而死亡，不能满足常规试验对生物样本数量和质量的基本要求，因此相关影响试验的研究报道还较少。
综上所述，如何在现有的研究基础上，提出一种能避免人工移虫的检测农药对蜜蜂幼虫发育影响的试验方法是本领域亟需解决的关键技术问题。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种测定农药对蜜蜂幼虫发育影响的试验方法。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种测定农药对蜜蜂幼虫发育影响的试验方法，包括，控制蜂王产卵至便携式蜜蜂收集装置中，结合室内毒理学暴露方法和室内养蜂技术，分析评价农药对蜜蜂幼虫发育的毒性影响。
在上述技术方案中，所述测定农药对蜜蜂幼虫发育影响的试验方法，包括以下步骤：
S1、构建便携式蜜蜂收集装置，控制蜂王自由产卵至便携式蜜蜂收集装置中并孵化；
S2、将含有孵化幼虫的便捷式蜜蜂收集装置转移至人工气候箱中，饲喂含不同浓度农药的蜜蜂幼虫人工饲料，统计不同阶段蜜蜂幼虫的死亡情况；
S3、对步骤S2中蜜蜂幼虫的死亡情况进行分析，利用Probit分析法评估农药对蜜蜂幼虫发育的毒性影响。
优选地，在上述技术方案中，步骤S1具体包括：
S11、设计搭建由立式隔王箱和蜜蜂胚胎收集板组成的便携式蜜蜂收集装置，所述蜜蜂胚胎收集板包括至少2个胚胎收集盒；
S12、将蜜蜂胚胎收集板置于立式隔王箱内，并转移至健康蜂群的蜂箱中，控制蜂王在立式隔王箱的内侧，使其在胚胎收集板上自由产卵并孵化。
进一步优选地，在上述技术方案中，所述蜂王的产卵时间为12h。
优选地，在上述技术方案中，步骤S2具体包括：
S21、配制含不同浓度农药的蜜蜂幼虫人工饲料；
S22、将含有1d±12h龄期幼虫的蜜蜂胚胎收集板转移至人工气候箱中适应培养后饲喂含不同浓度农药的蜜蜂幼虫人工饲料；
S23、统计蜜蜂幼虫在发育阶段和化蛹阶段的死亡情况。
进一步优选地，在上述技术方案中，步骤S22中，还包括，转移蜜蜂胚胎收集板至人工气候箱前，及时剔除蜜蜂胚胎收集板上各胚胎收集盒中已死亡的蜜蜂胚胎或幼虫，并统计剩余幼虫数量。
再进一步优选地，在上述技术方案中，步骤S22中，还包括，在饲喂含不同浓度农药的蜜蜂幼虫人工饲料前，将蜜蜂胚胎收集板置于人工气候箱中适应性培养24-48h。
进一步优选地，在上述技术方案中，步骤S22中，将含不同浓度农药的蜜蜂幼虫人工饲料添加至各胚胎收集盒中，控制各胚胎收集盒中蜜蜂幼虫的数量为40-50只，控制各胚胎收集盒的含农药的蜜蜂幼虫人工饲料的滴加操作时间小于10min。
更进一步优选地，在上述技术方案中，步骤S23具体包括：在饲喂含不同浓度农药的蜜蜂幼虫人工饲料后，每24h观测一次蜜蜂幼虫的发育和死亡情况，5天后统计获得蜜蜂幼虫的死亡率，14天后统计获得蜜蜂幼虫的最终羽化率。
优选地，在上述技术方案中，步骤S3中，根据含不同浓度农药的蜜蜂幼虫人工饲料对蜜蜂幼虫在发育阶段和化蛹阶段的统计结果，利用SPSS软件的Probit分析方法计算农药对蜜蜂幼虫的致死中浓度，统计农药对蜜蜂幼虫最终羽化率的影响，评估农药对蜜蜂幼虫发育的毒性作用。
本发明的优点：
(1)本发明所提供的测定农药对蜜蜂幼虫发育影响的试验方法，通过搭建由立式隔王箱和蜜蜂胚胎收集板组成便携式蜜蜂收集装置，从而有效克服了人工移虫工作量大、耗时长，蜜蜂幼虫易损伤、存活率低的问题，满足了试验对生物样本数量和质量的基本要求，从而提高了检测试验方法的准确性；
(2)本发明所提供的测定农药对蜜蜂幼虫发育影响的试验方法，通过将免人工移虫技术与室内毒理学暴露方法和室内养蜂技术相结合，精确控制不同浓度农药饲料的饲喂量，同时在饲喂前将蜜蜂幼虫置于人工气候箱中适应性培养，进一步提高了蜜蜂幼虫在发育阶段和化蛹阶段的试验结果的准确性；
(3)本发明所提供的测定农药对蜜蜂幼虫发育影响的试验方法，通过SPSS软件的Probit分析方法计算农药对蜜蜂幼虫的致死中浓度(LC50)，统计农药对蜜蜂幼虫最终羽化率的影响，能有效满足不同农药对蜜蜂在幼虫等不同阶段的暴露处理的毒理学实验要求，方法科学合理，操作简单可控，能完成相应的风险评估工作，理论和实际意义重大。
附图说明
图1为本发明实施例中测定农药对蜜蜂幼虫发育影响的试验方法的工艺流程图；
图2为本发明实施例中经饲喂含不同浓度的氟啶虫胺腈溶液的蜜蜂人工饲料后蜜蜂幼虫的死亡情况结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。
本发明实施例提供了一种测定农药对蜜蜂幼虫发育影响的试验方法，包括以下步骤：
S1、构建便携式蜜蜂收集装置，控制蜂王自由产卵至便携式蜜蜂收集装置中并孵化；
S2、将含有孵化幼虫的便捷式蜜蜂收集装置转移至人工气候箱中，饲喂含不同浓度农药的蜜蜂幼虫人工饲料，统计不同阶段蜜蜂幼虫的死亡情况；
S3、对步骤S2中蜜蜂幼虫的死亡情况进行分析，利用Probit分析法评估农药对蜜蜂幼虫发育的毒性影响。
具体地，步骤S1具体包括：
S11、设计搭建由立式隔王箱和蜜蜂胚胎收集板组成的便携式蜜蜂收集装置，所述蜜蜂胚胎收集板包括至少2个胚胎收集盒；
S12、将蜜蜂胚胎收集板置于立式隔王箱内，并转移至健康蜂群的蜂箱中，控制蜂王在立式隔王箱的内侧，使其在胚胎收集板上自由产卵并孵化。
详细地，所述便携式蜜蜂收集装置包括立式隔王箱和活动套设在所述立式隔王箱内的蜜蜂胚胎收集板，所述立式隔王箱为由两块侧板和两块端板围成的具有中空内腔的箱体结构，所述立式隔王箱的顶部为带抽拉板的开口结构，所述侧板上均匀布设有隔蜂网孔；所述蜜蜂胚胎收集板包括两个配合设置的卡紧框架和卡设在所述卡紧框架内的胚胎收集盒，所述胚胎收集盒的数量至少为2个。
具体地，所述隔蜂网孔为多排布满在所述侧板上的孔径为4-6mm的网孔结构，相邻两排所述隔蜂网孔之间的间距为3-10mm，每排内相邻所述隔蜂网孔之间的间距为3-10mm。
具体地，所述卡紧框架的内孔边缘设置有卡紧槽，所述胚胎收集盒卡设在所述卡紧槽内；所述卡紧框架的外框边缘设置有卡紧件，两个所述卡紧框架通过所述卡紧件卡合为整体结构；所述胚胎收集盒的深度为5-8mm；所述卡紧框架的内孔大小为45*21cm，所述胚胎收集盒的大小为10.5*7.5cm，所述胚胎收集盒的数量为12个。
详细地，所述蜂王的自由产卵时间为12h。
具体地，步骤S2具体包括：
S21、配制不同浓度的农药溶液，精确称取1.2g葡萄糖，1.2g果糖，0.2g酵母提取物，将其溶解于5ml无菌水中，随后准确定容至10mL；将上述混合糖溶液与蜂王浆按1：1(w/w)的比例混合均匀，得到最终配比的蜜蜂幼虫人工饲料；准确称取22％氟啶虫胺腈(FDCAJ)悬浮剂22.727mg至50mL容量瓶中，采用去离子水充分溶解后定容至刻度，则得到浓度为100mg/L的储备液；随后准确量取人工饲料，将储备液逐级稀释至10-1，10-2，10-3，10-4，10- 5mg/L，即获得不同浓度的农药溶液；设置不含农药的人工饲料为对照。
S22、将含有孵化1d±12h幼虫的蜜蜂胚胎收集板转移至人工气候箱中适应培养48h后(3日龄)饲喂含不同浓度农药的蜜蜂幼虫人工饲料；根据幼虫生长特征，每只幼虫的饲喂体积分别为10-20μL(3日龄)，20-30μL(4日龄)，30-40μL(5日龄)，40-50μL(6日龄)，第7d时停止饲喂。整个处理过程中的温度控制为35±1℃，在幼虫的前6天相对湿度为95±2％，至7d开始相对湿度调节至80±5％。
详细地，步骤S22中，还包括，转移蜜蜂胚胎收集板至人工气候箱前，及时剔除蜜蜂胚胎收集板上各胚胎收集盒中已死亡的蜜蜂胚胎或幼虫，并统计剩余幼虫数量。
详细地，步骤S22中，控制各胚胎收集盒中的蜜蜂幼虫数量为40-50只，控制各胚胎收集盒的含农药的蜜蜂幼虫人工饲料的滴加操作时间小于10min。
S23、统计蜜蜂幼虫在发育阶段和化蛹阶段的死亡情况，具体为：在开始饲喂含氟啶虫胺腈溶液的人工饲料后，每24h观测一次各胚胎收集盒中蜜蜂幼虫发育和死亡的情况，5天后统计获得其累积死亡率。
详细地，步骤S23包括：在停止饲喂后，蜜蜂幼虫进入化蛹阶段，持续每24h观察一次蛹期蜜蜂的发育和死亡情况，14天后，统计获得蜜蜂幼虫的最终羽化率。
步骤S3具体包括：根据不同浓度的氟啶虫胺腈溶液对蜜蜂幼虫在发育阶段和化蛹阶段的死亡试验结果，利用SPSS软件的Probit分析方法计算农药对蜜蜂幼虫的半数致死中浓度(LC50)，统计农药对蜜蜂幼虫最终羽化率的影响，评估其对蜜蜂幼虫发育的影响和毒性作用。
详细地，经不同浓度的氟啶虫胺腈溶液处理后，蜜蜂幼虫出现不同程度死亡，每24h幼虫累积死亡数量见附图2。
经SPSS软件的Probit方法分析计算获得FDCAJ悬浮剂对蜜蜂幼虫的半数致死中浓度(LC50)为7.80*10-8mg/L，95％置信区间为7.31*10-10mg/L～9.35*10-7mg/L，线性相关系数为0.994。
具体地，在幼虫进入蛹期后，停止饲喂，继续每24h观察一次蛹的死亡情况，直至14天后成功羽化，计算不同浓度氟啶虫胺腈药剂处理后，各组中蜜蜂的最终羽化率。测定结果参见附表1。
表1不同浓度氟啶虫胺腈溶液饲喂蜜蜂幼虫后各处理组中
蜜蜂幼虫的最终羽化率情况
本发明实施例所提供的测定农药对蜜蜂幼虫发育影响的试验方法，设计并搭建了由立式隔王箱和蜜蜂胚胎收集板组成的便携式蜜蜂收集装置，有效克服了人工移虫工作量大、耗时长，蜜蜂幼虫易损伤、存活率低的问题，满足了试验对生物样本数量和质量的基本要求，试验方法的准确性高；将免人工移虫技术与室内毒理学暴露方法和室内养蜂技术相结合，精确控制含不同浓度农药的人工饲料的饲喂量，同时在滴加农药溶液前将蜜蜂幼虫置于人工气候箱中适应性培养，进一步提高了蜜蜂幼虫在发育阶段和化蛹阶段的试验结果的准确性；SPSS软件Probit方法分析蜜蜂幼虫在不同阶段的发育和死亡试验结果，计算农药对蜜蜂幼虫的半数致死中浓度(LC50)和对蜜蜂幼虫最终孵化率的影响，方法科学合理，操作简单可控，能完成相应的风险评估工作，理论和实际意义重大。
最后，以上仅为本发明的较佳实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种测定农药对蜜蜂幼虫发育影响的试验方法，其特征在于，控制蜂王产卵至便携式蜜蜂收集装置中，结合室内毒理学暴露方法和室内养蜂技术，分析评价农药对蜜蜂幼虫发育的毒性影响；
包括以下步骤：
S1、构建便携式蜜蜂收集装置，控制蜂王自由产卵至便携式蜜蜂收集装置中并孵化；
S2、将含有孵化幼虫的便捷式蜜蜂收集装置转移至人工气候箱中，饲喂含不同浓度农药的蜜蜂幼虫人工饲料，统计不同阶段蜜蜂幼虫的死亡情况；
S3、对步骤S2中蜜蜂幼虫的死亡情况进行分析，利用Probit分析法评估农药对蜜蜂幼虫发育的毒性影响；
步骤S1中，具体包括：
S11、设计搭建由立式隔王箱和蜜蜂胚胎收集板组成的便携式蜜蜂收集装置，所述蜜蜂胚胎收集板包括至少2个胚胎收集盒；
S12、将蜜蜂胚胎收集板置于立式隔王箱内，并转移至健康蜂群的蜂箱中，控制蜂王在立式隔王箱的内侧，使其在胚胎收集板上自由产卵并孵化。
2.根据权利要求1所述的试验方法，其特征在于，所述蜂王的产卵时间为12h。
3.根据权利要求1所述的试验方法，其特征在于，步骤S2中，具体包括：
S21、配制含不同浓度农药的蜜蜂幼虫人工饲料；
S22、将含有1d±12h龄期幼虫的蜜蜂胚胎收集板转移至人工气候箱中适应培养后饲喂含不同浓度农药的蜜蜂幼虫人工饲料；
S23、统计蜜蜂幼虫在发育阶段和化蛹阶段的死亡情况。
4.根据权利要求3所述的试验方法，其特征在于，步骤S22中，还包括，转移蜜蜂胚胎收集板至人工气候箱前，及时剔除蜜蜂胚胎收集板上各胚胎收集盒中已死亡的蜜蜂胚胎或幼虫，并统计剩余幼虫数量。
5.根据权利要求3所述的试验方法，其特征在于，步骤S22中，还包括，在饲喂含不同浓度农药的蜜蜂幼虫人工饲料前，将蜜蜂胚胎收集板置于人工气候箱中适应性培养24-48h。
6.根据权利要求3所述的试验方法，其特征在于，步骤S22中，将含不同浓度农药的蜜蜂幼虫人工饲料添加至各胚胎收集盒中，控制各胚胎收集盒中蜜蜂幼虫的数量为40-50只，控制各胚胎收集盒的含农药的蜜蜂幼虫人工饲料的滴加操作时间小于10min。
7.根据权利要求4-6任一项所述的试验方法，其特征在于，步骤S23具体包括：在饲喂含不同浓度农药的蜜蜂幼虫人工饲料后，每24h观测一次蜜蜂幼虫的发育和死亡情况，5天后统计获得蜜蜂幼虫的死亡率，14天后统计获得蜜蜂幼虫的最终羽化率。
8.根据权利要求1所述的试验方法，其特征在于，步骤S3中，根据含不同浓度农药的蜜蜂幼虫人工饲料对蜜蜂幼虫在发育阶段和化蛹阶段的统计结果，利用SPSS软件的Probit分析方法计算农药对蜜蜂幼虫的致死中浓度，统计农药对蜜蜂幼虫最终羽化率的影响，评估农药对蜜蜂幼虫发育的毒性作用。
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