CN111733116B - 一种光合细菌复合微生物混合培养菌剂及修复铬污染土壤的方法 - Google Patents

一种光合细菌复合微生物混合培养菌剂及修复铬污染土壤的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于复合微生物应用技术领域，具体涉及一种光合细菌复合微生物混合培养菌剂及修复铬污染土壤的方法。所述光合细菌复合微生物混合培养菌剂由光合细菌、芽孢杆菌和乳酸菌按照1:(0.4～0.8):(0.3～0.5)的菌种配比混合培养而成。所述修复铬污染土壤的方法是将混合培养后的光合细菌复合微生物混合培养菌剂兑水稀释20～100倍，以每亩10～50kg的使用量均匀喷施于铬污染的土壤，喷施完毕后翻耕地表20cm，使光合细菌复合微生物混合培养菌剂与土壤充分混匀，并保持持水率为70％，培养一个月，与单一光合细菌发酵液相比，可使Cr(VI)的生物可利用性降低30％～60％，效果显著，且绿色环保，修复效果高效稳定，具有广阔的应用前景。

Description

一种光合细菌复合微生物混合培养菌剂及修复铬污染土壤的 方法
技术领域
本发属于复合微生物应用技术领域，具体涉及一种光合细菌复合微生物混合培养菌剂及修复铬污染土壤的方法。
背景技术
由于采矿、工业三废排放、城市生活垃圾堆放等众多原因，农业土壤的铬污染日益严重。环境中铬的价态通常在II-VI之间，而三价和六价两种价态相对稳定，其中Cr(VI)的毒性比Cr(III)高约10～100倍，具有致突变性、致癌性及致畸性，被归为“A”类人类致癌物。因此，对铬污染土壤的治理刻不容缓。
目前针对六价铬污染土壤的修复思路主要是通过改变铬在土壤中的存在形式，将Cr(Ⅵ)还原成Cr(Ⅲ)，降低铬在环境中的迁移能力和生物可利用性。微生物修复是一种环境友好的治理技术，具有较好的发展前景。有关微生物修复铬污染土壤研究已有较多文献报道(Goulhen F,et al.Applied Microbiology and Biotechnology,2006,71(6)；DhalB,et al.Journal of Chemical Technology&Biotechnology,2010,85；许友泽等,环境化学,2011,30(2)；肖文丹等,中国环境科学,2017,37(3)；叶斌晖等,环境科学学报,2018,7；Su C Q,Transactions of Nonferrous Metals Society of China,2018,29；焦仕林,华中科技大学硕士论文,2016；杜艳影,安徽农业大学硕士论文,2018；林薇,内蒙古科技大学硕士论文,2019；苏眉，华南理工大学硕士论文,2019)。但是，上述报道针对铬污染土壤处理的微生物菌剂为单一菌剂，且大部分尚不能完全使菌剂从实验室走向实际应用。
光合细菌是一种以光为能源，以CO2或有机物为碳源而营养繁殖的微生物，具有培养原料来源广，价格便宜，生长条件容易控制，并且菌体可以循环利用等优点，近年来在农业上获得了较为广泛的应用。已经公开的发明专利“光合细菌发酵液在氨基甲酸酯类农药、金属复合污染土壤修复中的应用”中所述的金属污染为铅、镉、汞、铜、锌、镍污染，基本原理是通过光合细菌的同化型硫酸盐作用生成半胱氨酸，再在半胱氨酸脱巯基酶作用下产生S2-，S2-与二价的金属离子M2+生成沉淀MS(光合细菌发酵液在氨基甲酸酯类农药、金属复合污染土壤修复中的应用，ZL201010102446.7)。有关光合细菌在水体中还原六价铬的研究也有文献报道，(康鹏洲等,国际药学研究杂志,2018,45(5))。芽孢杆菌和乳酸菌都是益生菌，具有繁殖速度快、提高肥效、促进吸收和增强抗病力等多种生物功能。有关芽孢杆菌、乳酸菌和光合细菌等菌株制成的复合微生物肥料已有文献报道(一种含有枯草芽孢杆菌的微生物肥料，201210003711.5)，其中的菌种发酵液是分别单独培养，然后以一定的比例混合制成复合微生物肥料，该发明的目的是提供一种具有较好抗病能力的微生物肥料。对光合细菌、芽孢杆菌和乳酸菌三种复合微生物混合培养菌剂以及应用于生物修复铬污染的土壤的技术未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种光合细菌复合微生物混合培养菌剂及修复铬污染土壤的方法。光合细菌、芽孢杆菌和乳酸菌混合培养的复合微生物菌剂发挥互惠、协同、共生等作用，可以高效地降低铬的生物可利用性。
本发明采用的技术方案如下：
一种光合细菌复合微生物混合培养菌剂，它由光合细菌、芽孢杆菌和乳酸菌按照1:(0.4～0.8):(0.3～0.5)的菌种配比混合培养而成，混合培养后的光合细菌、芽孢杆菌和乳酸菌的有效活菌数分别为108～1010CFU/ml、107～109CFU/ml和107～109CFU/ml。
进一步地，所述的光合细菌是下列光合细菌属中的任意一种或它们的任意比例混合菌株：红细菌属Rhodobacter，红假单胞菌属Rhodopseudomonas，红螺菌属Rhodospirillum。
进一步地，所述的芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis或坚强芽孢杆菌Bacillus firmus中的任意一种。
进一步地，所述的乳酸菌为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。
本发明还提供了一种使用上述光合细菌复合微生物混合培养菌剂修复铬污染土壤的方法，包括以下步骤：
步骤一、制备光合细菌复合微生物混合培养菌剂：将光合细菌、芽孢杆菌、和乳酸菌按照菌种配比为1:(0.4～0.8):(0.3～0.5)的比例进行混合培养，混合培养后光合细菌、芽孢杆菌和乳酸菌的有效活菌数分别为108～1010CFU/ml、107～109CFU/ml和107～109CFU/ml；
步骤二、将混合培养后的光合细菌复合微生物混合培养菌剂兑水稀释20～100倍，以每亩10～50kg的使用量均匀喷施于铬污染的土壤，喷施完毕后翻耕地表20cm，使光合细菌复合微生物混合培养菌剂与土壤充分混匀，并保持持水率为70％，培养一个月。
进一步地，所述铬污染土壤的pH值为5.0～9.0。
进一步地，所述铬污染土壤的pH值为7.0～7.5。
进一步地，在喷施光合细菌复合微生物混合培养菌剂前两天对待处理的铬污染土壤进行漫灌。
本发明的有益效果是：本发明光合细菌复合微生物混合菌剂为光合细菌、枯草芽孢杆菌和乳酸菌复合培养而成，可用于钝化土壤中铬重金属，三种微生物之间存在明显的协同作用，与单一光合细菌发酵液相比，Cr(VI)的生物可利用性降低30％～60％，效果显著，且绿色环保，修复效果高效稳定，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。
以下实施例中使用的菌株来源如下：
1、球形红细菌CGMCC1.5028和沼泽红假单胞菌CGMCC 1.8929购买自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2、深红红螺菌ATCC11170购自河南寻梦电子商务有限公司。
3、枯草芽孢杆菌CGMCC 1.3358购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
4、坚强芽孢杆菌Bacillus firmus(文献出处：王芳，胡培毅，李莎等，玉米秸杆降解菌筛选鉴定及其盆栽试验对生土性能影响，东北农业大学学报，2016，47(12):30～37)来自于山西省太原市中北大学化学工程与技术学院。
5、植物乳杆菌AS1.3＝ATCC8014购自河南寻梦电子商务有限公司。
以下实施例中使用的光合细菌、芽孢杆菌和乳酸菌是采用下述适合微生物生长的培养基培养得到的：
芽孢杆菌：
一级培养
蔗糖15000mg，酵母膏500mg，KH2PO4 600mg，CaCl2 70mg，MgSO4.7H2O200mg，NaCl300mg，琼脂30000mg，pH 7～7.2，去离子水1000ml。
二级培养
一级培养基去掉琼脂，培养条件相同。
乳酸菌：
一级培养
蔗糖15000mg，酵母膏500mg，KH2PO4 600mg，CaCl2 70mg，MgSO4.7H2O200mg，NaCl300mg，琼脂30000mg，pH 6～8，去离子水1000ml。
二级培养
一级培养基去掉琼脂，培养条件相同。
光合细菌：
一级培养
乙酸钠1500mg，酵母膏1000mg，KH2PO4 600mg，CaCl2 70mg，MgSO4.7H2O200mg，NaCl300mg，琼脂30000mg，pH 6～8，去离子水1000～2000ml。
二级培养
一级培养基去掉琼脂，培养条件相同。
以下实施例中使用的光合细菌、芽孢杆菌、乳酸菌的菌种配比为1:(0.4～0.8):(0.3～0.5)的光合细菌复合微生物混合培养菌剂是采用下述适合三种微生物协同生长的培养基(以下简称为复合微生物培养基)混合培养得到的：
Figure BDA0002634106890000051
其中，微量元素溶液的组成为：
Figure BDA0002634106890000061
以上培养基的pH值为5～9。
实施例1
本实施例中的一种光合细菌复合微生物混合培养菌剂，它由球形红细菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌按照1:0.5:0.3的菌种配比混合培养而成。
采用上述光合细菌复合微生物混合培养菌剂修复铬污染土壤的方法，包括以下步骤：
步骤一、将光合细菌球形红细菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌分别用各自的二级培养基培养6天，然后采用各自的一级培养基进行活菌计数；将球形红细菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌按照1:0.5:0.3进行复合配比，在经灭菌的复合微生物培养基中接入1/20份数的复合微生物，在光照2500lux、温度30℃、转速150rpm磁力搅拌，培养10天，得到球形红细菌、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌混合培养的光合细菌复合微生物混合培养菌剂，有效活菌数分别为球形红细菌3×109CFU/ml、枯草芽孢杆菌3×107CFU/ml和植物乳杆菌3×107CFU/ml。
步骤二、在一亩经检测铬污染浓度为25mg/kg、pH 7.5的土壤中，在喷施菌剂前2天对处理土壤进行漫灌，按照每亩10kg光合细菌复合微生物混合培养菌剂(按球形红细菌3×109CFU/ml进行计算，如菌液浓度更大可稀释)兑70倍的水喷施于处理土壤，喷施完毕后采用机械翻耕地表20cm左右，使菌液与土壤充分混匀，并保持持水率为70％，环境温度为35℃。对照组以单一球形红细菌发酵液进行喷施，其它条件一致，第30天取样检测，实验结果：实验组与对照组相比，Cr(VI)的生物可利用性降低45％。
实施例2
本实施例中的一种光合细菌复合微生物混合培养菌剂，它由沼泽红假单胞菌、坚强芽孢杆菌、植物乳酸菌按照1:0.6:0.4的菌种配比混合培养而成。
采用上述光合细菌复合微生物混合培养菌剂修复铬污染土壤的方法，包括以下步骤：
步骤一、光合细菌沼泽红假单胞菌、坚强芽孢杆菌、植物乳杆菌分别用各自的二级培养基培养7天，然后采用各自的一级培养基进行活菌计数；按照沼泽红假单胞菌、坚强芽孢杆菌、植物乳酸菌的菌种配比为1:0.6:0.4，使用实施例1中的复合微生物培养基和培养方法，得到沼泽红假单胞菌、坚强芽孢杆菌、植物乳酸菌组成的光合细菌复合微生物混合培养菌剂，有效活菌数分别为沼泽红假单胞菌6×108CFU/ml、坚强芽孢杆菌5×107CFU/ml和植物乳酸菌5×107CFU/ml。
步骤二、在一亩经检测铬污染浓度35mg/kg、pH6.5的土壤中，在喷施菌剂前2天对处理土壤进行漫灌，按照每亩10kg光合细菌复合微生物混合培养菌剂(按沼泽红假单胞菌6×108CFU/ml进行计算，如菌液浓度更大可稀释)兑50倍的水喷施于处理土壤，喷施完毕后采用机械翻耕地表20cm左右，使菌液与土壤充分混匀，并保持持水率为70％，环境温度为20℃。对照组以单一坚强芽孢杆菌发酵液进行喷施，其它条件一致，第30天取样检测，实验结果：实验组与对照组相比，Cr(VI)的生物可利用性降低35％。
实施例3
本实施例中的一种光合细菌复合微生物混合培养菌剂，它由深红红螺菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌按照1:0.4:0.5的菌种配比混合培养而成。
采用上述光合细菌复合微生物混合培养菌剂修复铬污染土壤的方法，包括以下步骤：
步骤一、光合细菌深红红螺菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌分别用各自的二级培养基培养6天，然后采用各自的一级培养基进行活菌计数；深红红螺菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌的菌种配比为1:0.4:0.5，使用实施例1中的复合微生物培养基和培养方法，得到深红红螺菌、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌复合的光合细菌复合微生物混合培养菌剂，有效活菌数分别为深红红螺菌8×109CFU/ml、枯草芽孢杆菌2×107CFU/ml和植物乳杆菌6×107CFU/ml。
步骤二、在一亩经检测铬污染浓度50mg/kg、pH 7.0的土壤中，在喷施菌剂前2天对处理土壤进行漫灌，按照每亩10kg光合细菌复合微生物混合培养菌剂(按深红红螺菌8×109CFU/ml进行计算，如菌液浓度更大可稀释)兑60倍的水喷施于处理土壤，喷施完毕后采用机械翻耕地表20cm左右，使菌液与土壤充分混匀，并保持持水率为70％，环境温度为30℃。对照组以单一枯草芽孢杆菌发酵液进行喷施，其它条件一致，第30天取样检测，实验结果：实验组与对照组相比，Cr(VI)的生物可利用性降低50％。
实施例4
本实施例中的一种光合细菌复合微生物混合培养菌剂，它由深红红螺菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌按照1:0.8:0.5的菌种配比混合培养而成。
采用上述光合细菌复合微生物混合培养菌剂修复铬污染土壤的方法，包括以下步骤：
步骤一、光合细菌深红红螺菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌分别用各自的二级培养基培养6天，然后采用各自的一级培养基进行活菌计数；深红红螺菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌的菌种配比为1:0.8:0.5，使用实施例1中的复合微生物培养基和培养方法，得到深红红螺菌、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌复合的光合细菌复合微生物混合培养菌剂，有效活菌数分别为深红红螺菌8×109CFU/ml、枯草芽孢杆菌8×108CFU/ml和植物乳杆菌6×107CFU/ml。
步骤二、在一亩经检测铬污染浓度50mg/kg、pH 9.0的土壤中，在喷施菌剂前2天对处理土壤进行漫灌，按照每亩50kg光合细菌复合微生物混合培养菌剂(按深红红螺菌8×109CFU/ml进行计算，如菌液浓度更大可稀释)兑100倍的水喷施于处理土壤，喷施完毕后采用机械翻耕地表20cm左右，使菌液与土壤充分混匀，并保持持水率为70％，环境温度为38℃。对照组以单一枯草芽孢杆菌发酵液进行喷施，其它条件一致，第30天取样检测，实验结果：实验组与对照组相比，Cr(VI)的生物可利用性降低30％。
实施例5
本实施例中的一种光合细菌复合微生物混合培养菌剂，它由沼泽红假单胞菌、坚强芽孢杆菌、植物乳酸菌按照1:0.6:0.4的菌种配比混合培养而成。
采用上述光合细菌复合微生物混合培养菌剂修复铬污染土壤的方法，包括以下步骤：
步骤一、光合细菌沼泽红假单胞菌、坚强芽孢杆菌、植物乳杆菌分别用各自的二级培养基培养7天，然后采用各自的一级培养基进行活菌计数；按照沼泽红假单胞菌、坚强芽孢杆菌、植物乳酸菌的菌种配比为1:0.6:0.4，使用实施例1中的复合微生物培养基和培养方法，得到沼泽红假单胞菌、坚强芽孢杆菌、植物乳酸菌组成的光合细菌复合微生物混合培养菌剂，有效活菌数分别为沼泽红假单胞菌6×108CFU/ml、坚强芽孢杆菌5×107CFU/ml和植物乳酸菌5×107CFU/ml。
步骤二、在一亩经检测铬污染浓度35mg/kg、pH5.0的土壤中，在喷施菌剂前2天对处理土壤进行漫灌，按照每亩30kg光合细菌复合微生物混合培养菌剂(按沼泽红假单胞菌6×108CFU/ml进行计算，如菌液浓度更大可稀释)兑20倍的水喷施于处理土壤，喷施完毕后采用机械翻耕地表20cm左右，使菌液与土壤充分混匀，并保持持水率为70％，环境温度为30℃，光照度为2500lux。对照组以单一坚强芽孢杆菌发酵液进行喷施，其它条件一致，第30天取样检测，实验结果：实验组与对照组相比，Cr(VI)的生物可利用性降低30％。
在修复铬污染土壤时的环境温度在20～40℃之间，30～35℃之间最佳；光合细菌在有光和无光条件下均可生存，但在光照度为2500lux左右时候修复效果最佳。
以上实施例仅为了对本发明作进一步的说明，而本发明的范围不受所举实施例的局限。

Claims (5)

1.一种光合细菌复合微生物混合培养菌剂，其特征在于：它由光合细菌、芽孢杆菌和乳酸菌按照1: (0.4~0.8): (0.3~0.5) 的菌种配比混合培养而成，混合培养后的光合细菌、芽孢杆菌和乳酸菌的有效活菌数分别为108~1010 CFU/ml、107~109 CFU/ml和107~109 CFU/ml；所述混合培养是将光合细菌、芽孢杆菌和乳酸菌按照上述比例复配后加入到培养基中进行混合培养，在光照2500lux、温度30°C、转速150rpm磁力搅拌的条件下培养10天，即得到所述光合细菌复合微生物混合培养菌剂；
所述光合细菌为球形红细菌CGMCC1.5028、沼泽红假单胞菌CGMCC 1.8929、深红红螺菌ATCC11170中的任意一种；所述的芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌CGMCC 1.3358或坚强芽孢杆菌Bacillus firmus中的任意一种；所述乳酸菌为植物乳杆菌 AS1.3=ATCC8014。
2.使用权利要求1所述光合细菌复合微生物混合培养菌剂修复铬污染土壤的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、制备光合细菌复合微生物混合培养菌剂：将光合细菌、芽孢杆菌、和乳酸菌按照菌种配比为1: (0.4~0.8): (0.3~0.5)的比例进行混合培养，混合培养后光合细菌、芽孢杆菌和乳酸菌的有效活菌数分别为108~1010 CFU/ml、107~109 CFU/ml和107~109 CFU/ml；
步骤二、将混合培养后的光合细菌复合微生物混合培养菌剂兑水稀释20~100倍，以每亩10~50kg的使用量均匀喷施于铬污染的土壤，喷施完毕后翻耕地表20cm，使光合细菌复合微生物混合培养菌剂与土壤充分混匀，并保持持水率为70%，培养一个月。
3.根据权利要求2所述的修复铬污染土壤的方法，其特征在于：所述铬污染土壤的pH值为5.0~9.0。
4.根据权利要求3所述的修复铬污染土壤的方法，其特征在于：所述铬污染土壤的pH值为7.0~7.5。
5.根据权利要求2所述的修复铬污染土壤的方法，其特征在于：在喷施光合细菌复合微生物混合培养菌剂前两天对待处理的铬污染土壤进行漫灌。
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微生物产生的酶抑制剂研究1.蛋白酶抑制剂的筛选方法探讨;刘华珍等;《抗生素》;19831231;第8卷(第5期);全文 *

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