CN110122430A - 一种利用黑腹果蝇评价有机溶剂的生殖毒性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用黑腹果蝇评价有机溶剂的生殖毒性的方法，属于毒性研究技术领域，包括：将黑腹果蝇置于含有有机溶剂的固体培养基上培养第10d时，观察雌蝇的卵巢，当所述卵巢出现畸形时，表明有机溶剂具有生殖毒性；所述含有有机溶剂的固体培养基中有机溶剂的体积浓度为0.1～1.25％。采用本发明提供的方法能够准确地评价有机溶剂的生殖毒性，为农业上合理使用的有机溶剂的剂量和浓度提供理论和实验数据支持。
Description
技术领域
本发明属于毒性研究技术领域，尤其涉及一种利用黑腹果蝇评价有机溶剂的生殖毒性的方法。
背景技术
有机溶剂是一类广泛应用于生活和生产中的有机化合物，能够溶解部分不溶于水的有机化合物。其中最为常用的有机溶剂包括苯乙烯、三氯乙烯、乙烯乙二醇醚、全氯乙烯和三乙醇胺等，被广泛的应用于医药、石油、化工、冶金、电子、涂料和高分子材料等领域。有机溶剂特点是在常温常压下呈液态，挥发性较大，溶解过程中，溶质与溶剂的性质均无变化。然而有机溶剂作用于生物体会造成一系列负面效应，如诱导细胞凋亡、影响基因表达甚至改变运动行为等。
目前毒性作用的研究主要集中在植物、水生动物和哺乳动物，相对于陆生昆虫研究较少。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于一种利用黑腹果蝇评价有机溶剂的生殖毒性的方法，采用本发明提供的方法能够准确地评价有机溶剂的生殖毒性，为农业上合理使用的有机溶剂的剂量和浓度提供理论和实验数据支持。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种利用黑腹果蝇评价有机溶剂的生殖毒性的方法，包括：将黑腹果蝇置于含有有机溶剂的固体培养基上培养第10d时，观察雌蝇的卵巢，当所述卵巢出现畸形时，表明有机溶剂具有生殖毒性；
所述含有有机溶剂的固体培养基中有机溶剂的体积浓度为0.1～1.25％。
优选的，所述含有有机溶剂的固体培养基以水为溶剂，每升还包括：70～80g玉米面、30～35g酵母、8～12g琼脂、0.5～1g CaCl2、30～33g蔗糖、60～65g葡萄糖、1～3g山梨酸钾和15ml 5％对羟基苯甲酸丁酯溶液。
优选的，还包括：
1)将黑腹果蝇置于含有有机溶剂的固体培养基上培养，培养7d～10d，培养结束后将黑腹果蝇的亲代除去，随后每天统计黑腹果蝇的子一代蛹的数量，得到第11d～第30d子一代蛹的总数量；
2)将黑腹果蝇置于固体培养基上培养，培养7d～10d，培养结束后将黑腹果蝇的亲代除去，随后每天统计黑腹果蝇的子一代蛹的数量，得到第11d～第30d子一代蛹的总数量；
3)当所述步骤1)得到的子一代蛹的总数量与步骤2)得到的子一代蛹的总数量出现显著差异时，表明有机溶剂具有生殖毒性。
优选的，还包括：
a.将黑腹果蝇置于含有有机溶剂的固体培养基上培养，培养7d～10d，培养结束后将黑腹果蝇的亲代除去，随后每天统计黑腹果蝇的子一代成蝇的数量，得到第11d～第30d子一代成蝇的总数量；
b.将黑腹果蝇置于固体培养基上培养，培养7d～10d，培养结束后将黑腹果蝇的亲代除去，随后每天统计黑腹果蝇的子一代成蝇的数量，得到第11d～第30d子一代成蝇的总数量；
c.当所述步骤a得到的子一代成蝇的总数量与步骤b得到的子一代成蝇的总数量出现显著差异时，表明有机溶剂具有生殖毒性。
优选的，所述固体培养基独立的以水为溶剂，每升包括：70～80g玉米面、30～35g酵母、8～12g琼脂、0.5～1g CaCl2、30～33g蔗糖、60～65g葡萄糖、1～3g山梨酸钾和15ml5％对羟基苯甲酸丁酯溶液。
优选的，所述养的条件包括：所述培养的温度为24～26℃，所述培养的光暗比为12h:12h；所述培养的环境湿度为50～60％。
本发明提供了一种利用黑腹果蝇评价有机溶剂的生殖毒性的方法，包括：将黑腹果蝇置于含有有机溶剂的固体培养基上培养第10d时，观察雌蝇的卵巢，当所述卵巢出现畸形时，表明有机溶剂具有生殖毒性；所述含有有机溶剂的固体培养基中有机溶剂的体积浓度为0.1～1.25％。采用本发明提供的方法能够准确地评价有机溶剂的生殖毒性，为农业上合理使用的有机溶剂的剂量和浓度提供理论和实验数据支持。
附图说明
图1为暴露于DMSO后母本雌蝇卵巢；
图2为卵的结果其中，A为对照组中正常的子一代卵；
B为1.25％DMSO培养基中的卵；
C为DMSO处理后的的卵；
图3为暴露于DMSO后子一代蛹和成蝇数量及羽化率；
具体实施方式
本发明提供了一种利用黑腹果蝇评价有机溶剂的生殖毒性的方法，包括：将黑腹果蝇置于含有有机溶剂的固体培养基上培养第10d时，观察雌蝇的卵巢，当所述卵巢出现畸形时，表明有机溶剂具有生殖毒性；所述含有有机溶剂的固体培养基中有机溶剂的体积浓度为0.1～1.25％。
在本发明中，所述黑腹果蝇优选选用w118野生型黑腹果蝇，本发明对所述w118野生型黑腹果蝇的来源没有特殊限定，采用常规市售的即可。
在本发明中，所述黑腹果蝇在含有有机溶剂的固体培养基或固体培养基的数量独立的优选为18～22对，更优选为20对。
在本发明中，所述含有有机溶剂的固体培养基中有机溶剂的体积浓度为0.1～1.25％，具体为0.1％、0.5％、1％和1.25％。
在本发明中，所述有机溶剂优选包括二甲基亚砜，本发明对所述二甲基亚砜的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可，具体购买于天津市康科德科技有限公司，纯度为99.5％。
本发明对所述观察雌蝇的卵巢的方法没有特殊限定，采用常规方法即可，具体优选为：将雌蝇经二氧化碳麻醉后，在生理盐水中解剖后，在体式显微镜下观察卵巢的形态。
在本发明中，所述含有有机溶剂的固体培养基优选以水为溶剂，每升还优选包括：70～80g玉米面、30～35g酵母、8～12g琼脂、0.5～1g CaCl2、30～33g蔗糖、60～65g葡萄糖、1～3g山梨酸钾和15ml 5％对羟基苯甲酸丁酯溶液；更优选包括77.7g玉米面、32.19g酵母、10.6g琼脂、0.726g CaCl2、31.62g蔗糖、63.2g葡萄糖、2g山梨酸钾和15ml 5％对羟基苯甲酸丁酯溶液。
在本发明中，所述培养的条件优选包括：所述培养的温度优选为24～26℃，更优选为25℃；所述培养的光暗比为12h:12h；所述培养的环境湿度为50～60％。本发明对所述培养时所需的光照强度没有特殊限定，采用本领域技术人员常规光照培养黑腹果蝇的光照强度即可。本发明优选采用恒温培养箱对黑腹果蝇进行培养。
在本发明中，所述黑腹果蝇优选为羽化8h的黑腹果蝇。
在本发明中，所述方法还优选包括：1)将黑腹果蝇置于含有有机溶剂的固体培养基上培养，培养7d～10d，培养结束后将黑腹果蝇的亲代除去，随后每天统计黑腹果蝇的子一代蛹的数量，得到第11d～第30d子一代蛹的总数量；2)将黑腹果蝇置于固体培养基上培养，培养7d～10d，培养结束后将黑腹果蝇的亲代除去，随后每天统计黑腹果蝇的子一代蛹的数量，得到第11d～第30d子一代蛹的总数量；3)当所述步骤1)得到的子一代蛹的总数量与步骤2)得到的子一代蛹的总数量出现显著差异时，表明有机溶剂具有生殖毒性。在本发明中，所述显著差异P值小于0.05为*，P值小于0.01为**，P值小于0.001为***。
在本发明中，所述固体培养基优选以水为溶剂，每升包括：70～80g玉米面、30～35g酵母、8～12g琼脂、0.5～1g CaCl2、30～33g蔗糖、60～65g葡萄糖、1～3g山梨酸钾和15ml 5％对羟基苯甲酸丁酯溶液；更优选包括77.7g玉米面、32.19g酵母、10.6g琼脂、0.726g CaCl2、31.62g蔗糖、63.2g葡萄糖、2g山梨酸钾和15ml 5％对羟基苯甲酸丁酯溶液。
在本发明中，所述黑腹果蝇置于固体培养基上培养的条件与黑腹果蝇置于含有有机溶剂的固体培养基上培养的条件相同，在此不再赘述。
在本发明中，所述方法还优选包括：a.将黑腹果蝇置于含有有机溶剂的固体培养基上培养，培养7d～10d，培养结束后将黑腹果蝇的亲代除去，随后每天统计黑腹果蝇的子一代成蝇的数量，得到第11d～第30d子一代成蝇的总数量；b.将黑腹果蝇置于固体培养基上培养，培养7d～10d，培养结束后将黑腹果蝇的亲代除去，随后每天统计黑腹果蝇的子一代成蝇的数量，得到第11d～第30d子一代成蝇的总数量；c.当所述步骤a得到的子一代成蝇的总数量与步骤b得到的子一代成蝇的总数量出现显著差异时，表明有机溶剂具有生殖毒性。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
试剂配制：二甲基亚砜(DMSO)，纯度99.5％，购自天津市康科德科技有限公司，用蒸馏水稀释。标准培养基中加入等体积不同浓度储备液至指定浓度，空白对照组中加入等体积蒸馏水。
暴露条件：设置2个实验组，每组5个平行；空白对照、DMSO(0.1％v/v)。每个平行实验组中放入20对新羽化的雌雄果蝇进行暴露培养，置于标准培养条件下。在培养第10d时将母本果蝇移出培养基中，置于二氧化碳麻醉台上分离雌雄果蝇。培养基为：77.7g/L玉米面、32.19g/L酵母、10.6g/L琼脂、0.726g/L CaCl2、31.62g/L蔗糖、63.2g/L葡萄糖、2g/L山梨酸钾和15ml/L 5％对羟基苯甲酸丁酯。培养条件为25℃，光暗比为12h:12h，相对湿度为50％。
样本检测：母本雌蝇置于生理盐水中解剖并在体式显微镜下观察其卵巢形态及胚胎数量，随后第11d～第30d内统计子一代蛹及成蝇数量结果见图1、2和3。
实施例2
试剂配制：二甲基亚砜(DMSO)，纯度99.5％，购自天津市康科德科技有限公司，用蒸馏水稀释。标准培养基中加入等体积不同浓度储备液至指定浓度，空白对照组中加入等体积蒸馏水。
暴露条件：设置2个实验组，每组5个平行；空白对照、DMSO(0.5％v/v)。每个平行实验组中放入20对新羽化的雌雄果蝇进行暴露培养，置于标准培养条件下。在培养第10d时将母本果蝇移出培养基中，置于二氧化碳麻醉台上分离雌雄果蝇。培养基为：77.7g/L玉米面、32.19g/L酵母、10.6g/L琼脂、0.726g/L CaCl2、31.62g/L蔗糖、63.2g/L葡萄糖、2g/L山梨酸钾和15ml/L 5％对羟基苯甲酸丁酯。培养条件为25℃，光暗比为12h:12h，相对湿度为50％。
样本检测：母本雌蝇置于生理盐水中解剖并在体式显微镜下观察其卵巢形态及胚胎数量，随后第11d～第30d内统计子一代蛹及成蝇数量结果见图1、2和3。
实施例3
试剂配制：二甲基亚砜(DMSO)，纯度99.5％，购自天津市康科德科技有限公司，用蒸馏水稀释。标准培养基中加入等体积不同浓度储备液至指定浓度，空白对照组中加入等体积蒸馏水。
暴露条件：设置2个实验组，每组5个平行；空白对照、DMSO(1.0％v/v)。每个平行实验组中放入20对新羽化的雌雄果蝇进行暴露培养，置于标准培养条件下。在培养第10d时将母本果蝇移出培养基中，置于二氧化碳麻醉台上分离雌雄果蝇。培养基为：77.7g/L玉米面、32.19g/L酵母、10.6g/L琼脂、0.726g/L CaCl2、31.62g/L蔗糖、63.2g/L葡萄糖、2g/L山梨酸钾和15ml/L 5％对羟基苯甲酸丁酯。培养条件为25℃，光暗比为12h:12h，相对湿度为50％。
样本检测：母本雌蝇置于生理盐水中解剖并在体式显微镜下观察其卵巢形态及胚胎数量，随后第11d～第30d内统计子一代蛹及成蝇数量结果见图1、2和3。
实施例4
试剂配制：二甲基亚砜(DMSO)，纯度99.5％，购自天津市康科德科技有限公司，用蒸馏水稀释。标准培养基中加入等体积不同浓度储备液至指定浓度，空白对照组中加入等体积蒸馏水。
暴露条件：设置2个实验组，每组5个平行；空白对照、DMSO(1.25％v/v)。每个平行实验组中放入20对新羽化的雌雄果蝇进行暴露培养，置于标准培养条件下。在培养第10d时将母本果蝇移出培养基中，置于二氧化碳麻醉台上分离雌雄果蝇。培养基为：77.7g/L玉米面、32.19g/L酵母、10.6g/L琼脂、0.726g/L CaCl2、31.62g/L蔗糖、63.2g/L葡萄糖、2g/L山梨酸钾和15ml/L 5％对羟基苯甲酸丁酯。培养条件为25℃，光暗比为12h:12h，相对湿度为50％。
样本检测：母本雌蝇置于生理盐水中解剖并在体式显微镜下观察其卵巢形态及胚胎数量，随后第11d～第30d内统计子一代蛹及成蝇数量结果见图1、2和3。
实施例1～4的图1、2和3实验结果表明，DMSO严重干扰了果蝇的生殖发育过程，随浓度增加各组的总蛹数依次为：172.00、176.00、75.00、6.40、0.00，总成蝇数依次为：130.00、132.33、1.33、0.00、0.00，总羽化率依次为：75.58％、74.49％、1.74％、0.00％、0.00％，子一代蛹和成蝇数量随DMSO浓度增加而显著降低。各DMSO浓度组总羽化率分别为：75.58％、74.49％、1.74％、0.00％、0.00％，0.5％、1.0％和1.25％DMSO中羽化率显著下降，几乎无子一代果蝇出现。暴露于DMSO时雌蝇卵巢出现畸形，体积变小且形状不规则，较对照相比胚胎数量变少。另外，高浓度处理组中子一代卵和幼虫呈现黄褐色，出现大量死亡，表明DMSO具有一定的生殖毒性作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种利用黑腹果蝇评价有机溶剂的生殖毒性的方法，其特征在于，包括：将黑腹果蝇置于含有有机溶剂的固体培养基上培养第10d时，观察雌蝇的卵巢，当所述卵巢出现畸形时，表明有机溶剂具有生殖毒性；
所述含有有机溶剂的固体培养基中有机溶剂的体积浓度为0.1～1.25％。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有有机溶剂的固体培养基以水为溶剂，每升还包括：70～80g玉米面、30～35g酵母、8～12g琼脂、0.5～1g CaCl2、30～33g蔗糖、60～65g葡萄糖、1～3g山梨酸钾和15ml5％对羟基苯甲酸丁酯溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：
1)将黑腹果蝇置于含有有机溶剂的固体培养基上培养，培养7d～10d，培养结束后将黑腹果蝇的亲代除去，随后每天统计黑腹果蝇的子一代蛹的数量，得到第11d～第30d子一代蛹的总数量；
2)将黑腹果蝇置于固体培养基上培养，培养7d～10d，培养结束后将黑腹果蝇的亲代除去，随后每天统计黑腹果蝇的子一代蛹的数量，得到第11d～第30d子一代蛹的总数量；
3)当所述步骤1)得到的子一代蛹的总数量与步骤2)得到的子一代蛹的总数量出现显著差异时，表明有机溶剂具有生殖毒性。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，还包括：
a.将黑腹果蝇置于含有有机溶剂的固体培养基上培养，培养7d～10d，培养结束后将黑腹果蝇的亲代除去，随后每天统计黑腹果蝇的子一代成蝇的数量，得到第11d～第30d子一代成蝇的总数量；
b.将黑腹果蝇置于固体培养基上培养，培养7d～10d，培养结束后将黑腹果蝇的亲代除去，随后每天统计黑腹果蝇的子一代成蝇的数量，得到第11d～第30d子一代成蝇的总数量；
c.当所述步骤a得到的子一代成蝇的总数量与步骤b得到的子一代成蝇的总数量出现显著差异时，表明二有机溶剂具有生殖毒性。
5.根据权利要求3～4任一项所述的方法，其特征在于，所述固体培养基独立的以水为溶剂，每升包括：70～80g玉米面、30～35g酵母、8～12g琼脂、0.5～1g CaCl2、30～33g蔗糖、60～65g葡萄糖、1～3g山梨酸钾和15ml5％对羟基苯甲酸丁酯溶液。
6.根据权利要求1、3～4任一项所述的方法，其特征在于，所述养的条件包括：所述培养的温度为24～26℃，所述培养的光暗比为12h:12h；所述培养的环境湿度为50～60％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂包括二甲基亚砜。
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