CN108707558A - 用于修复重金属污染土壤的微生物制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于修复重金属污染土壤的微生物复合制剂，其特征在于，该复合微生物菌剂包括沼泽红假单胞菌 DSM5859菌剂、植物乳杆菌NJ2205菌剂、枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂和固定化耐高温α‑淀粉酶。本发明还公开该微生物制剂的制备方法和应用。本发明首次将固定化耐高温α‑淀粉酶用于土壤修复领域，并且首次将沼泽红假单胞菌 DSM5859菌剂、植物乳杆菌NJ2205菌剂、枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂和固定化耐高温α‑淀粉酶混合制备成微生物酶制剂，对Cd、Cr、Cu、Ni和Zn的去除率均达到了85%以上，而且该制剂环保不会造成二次污染，有利于土壤的大面积推广利用。

Description

用于修复重金属污染土壤的微生物制剂及其制备方法和应用
技术方案
本发明属于土壤修复技术领域，具体涉及用于修复重金属污染土壤的微生物制剂及其制备方法和应用。
背景技术
随着城市化和工业化进程的加快，城市和工业区附近的土壤重金属污染程度也在加剧，污染面积在逐渐扩大，据报道，目前我国重金属污染土壤已经超过2000万hm2。而且，土壤重金属污染具备隐蔽性、累积性、滞后性和长期性的特点，修复难度大，修复效果不佳等问题，因此，重金属污染是环境科技研究的重点。
生物酶是一种生物螯合剂，目前被广泛用于处理环境污染的修复，当生物酶与重金属结合时，会形成络合物，进而降低污染，修复效果较好，但是生物酶使用会受到温度、PH等的影响，极易失活，从而导致处理效果不佳，处理成本升高的一系列的问题，亟待出现能全面解决以上污染问题的方案。
发明内容
发明目的：本发明通过提供一种能够有效去除土壤中的重金属污染的微生物制剂，该微生物制剂能有效与土壤中的重金属形成复合物从而达到去除土壤中重金属的目的。
本发明的另一目的在于提供一种制备所述的用于修复重金属污染土壤的微生物制剂的方法。
本发明的另一目的在于提供了上述微生物制剂在修复重金属污染土壤中的应用。
技术方案：本发明提供一种用于修复重金属污染的土壤的微生物复合制剂，其特征在于，该复合微生物菌剂包括沼泽红假单胞菌DSM5859菌剂、植物乳杆菌NJ2205菌剂、枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂和固定化耐高温α-淀粉酶。
其中，所述沼泽红假单胞菌DSM5859菌剂、植物乳杆菌NJ2205菌剂、枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂重量比为0.5：1：1～2：3：5。
其中，所述复合微生物菌剂中，所述沼泽红假单胞菌DSM5859菌剂的活菌含量为1×108～5×1010cfu/g，植物乳杆菌NJ2205菌剂菌剂的活菌含量为3×109～8×1010cfu/g、所述枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂4×109～7×1010cfu/g。
其中，所述复合微生物菌剂中，所述固定化耐高温α-淀粉酶浓度为15～30U/mg。
其中，耐高温α-淀粉酶的固定化方法为：将介孔分子筛材料SBA-15加入到耐高温α-淀粉酶中，在温度为50～70℃；pH为6.0～7.0；转速为180～220rpm；固定化时间为10～16h下进行固定化后获得。
本发明内容还包括一种制备所述的用于修复重金属污染的土壤的微生物制剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)将沼泽红假单胞菌DSM5859菌剂、植物乳杆菌NJ2205菌剂、枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂按照0.5：1：1～2：3：5的质量比混合均匀得到复合菌剂；
2)向步骤1)制得的复合菌剂中加入所述固定化耐高温α-淀粉酶，混合均匀，即得所述用于修复重金属污染的土壤的微生物制剂。
其中，所述沼泽红假单胞菌DSM5859菌剂的制备方法包括：将沼泽红假单胞菌DSM5859培养到对数期，然后按培养基体积3％～6％的接种量将培养到对数期的菌种接种到培养基中，30～35℃下，摇床震荡180～220rpm，培养48～72小时，得到沼泽红假单胞菌DSM5859的发酵液，向该发酵液中加入吸附剂，干燥，即得沼泽红假单胞菌DSM5859菌剂；所述吸附剂为膨润土或活性炭一种或几种。
其中，所述沼泽红假单胞菌DSM5859菌剂制备过程中的培养基为酵母膏10g/L、乙酸钠2g/L、MgSO42g/L、K2HPO43g/L、蛋白胨8g/L、蛋氨酸2g/L加水配制而成的培养基。
其中，所述植物乳杆菌NJ2205菌剂的制备方法包括：将植物乳杆菌NJ2205培养到对数期，然后按培养基体积3％～6％的接种量将培养到对数期的菌种接种到LB液体培养基中，35～37℃下，摇床震荡150～220rpm，培养36～48小时，加入吸附剂，干燥，制得植物乳杆菌NJ2205菌剂；所述吸附剂为膨润土或活性炭中的一种或几种。
其中，植物乳杆菌NJ2205培养过程中的培养基为常规MRS培养基中添加3％(w/v)蔗糖、2.5％(w/v)酵母膏和0.2％(w/v)KH2PO4。
其中，所述枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂的制备方法包括：将枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂培养到对数期，然后按培养基体积6％～10％的接种量将培养到对数期的菌种接种到LB液体培养基中，30～35℃下，摇床震荡120～150rpm，培养36～48小时，加入吸附剂，干燥，制得枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂；所述吸附剂为膨润土或活性炭中的一种或几种。
其中，枯草芽孢杆菌BNCC188062培养过程中的培养基为牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖10ml、氯化钠10g/L加水配制而成。
本发明内容还包括上述的用于修复重金属污染的土壤的微生物制剂的方法在重金属污染土壤修复中的应用。
有益效果：本发明首次将固定化耐高温α-淀粉酶用于土壤修复领域，并且首次将沼泽红假单胞菌DSM5859菌剂、植物乳杆菌NJ2205菌剂、枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂和固定化耐高温α-淀粉酶混合制备成微生物酶制剂，该微生物和酶混合的制剂，不仅使得酶能够反复循环使用，而且用于修复重金属污染土壤中效果突出，对Cd、Cr、Cu、Ni和Zn的去除率均达到了85％以上，而且该制剂环保不会造成二次污染，有利于土壤的大面积推广利用。
具体实施方式
本发明的沼泽红假单胞菌DSM5859购买于ATCC细胞库、植物乳杆菌NJ2205购买于常州益菌加生物科技有限公司、枯草芽孢杆菌BNCC188062购买于BNCC细胞库。本发明中所有的试剂均为市面上购买获得，本发明未提及的试剂、培养基均为常规培养基。
实施例1
耐高温α-淀粉酶的固定化：将介孔分子筛材料SBA-15加入到耐高温α-淀粉酶中，在温度为60℃；pH为6.0；转速为220rpm；固定化时间为16h下进行固定化后获得。
沼泽红假单胞菌DSM5859菌剂的制备方法包括：将沼泽红假单胞菌DSM5859培养到对数期，然后按培养基体积3％的接种量将培养到对数期的菌种接种到培养基中，30℃摇床震荡180rpm，培养72小时，得到沼泽红假单胞菌DSM5859的发酵液，向该发酵液中加入吸附剂，干燥，即得沼泽红假单胞菌DSM5859菌剂；所述吸附剂为膨润土。沼泽红假单胞菌DSM5859菌剂的活菌含量为1×108cfu/g。
沼泽红假单胞菌DSM5859菌剂制备过程中的培养基为酵母膏10g/L、乙酸钠2g/L、MgSO42g/L、K2HPO43g/L、蛋白胨8g/L、蛋氨酸2g/L加水配制而成的培养基。
植物乳杆菌NJ2205菌剂的制备方法包括：将植物乳杆菌NJ2205培养到对数期，然后按培养基体积3％的接种量将培养到对数期的菌种接种到LB液体培养基中，35℃摇床震荡150rpm，培养48小时，加入吸附剂，干燥，制得植物乳杆菌NJ2205菌剂；所述吸附剂为膨润土。植物乳杆菌NJ2205菌剂菌剂的活菌含量为3×109cfu/g。
植物乳杆菌NJ2205培养过程中的培养基为常规MRS培养基中添加3％(w/v)蔗糖、2.5％(w/v)酵母膏和0.2％(w/v)KH2PO4。
枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂的制备方法包括：将枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂培养到对数期，然后按培养基体积6％的接种量将培养到对数期的菌种接种到LB液体培养基中，30℃摇床震荡120rpm，培养48小时，加入吸附剂，干燥，制得枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂；所述吸附剂为膨润土。枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂4×109cfu/g。
枯草芽孢杆菌BNCC188062培养过程中的培养基为牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖10ml、氯化钠10g/L加水配制而成。
用于修复重金属污染的土壤的微生物制剂的制备：将沼泽红假单胞菌DSM5859菌剂、植物乳杆菌NJ2205菌剂、枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂按照0.5：1：1的质量比混合均匀得到复合菌剂；向制得的复合菌剂中加入所述固定化耐高温α-淀粉酶，混合均匀，即得所述用于修复重金属污染的土壤的微生物制剂。固定化耐高温α-淀粉酶的含量为15U/mg。
实施例2
本实施例中所采用的所有培养基同实施例1相同。
耐高温α-淀粉酶的固定化：将介孔分子筛材料SBA-15加入到耐高温α-淀粉酶中，在温度为50℃；pH为7.0；转速为180rpm；固定化时间为10h下进行固定化后获得。
沼泽红假单胞菌DSM5859菌剂的制备方法包括：将沼泽红假单胞菌DSM5859培养到对数期，然后按培养基体积6％的接种量将培养到对数期的菌种接种到培养基中，35℃摇床震荡220rpm，培养48小时，得到沼泽红假单胞菌DSM5859的发酵液，向该发酵液中加入吸附剂，干燥，即得沼泽红假单胞菌DSM5859菌剂；所述吸附剂为活性炭。沼泽红假单胞菌DSM5859菌剂的活菌含量为5×1010cfu/g。
植物乳杆菌NJ2205菌剂的制备方法包括：将植物乳杆菌NJ2205培养到对数期，然后按培养基体积6％的接种量将培养到对数期的菌种接种到LB液体培养基中，37℃摇床震荡220rpm，培养36小时，加入吸附剂，干燥，制得植物乳杆菌NJ2205菌剂；所述吸附剂为活性炭。植物乳杆菌NJ2205菌剂菌剂的活菌含量为8×1010cfu/g。
枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂的制备方法包括：将枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂培养到对数期，然后按培养基体积10％的接种量将培养到对数期的菌种接种到LB液体培养基中，35℃摇床震荡150rpm，培养36小时，加入吸附剂，干燥，制得枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂；所述吸附剂为活性炭。所述枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂7×1010cfu/g。
用于修复重金属污染的土壤的微生物制剂的制备：将沼泽红假单胞菌DSM5859菌剂、植物乳杆菌NJ2205菌剂、枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂按照2：3：5的质量比混合均匀得到复合菌剂；向制得的复合菌剂中加入所述固定化耐高温α-淀粉酶，混合均匀，即得所述用于修复重金属污染的土壤的微生物制剂。其中，固定化耐高温α-淀粉酶含量为30U/mg。
实施例3
本实施例中的培养基同实施例1相同。
耐高温α-淀粉酶的固定化：将介孔分子筛材料SBA-15加入到耐高温α-淀粉酶中，在温度为70℃；pH为6.0；转速为200rpm；固定化时间为13h下进行固定化后获得。
沼泽红假单胞菌DSM5859菌剂的制备方法包括：将沼泽红假单胞菌DSM5859培养到对数期，然后按培养基体积4％的接种量将培养到对数期的菌种接种到培养基中，32℃下，摇床震荡180rpm，培养60小时，得到沼泽红假单胞菌DSM5859的发酵液，向该发酵液中加入吸附剂，干燥，即得沼泽红假单胞菌DSM5859菌剂；所述吸附剂为膨润土和活性炭。沼泽红假单胞菌DSM5859菌剂的活菌含量为3×109cfu/g。
植物乳杆菌NJ2205菌剂的制备方法包括：将植物乳杆菌NJ2205培养到对数期，然后按培养基体积4％的接种量将培养到对数期的菌种接种到LB液体培养基中，36℃下，摇床震荡180rpm，培养42小时，加入吸附剂，干燥，制得植物乳杆菌NJ2205菌剂；所述吸附剂为膨润土和活性炭。植物乳杆菌NJ2205菌剂菌剂的活菌含量为4×1010cfu/g。
枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂的制备方法包括：将枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂培养到对数期，然后按培养基体积8％的接种量将培养到对数期的菌种接种到LB液体培养基中，32℃摇床震荡135rpm，培养42小时，加入吸附剂，干燥，制得枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂；所述吸附剂为膨润土。所述枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂的活菌含量为3×1010cfu/g。
用于修复重金属污染的土壤的微生物制剂的制备：将沼泽红假单胞菌DSM5859菌剂、植物乳杆菌NJ2205菌剂、枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂按照1：3：4的质量比混合均匀得到复合菌剂；向制得的复合菌剂中加入所述固定化耐高温α-淀粉酶，混合均匀，即得所述用于修复重金属污染的土壤的微生物制剂。固定化耐高温α-淀粉酶含量为25U/mg。
对比例1未经过固定化的酶制剂与菌剂制备得到的复合微生物菌剂
将实施例1制备的沼泽红假单胞菌DSM5859菌剂、植物乳杆菌NJ2205菌剂、枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂按照0.5：1：1的质量比混合均匀得到复合菌剂；向制得的复合菌剂中加入所述固定化耐高温α-淀粉酶，混合均匀，即得所述用于修复重金属污染的土壤的微生物制剂。固定化耐高温α-淀粉酶的含量为15U/mg。
对比例2
沼泽红假单胞菌DSM5859菌剂的制备方法包括：将沼泽红假单胞菌DSM5859培养到对数期，然后按培养基体积1％的接种量将培养到对数期的菌种接种到培养基中，25℃摇床震荡220rpm，培养48小时，得到沼泽红假单胞菌DSM5859的发酵液，向该发酵液中加入吸附剂，干燥，即得沼泽红假单胞菌DSM5859菌剂；所述吸附剂为活性炭。沼泽红假单胞菌DSM5859菌剂的活菌含量为2×107cfu/g。
植物乳杆菌NJ2205菌剂的制备方法包括：将植物乳杆菌NJ2205培养到对数期，然后按培养基体积1％的接种量将培养到对数期的菌种接种到LB液体培养基中，25℃摇床震荡220rpm，培养36小时，加入吸附剂，干燥，制得植物乳杆菌NJ2205菌剂；所述吸附剂为活性炭。植物乳杆菌NJ2205菌剂菌剂的活菌含量为3×107cfu/g。
枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂的制备方法包括：将枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂培养到对数期，然后按培养基体积2％的接种量将培养到对数期的菌种接种到LB液体培养基中，30℃摇床震荡150rpm，培养36小时，加入吸附剂，干燥，制得枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂；所述吸附剂为活性炭。所述枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂5×107cfu/g。
用于修复重金属污染的土壤的微生物制剂的制备：将沼泽红假单胞菌DSM5859菌剂、植物乳杆菌NJ2205菌剂、枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂按照2：3：5的质量比混合均匀得到复合菌剂；向制得的复合菌剂中加入实施例2中制备的固定化耐高温α-淀粉酶，混合均匀，即得所述用于修复重金属污染的土壤的微生物制剂。其中，固定化耐高温α-淀粉酶含量为30U/mg。
实施例4
用于修复重金属污染的土壤的微生物制剂对土壤中重金属的降解能力测试：
1)选取江苏省南京市江宁区汤山附近的重金属污染的土壤样品，属于粘土性土壤。样品经自然风干后，研碎，过100目尼龙筛平均分成15份，分别置于消毒后的容器中，将15份灭菌后的土壤分成5组，每组3份。
2)取实施例1～3和对比例1～2制得的用于修复重金属污染的土壤的微生物制剂，每个实施例/对比例制得的用于修复重金属污染的土壤的微生物制剂对应加入到其中一组土壤中，混合均匀，其中土壤中加入的用于修复重金属污染的土壤的微生物制剂的质量占土壤质量的0.5％。
3)两个月后检测经处理后的土壤中氨氮、农药的含量，每组3份取平均值，结果如表1所示。
表1

Claims (10)

1.一种用于修复重金属污染土壤的微生物复合制剂，其特征在于，该复合微生物菌剂包括沼泽红假单胞菌 DSM5859菌剂、植物乳杆菌NJ2205菌剂、枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂和固定化耐高温α-淀粉酶。
2.根据权利要求1所述的用于修复重金属污染土壤的微生物制剂，其特征在于，所述沼泽红假单胞菌 DSM5859菌剂、植物乳杆菌NJ2205菌剂、枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂重量比为0.5：1：1~2：3：5。
3.根据权利要求1所述的用于修复重金属污染土壤的微生物制剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂中，所述沼泽红假单胞菌 DSM5859菌剂的活菌含量为1×108~5×1010 cfu/g，植物乳杆菌NJ2205菌剂菌剂的活菌含量为3×109~8×1010 cfu/g、所述枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂4×109~7×1010 cfu/g。
4.根据权利要求1所述的用于修复重金属污染土壤的微生物制剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂中，所述固定化耐高温α-淀粉酶浓度为15~30U/mg。
5.一种制备权利要求1~4中任意一项所述的用于修复重金属污染土壤的微生物制剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1）将沼泽红假单胞菌 DSM5859菌剂、植物乳杆菌NJ2205菌剂、枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂按照0.5：1：1~2：3：5的质量比混合均匀得到复合菌剂；
2）向步骤1）制得的复合菌剂中加入所述固定化耐高温α-淀粉酶，混合均匀，即得所述用于修复重金属污染的土壤的微生物制剂。
6.根据权利要求5所述的制备用于修复重金属污染土壤的微生物制剂的方法，其特征在于，所述沼泽红假单胞菌 DSM5859菌剂的制备方法包括：将沼泽红假单胞菌 DSM5859培养到对数期，然后按培养基体积3%~6%的接种量将培养到对数期的菌种接种到培养基中，30~35℃下，摇床震荡180~220rpm，培养48~72小时，得到沼泽红假单胞菌 DSM5859的发酵液，向该发酵液中加入吸附剂，干燥，即得沼泽红假单胞菌 DSM5859菌剂；所述吸附剂为膨润土或活性炭一种或几种。
7.根据权利要求6所述的制备用于修复重金属污染土壤的微生物制剂的方法，其特征在于，所述培养基为酵母膏、乙酸钠、MgSO4、K2HPO4、蛋白胨、蛋氨酸配制而成的培养基。
8.根据权利要求5所述的所述的制备用于修复重金属污染土壤的微生物制剂的方法，其特征在于，所述植物乳杆菌NJ2205菌剂的制备方法包括：将植物乳杆菌NJ2205培养到对数期，然后按培养基体积3%~6%的接种量将培养到对数期的菌种接种到LB液体培养基中，35~37℃下，摇床震荡150~220rpm，培养36~48小时，加入吸附剂，干燥，制得植物乳杆菌NJ2205菌剂；所述吸附剂为膨润土或活性炭中的一种或几种。
9.根据权利要求5所述的所述的制备用于修复重金属污染土壤的微生物制剂的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂的制备方法包括：将枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂培养到对数期，然后按培养基体积6%~10%的接种量将培养到对数期的菌种接种到LB液体培养基中，30~35℃下，摇床震荡120~150rpm，培养36~48小时，加入吸附剂，干燥，制得枯草芽孢杆菌BNCC188062菌剂；所述吸附剂为膨润土或活性炭中的一种或几种。
10.权利要求1~4中任意一项所述的用于修复重金属污染土壤的微生物制剂的方法在重金属污染土壤修复中的应用。
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