CN108714218B - 一种利用重编程效应治疗白血病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用重编程效应治疗白血病的方法，该方法包括将重编程因子Oct‑4、Sox‑2、Klf4和c‑Myc(简称OSKM)导入白血病细胞的步骤；或者是利用重编程小分子体外培养的步骤。促使白血病细胞启动重编程过程，从而引起白血病细胞凋亡，达到体外清除白血病细胞的目的；为日后临床治疗白血病提供新的思路与方法。

Description

一种利用重编程效应治疗白血病的方法
本申请是分案申请，原申请的申请号为201610280410.5，申请日是2016年04月28日，发明名称为：一种利用重编程效应治疗白血病的方法。
技术领域
本发明涉及一种利用重编程效应治疗白血病的方法。
背景技术
体细胞重编程(somatic cell reprogramming)是指运用特定的方法将已经分化的体细胞逆转回到多能性或全能性状态的过程。2006年日本科学家山中伸弥(ShinyaYamanaka)证实过表达4个转录因子OSKM(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)能够使分化细胞重新获得多能性，这种细胞与胚胎干细胞具有十分类似的生物学特性，他把其命名为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，并借此获得了2012年的诺贝尔生理医学奖。iPS技术自建立以来，在基础研究、发病机制、药物筛选及临床治疗等领域拥有十分广泛的应用前景。
早期的iPS技术主要运用逆转录或慢病毒的手段启动外源性重编程因子OSKM的表达。考虑到直接逆转录病毒感染会增加体细胞的突变，并且在iPSCs中直接整合到基因组中的病毒载体会随着细胞的分化而表达，最终影响iPSCs的应用和研究，针对重编程因子的诱导方法，科学家开发了多种非整合的iPSCs诱导方法。在DNA水平，科学家运用episomal，仙台病毒，转座子等技术实现了OSKM的诱导表达，但这些方法的重编程效率各不相同，并需要多次传代才能获得无携带载体的iPSCs。在RNA水平，Warren等将体外转录的OSKM的mRNA直接导入成纤维细胞获得iPSCs，此方法有一定的技术难度并需要多次转染，但能有效获得无携带载体的iPSCs。在蛋白质水平，Kim等利用细胞穿透肽将OSKM导入细胞内，成功获得人肾成纤维细胞来源的iPSCs，这种方法完全不借助遗传物质，但诱导效率比较低。另外，在重编程体系中加入小分子化合物，通过抑制或激活某些信号通路可以显著提高重编程的效率，甚至多种小分子能够替代经典重编程因子实现重编程。上述基因组非整合的方法，极大地推动了iPSCs的临床级应用前景。
虽然正常细胞在体内能有效的重编程为iPS细胞，但肿瘤细胞是否能在体内进行重编程至iPS细胞，目前还未有研究报道。与恶性肿瘤相似，iPS细胞的产生受肿瘤抑制基因如P53和Rb通路的抑制，重编程因子中C-MYC和KLF4均为著名的促癌因子。而且已有研究表明，正常细胞在小鼠体内重编程后，能形成肿瘤。因而在肿瘤发生和体细胞重编程之间存在着一定的相似性。相比于正常体细胞，肿瘤细胞的重编程较难，效率极低，但机制尚不明确。
白血病是血液系统的恶性肿瘤，据统计，我国白血病的发病率在各种肿瘤中排名第六，小儿肿瘤中排名第一。按起病的缓急以及细胞类型，白血病可分多种类型。目前体内清除白血病细胞主要是通过靶向药物化疗或免疫疗法。但并未有一种广谱性的疗法用于治疗多种白血病。白血病细胞成功重编程为iPS细胞的案例较少，说明白血病细胞难以进行有效的重编程，但其机制并未报道。在诱导重编程过程中，由于遗传及表观遗传修饰发生剧烈变化，部分细胞容易走向死亡。在我们的研究中发现，白血病细胞在重编程过程中，绝大部分细胞发生凋亡，这和白血病细胞难以形成iPS细胞有着直接的关系。利用白血病细胞这一特性，结合重编程技术，或许能为白血病的治疗提供新的思路与方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是利用重编程效应，在体内外选择性地清除白血病细胞。
本发明采用的技术方案为：
本发明提供了一种诱导因子(即重编程因子)Oct-4、Sox-2、Klf4和c-Myc(简称OSKM)用于在体内或体外促进白血病细胞凋亡的用途。
在该用途中，所述的诱导因子Oct-4、Sox-2、Klf4和c-Myc促使白血病细胞启动重编程过程。
所述的白血病细胞是哺乳动物体(包括人)白血病细胞，更优选为人白血病细胞。
所述的诱导因子是cDNA，mRNA或蛋白形式。
本发明还提供了一种利用重编程效应诱导白血病细胞凋亡的体内或体外方法，该方法包括将重编程因子Oct-4、Sox-2、Klf4和c-Myc(简称OSKM)导入白血病细胞的步骤。从而启动白血病细胞的重编程过程。
本发明还提供了一种利用重编程效应治疗白血病的方法，该方法包括将重编程因子Oct-4、Sox-2、Klf4和c-Myc(简称OSKM)导入白血病细胞的步骤。通过白血病细胞OSKM基因的高表达，启动白血病细胞的重编程过程，从而引起白血病细胞凋亡，达到体内或体外清除白血病细胞的目的。
优选地，所述的导入方法采用病毒感染、重组蛋白转染或电转染载体的方法。
本发明中提到的病毒感染、重组蛋白转染、电转染载体的方法均按照本领域的常规方法进行。
例如，所述的病毒感染步骤包括：将含有Oct-4、Sox-2、Klf4和c-Myc的病毒载体与相应的包装载体转染至包装细胞系(如293T，293A等)，待病毒产生后，收集相应的病毒，在白血病细胞培养基中加入相应的病毒进行感染，其中所述的病毒载体选自慢病毒载体，逆转录病毒载体、腺病毒载体或仙台病毒载体。
例如，所述的重组蛋白转染步骤包括：将Oct-4、Sox-2、Klf4和c-Myc的重组蛋白质与穿透肽融合后，加入白血病细胞培养体系中，进行重编程诱导。
例如，所述的电转染载体的步骤包括：利用电转染的方法，将携带有重编程因子的episomal质粒转导至白血病细胞中，使其瞬时高表达重编程因子(OSKM)。具体地，该步骤为：利用Amaxa细胞核转染仪进行细胞核转染(按操作说明书进行)，过程(整个过程不要超过15min)为：在含有5x105白血病细胞的15ml离心管中加入100μl配置好的电转缓冲液，再加入准备的质粒，包括10μg pEV SFFV/EF1/CAG-OS和5μg pEV SFFV/EF1/CAG-MK，混合均匀后转入电转杯，放到电转槽内进行电转。
本发明还提供了一种利用重编程效应诱导白血病细胞凋亡的体内或体外方法，该方法包括利用重编程小分子体外培养的步骤。促使白血病细胞启动重编程过程。
本发明还提供了一种利用重编程效应治疗白血病的方法，该方法包括利用重编程小分子体外培养的步骤。促使白血病细胞启动重编程过程，从而引起白血病细胞凋亡，达到体外清除白血病细胞的目的。
所述的重编程小分子为forskolin(FSK,F)、VPA(V)、CHIR99021(CHIR,C)、RepSox(616452，6)、tranylcypromine(TCP,T)和TTNPB(N)中的一种或两种以上的组合物。
优选地，所述的重编程小分子为forskolin(FSK,F)、VPA(V)、CHIR99021(CHIR,C)、RepSox(616452，6)、tranylcypromine(TCP,T)和TTNPB(N)六种的组合。
本发明所述的白血病细胞是哺乳动物体(包括人)白血病细胞，更优选为人白血病细胞。本发明所具有的有益效果：
本发明利用重编程效应，能在体内外有效地并选择性地清除白血病细胞，为日后临床治疗白血病提供新的思路与方法。
附图说明
图1：给白血病小鼠饮用水中加入Dox后，小鼠脾脏与骨髓中白血病细胞的比例分析。
图2：给不同类型白血病小鼠饮用水中加入Dox后，白血病小鼠生存分析。
图3：给白血病小鼠饮用水中加入Dox后，小鼠脾脏与骨髓中白血病干细胞比例及数量分析。
图4：给白血病小鼠饮用水中加入Dox后，小鼠脾脏与骨髓中白血病细胞凋亡分析。
图5：OSKM小鼠正常骨髓细胞与白血病细胞共移植，待小鼠发生白血病后，给白血病小鼠饮用水中加入Dox后，小鼠骨髓中正常造血干/祖细胞比例与凋亡分析，以及白血病小鼠生存分析。
图6：用重编程小分子体外处理正常造血干/祖细胞与白血病细胞，其凋亡和增殖分析，以及处理后的白血病细胞致病能力的分析。
图7：用重编程小分子体外处理人白血病细胞系，其凋亡和增殖的分析。
图8：用重编程小分子体外处理人脐血CD34+细胞与AML病人CD34+细胞，其凋亡及集落形成能力分析。
具体实施方式
为了理解本发明，下面结合具体实施实例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。
实施例1：利用重编程因子，体内外清除小鼠白血病细胞
1.制备白血病逆转录病毒：逆转录病毒的制备采用lipofectamine2000的方法。293T细胞培养于10cm培养皿中，当细胞达到90％汇合度时，加入质粒和lipofectamine2000混合液。质粒包括：包装质粒(pKat和pVSVG)和逆转录病毒目的质粒(MSCV-MLL/AF9-IRES-GFP)。分别在48小时和72小时收集病毒上清液。使用Amicon Ultra-15 centrifugalfilter devices(100K NMWL)进行浓缩。
2.小鼠急性髓系白血病细胞的制备：从OSKM小鼠(或称‘all-iPS’小鼠，小鼠由高绍荣教授实验室构建，文章出处Kang,L.et al.Cell Stem Cell.2009；5:135-138.)中获取骨髓细胞，利用磁珠的方法富集Lineage阴性(Lin-)的骨髓细胞。将带有MLL-AF9白血病基因的逆转录病毒加入至Lin-细胞培养液中，感染48小时后，收集感染过的细胞，移植至致死剂量照射的C57BL/6J小鼠的尾静脉中。小鼠发病后，收集小鼠脾脏中和骨髓中的白血病细胞。由于白血病细胞来源于OSKM小鼠，因此doxycycline(Dox)能激活白血病细胞中OSKM的表达。
3.体内清除白血病细胞：将白血病细胞移植至半致死剂量照射的C57BL/6J小鼠尾静脉中，在白血病发病后期(骨髓中白血病细胞达到70％以上)，将小鼠分为两组，对照组在小鼠饮用水中不添加任何成分，实验组在小鼠的饮用水中加入Dox(浓度为1mg/ml)，并持续7天。结果如图1显示，图1A中，流式细胞术结果显示，实验组小鼠脾脏和骨髓中的白血病数量逐渐减少，图1B、图1C分别为骨髓以及脾脏中白血病细胞的比例，可以看出，对照组小鼠脾脏、骨髓中白血病细胞比例逐渐上升，实验组小鼠脾脏、骨髓中白血病细胞比例逐渐下降，直至完全消失。通过图1可以看出，加入Dox后，小鼠脾脏和骨髓中白血病细胞迅速消失。说明OSKM在白血病细胞中高表达后，直接导致白血病细胞在体内被清除。
4.体内清除多种白血病细胞：利用同样的方法建立其它两种白血病模型：MLL-NRIP3引起的急性髓系白血病(AML)和NOTCH1引起的急性淋巴细胞白血病(ALL)。生存曲线如图2所示，图2A为MLL-AF9诱导的AML模型，生存曲线结果显示，对照组小鼠全部发生白血病而死亡，而实验组小鼠全部存活。图2B为MLL-NRIP3诱导的AML模型，生存曲线结果显示，对照组小鼠全部发生白血病而死亡，而只有少量的实验组小鼠死亡。图2C为NOTCH1诱导的ALL模型，生存曲线结果显示，对照组小鼠全部发生白血病而死亡，而实验组小鼠全部存活。通过图2可以看出，与MLL-AF9诱导的白血病模型类似，在实验组小鼠饮用水中加入Dox后(持续7天)，其他两种白血病细胞也能被清除，从而治疗小鼠白血病。说明利用OSKM重编程因子，能在体内清除多种白血病。
5.有效清除白血病干细胞：在饮用水中加入Dox后1-4天，利用流式检测白血病干细胞的比例。结果如图3显示(图3A为脾脏中白血病干细胞的比例及数量，图3B为骨髓中白血病干细胞的比例及数量)，通过图3可以看出，相比成熟白血病细胞，白血病干细胞清除更会迅速。
6.重编程因子引起白血病细胞凋亡：实验组在饮用水中加入Dox后1-4天，利用流式分析白血病细胞的凋亡情况。结果如图4所示，图4A为Dox处理后，脾脏中白血病细胞早期与晚期凋亡比例，图4B为Dox处理后，骨髓中白血病细胞早期与晚期凋亡比例；通过图4可以看出，OSKM能有效诱导体内白血病细胞的凋亡。
7.重编程因子对正常造血干/祖细胞影响较小：将OSKM小鼠的骨髓细胞与白血病细胞共同植入至致死剂量照射的小鼠体内，待小鼠发生白血病，在实验组小鼠饮用水中加入Dox 7天。结果如图5所示，图5A为骨髓中正常造血干细胞、祖细胞比例，通过图5A可以看出，实验组Dox处理后，骨髓中正常造血干细胞和祖细胞的比例基本未受影响；图5B为骨髓中正常造血干细胞、祖细胞凋亡比例，通过图5B可以看出，Dox处理后，正常造血干细胞和祖细胞的凋亡未受影响；图5C为小鼠的生存曲线，实验组小鼠，除一只小鼠，其他白血病小鼠均被治愈。通过图5可以看出，正常造血干/祖细胞的数量和凋亡基本不受影响，实验组小鼠白血病能被治愈。
8.利用重编程诱导小分子清除小鼠白血病细胞：重编程小分子包括forskolin(FSK,F)、VPA(V)、CHIR99021(CHIR,C)、RepSox(616452，6)、tranylcypromine(TCP,T)和TTNPB(N)。利用不同组合体外处理白血病细胞和正常造血干/祖细胞。
处理条件：小鼠白血病细胞起始数量1x105。培养基：IMDM+15％胎牛血清+10ng/ml小鼠IL-6+10ng/ml小鼠IL-3+50ng/ml小鼠SCF。
c-Kit+造血干/祖细胞起始数量8x104。培养基：IMDM+15％胎牛血清+10ng/ml小鼠IL-6+10ng/mL小鼠IL-3+50ng/ml小鼠SCF+20ng/ml小鼠TPO+10ng/ml小鼠Flt3-L.
小分子浓度：forskolin(10μM)，VPA(500μM)，CHIR99021(10μM)，RepSox(5μM)，tranylcypromine(5μM)和TTNPB(1μM)
结果如图6所示，通过图6A可以看出：不同组合重编程小分子处理后，白血病细胞的凋亡显著增加，而对正常造血干/祖细胞影响较小。通过图6B可以看出：白血病细胞在重编程小分子处理后，增殖显著受抑，相比于处理前(第0天)，细胞数量显著下降。通过图6C可以看出：正常干/祖细胞在重编程小分子处理后，增殖也受抑，但相比于处理前(第0天)，细胞数量略微上升。通过图6D可以看出，用VC6T和FVC6TN两种组合处理后，同样数量的白血病细胞致病能力明显减弱，大部分小鼠未发生白血病。通过图6E可以看出，重编程小分子处理细胞后，细胞内多能性基因表达升高，说明启动重编程过程。通过图6可以看出，重编程小分子能在体内外特异性的清除小鼠白血病细胞，并对正常造血干/祖细胞干预较弱，能有效地治疗小鼠白血病。
实施例2：利用重编程诱导小分子，体外清除人白血病细胞
1.人白血病细胞系：利用多种白血病细胞系，用重编程小分子进行体外处理，检测其凋亡水平以及生长状态。
处理条件：起始数量1x105。
HL-60,K562,NB4,Kasumi-1和Jurkat细胞：RPMI 1640+10％胎牛血清THP-1细胞：RPMI 1640+10％胎牛血清+0.05mM 2-mercaptoethanol KG-1和KG-1a细胞：IMDM+20％胎牛血清
小分子浓度：forskolin(10μM)，VPA(500μM)，CHIR99021(10μM)，RepSox(5μM)，tranylcypromine(5μM)和TTNPB(1μM)
结果如图7显示，FVC6TN小分子组合处理后，所有白血病细胞系凋亡显著增加，生长受抑严重。
2.白血病病人标本：本实验共收集急性髓系白血病(AML)病人细胞22例，正常人脐血干细胞(CD34+)5例，体外培养条件下用重编程小分子药物处理。
处理条件：人脐血CD34+细胞与AML病人CD34+细胞起始数量1x105。培养基：IMDM+15％胎牛血清+1％双抗+100ng/ml人SCF+100ng/ml人Flt3-L+50ng/ml人TPO+10ng/ml人IL-3+100ng/ml人IL-6
小分子浓度：forskolin(10μM)，VPA(500μM)，CHIR99021(10μM)，RepSox(5μM)，tranylcypromine(5μM)和TTNPB(1μM)
结果如图8所示，图8A为人脐血CD34+细胞和AML病人CD34+细胞在不同的重编程小分子组合处理后的凋亡比例，通过图8A可以看出，重编程小分子组合处理后，相比于人脐血CD34+细胞，AML病人CD34+细胞的凋亡更为显著。图8B和图8C分别为FVC6TN小分子组合处理后，AML病人CD34+细胞和人脐血CD34+细胞的集落数量，通过图8B可以看出，FVC6TN小分子组合处理后，AML病人CD34+细胞的集落形成能力显著降低(L1，L2，L17，L19，L21为病人编号)。通过图8C可以看出，FVC6TN小分子组合处理后，人脐血CD34+细胞的集落形成能力未受显著影响。通过图8D可以看出，重编程诱导小分子处理细胞后，重编程小分子处理细胞后，细胞内多能性基因表达升高，说明启动重编程过程。通过图8可以看出，相比于正常脐血CD34+细胞，AML病人CD34+细胞凋亡水平上升更为显著，体外集落形成实验(CFC)表明经小分子处理后的AML CD34+细胞集落形成能力受抑严重，而正常脐血CD34+细胞集落形成能力并未受到影响。
与小鼠模型类似，重编程因子能在体外特异性地诱导人白血病细胞死亡，并对正常造血干/祖细胞干预较弱，从而达到体外净化白血病的功效。

Claims (3)

1.重编程小分子在制备利用重编程效应体外诱导白血病细胞凋亡的药物中的用途，其特征在于：所述的重编程小分子为forskolin、VPA、CHIR99021、RepSox、tranylcypromine和TTNPB六种的组合。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的白血病细胞是哺乳动物体白血病细胞。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的白血病细胞是人白血病细胞。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113528446A (zh) * 2015-12-01 2021-10-22 海门雨霖细胞科技有限责任公司 化学诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性细胞的培养基和药物组合物
CN105833275B (zh) * 2016-04-28 2019-12-27 中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所) 一种利用重编程效应治疗白血病的方法
GB201801169D0 (en) * 2018-01-24 2018-03-07 Pci Biotech As Method
CN108103027B (zh) * 2018-02-02 2021-12-24 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） 高效率血细胞重编程同时实现基因编辑的方法
CN108277203B (zh) * 2018-04-08 2020-07-24 浙江大学 一种体外维持人造血干祖细胞干性的培养基及方法
CN113106123A (zh) * 2021-04-19 2021-07-13 深圳市罗湖区人民医院 T-all来源诱导多能干细胞模型及其构建方法
CN113549655B (zh) * 2021-07-19 2022-09-13 中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所) Phf6△和jak3m511i双突变急性t淋巴细胞白血病小鼠模型构建方法和应用
CN115478052B (zh) * 2022-11-01 2023-07-21 安徽省立医院(中国科学技术大学附属第一医院) 一种人单核前体细胞体外分离培养的方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100784187B1 (ko) * 2003-04-21 2007-12-10 히데아키 시마다 세포자멸 유도제 및 세포자멸 유도방법
CN102242146B (zh) * 2010-05-10 2015-11-25 高丽大学校产学协力团 组合物和用其产生诱导全能干细胞的方法
JP6399558B2 (ja) * 2012-10-29 2018-10-03 スクリップス ヘルス 軟骨細胞から多能性幹細胞を製造する方法
WO2016033160A2 (en) 2014-08-26 2016-03-03 The General Hospital Corporation Methods for controlling cell fate and consequences for disease
CN113528446A (zh) * 2015-12-01 2021-10-22 海门雨霖细胞科技有限责任公司 化学诱导人肿瘤细胞直接重编程转化为非致瘤性细胞的培养基和药物组合物
CN105833275B (zh) 2016-04-28 2019-12-27 中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所) 一种利用重编程效应治疗白血病的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C/EBPα Induces Highly Efficient Macrophage Transfifferentiation of B Lymphoma and Leukemia Cell Lines and Impairs Their Tumorigenicity;Francesca Rapino etal;《Cell Reports》;20130425;第3卷;第1-11页 *
Valproic Acid Stimulates Proliferation and Self-renewal of Hematopoietic Stem Cells;Gesine Bug etal;《Cancer Res》;20050401;第65卷(第7期);第2537-2541页 *

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