CN108707181A - 一种抑制肿瘤细胞增殖的苦瓜多肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑制肿瘤细胞增殖的苦瓜多肽及其制备方法和应用。所述制备方法包括如下步骤：步骤一：将苦瓜切块备用；步骤二：制备粗研磨料液；步骤三：将粗研磨料液置于‑40～‑80℃下冷冻；步骤四：解冻；研磨，筛网过滤，得细研磨料液；步骤五：冷冻离心机中离心，取上清液；步骤六：高速冷冻离心机中离心，取上清液；步骤七：超滤，膜包孔径为10KD，小于10KD的滤液即为所述苦瓜多肽。该方法可以一定程度的破坏细胞壁，活性物质的溶出率高，再结合超滤技术获得的苦瓜生物活性肽活性较高，而且工艺易于进入产业化。同时，原料苦瓜具有食用安全、无毒副作用、营养价值高等优点。另外，制备得到的苦瓜多肽具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抑制肿瘤细胞增殖的苦瓜多肽及其制备方法和应用。
背景技术
苦瓜是一种传统的中药材，具有清热消暑、养血益气、补肾健脾、滋肝明目的功效。为葫芦科植物苦瓜的果实。传统上被用于民间药物治疗消化性溃疡，肾结石，湿疹Ⅱ型糖尿病，其次，苦瓜的维生素C含量很高，具有预防坏血病、保护细胞膜、防止动脉粥样硬化、提高机体应激能力、保护心脏，以及苦瓜中的有效成分可以抑制正常细胞的癌变和促进突变细胞的复原抗癌特性等作用。中国自古以来，就把苦瓜当作药用植物来利用。在《救荒本草》和《本草纲目》等古文献里，都曾经提到苦瓜。
生物活性肽是指具有特殊生物活性的多肽。在蛋白质的空间结构中具有生物活性的多肽类，通过相应的技术，可将其释放出来，单独从蛋白链中释放片断，可显示出独特的生物活性。生物活性肽具有丰富的生物学功能，如降胆固醇、改善元素吸收和矿物质运输、免疫调节抗衰老、抗血栓、抗高血压、激素作用、促进生长、抗氧化、调节口味和硬度、食品风味等。所以，生物活性肽是选药物、制疫苗及食品添加剂的天然资源库。近年来，随着科技的进步和人们生活水平的提高，天然产物和功能性多肽成为研究热点。目前研究较多的则是抗菌肽、抗压肽、抗氧化肽、免疫肽及抗肿瘤肽等，这些在医疗保健、食品加工等行业有着较大的影响。
从来源上可以将活性肽分为：动植物源性活性肽、乳源性活性肽、海洋生物活性肽以及家禽动物源性活性肽。从功能上可以将活性肽分为：生理功能活性肽(抗菌肽、神经活性肽、激素肽、激素调节肽、酶调节剂和抑制剂、免疫活性肽、抗氧化肽)和食品感官肽(口味肽、表面活性肽、营养肽)。
目前对功能性生物活性肽的提取方法的研究主要从生物体中直接分离提取天然生物活性肽；通过体外水解蛋白质得到生物活性肽；利用化学法合成或重组DNA技术合成活性肽；或通过物理的方法分离。化学法主要是利用酸碱对蛋白进行水解，这种方法操作简单，反应条件剧烈，获得的肽不能够很好的控制，对后续分离纯化也有一定的影响；酶法水解蛋白是利用生物酶对特定的肽键进行剪切，该方法作用条件温和，可以利用特定的酶定向生产小分子肽，但是该方法水解时间较长；利用DNA技术合成生物活性肽实现了肽的定向生产，该方法主要是利用质粒、噬菌体等载体实现基因工程手段的，但是该方法的安全性不可控。所以筛选出一种作用条件温和、生物活性肽含量高、适于生产的的制备工艺有着重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制肿瘤细胞增殖的苦瓜多肽的制备方法，用以解决现有的制备方法反应条件剧烈，获得的肽不能够很好的控制、水解时间较长或者安全性不可控的问题。制备与人体健康密切相关并具有抗肿瘤功能的生物活性肽，其为新型功能性食品及保健品。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种抑制肿瘤细胞增殖的苦瓜多肽的制备方法，所述方法包括如下步骤：
步骤一：将苦瓜切块备用；
步骤二：将苦瓜和液体一起加入到研磨仪中研磨，得到粗研磨料液；
步骤三：将粗研磨料液置于-40～-80℃下冷冻8～24h(或者冷冻过夜)；
步骤四：解冻粗研磨料液；放入研磨仪中研磨，300～500目筛网过滤，得细研磨料液；
步骤五：将细研磨料液置于冷冻离心机中，4000～5000转离心，取上清液；
步骤六：将步骤五中所得上清液置于高速冷冻离心机中，9000～10000转离心，取上清液；
步骤七：采用超滤机将步骤六中所得上清液进行超滤，膜包孔径为10KD；流速随液体进超滤机后压力改变量而随时设定。
超滤后，小于10KD的滤液即为所述苦瓜多肽。
作为一种优选的方案，步骤一中，将新鲜苦瓜用清水洗净，去除蒂后再切块。该苦瓜无任何添加剂，无毒副作用。
作为一种优选的方案，步骤二中，所述苦瓜和液体的质量比为1:1～1:3；所述液体为pH＝7的超纯水，均为可食用物质。
作为一种优选的方案，步骤二中，采用RETSCH GM300刀式研磨仪，转速为2000rpm，研磨2min～5min。
作为一种优选的方案，步骤四中，采用GM300刀式研磨仪，转速为2000rpm，研磨2min～5min。
作为一种优选的方案，步骤五中，离心10～20min。
作为一种优选的方案，步骤六中，离心10～20min。
作为一种优选的方案，步骤七中所得大于10KD滤液返回步骤三，依次重复步骤三到步骤七。
作为一种优选的方案，所述方法还包括如下步骤：
步骤八：将小于10KD滤液过0.22nm除菌膜，4℃保存。
本发明的第二个目的是提供一种抑制肿瘤细胞增殖的苦瓜多肽，所述苦瓜多肽由如上所述方法制备得到。
本发明的第三个目的是提供一种如上所述的苦瓜多肽的应用，所述苦瓜多肽作为制备用于抑制肿瘤细胞增殖的特膳食品、保健食品或药品的原料。
本发明具有如下优点：
本发明采用物理法制备苦瓜多肽：研磨-冷冻-融解。冻融法可以一定程度的破坏细胞壁，活性物质的溶出率高，再结合超滤技术获得的苦瓜生物活性肽活性较高，而且工艺易于进入产业化。原料来源于食药两用的植物苦瓜，具有食用安全、无毒副作用、营养价值高，而且具有稳定性良好、能直接被肠道粘膜吸收从而真正实现高吸收的优势，抗肿瘤生物活性及作用强等优点。同时本发明证实了苦瓜生物活性肽抗肿瘤细胞增殖的作用机制与诱导肿瘤细胞凋亡以及调控增殖、凋亡等通路中基因表达相关。
本发明所涉及的一种苦瓜多肽是利用适于产业化的现代生物学技术，从药食两用的苦瓜制成的功能性食品/功能性保健品，具有稳定性良好、生物学效价高、能直接被肠道粘膜吸收从而真正实现高吸收的优势，无毒、无副作用，具有较好的抗肿瘤作用，其作用机制与调控细胞增殖、凋亡、调节免疫相关通路中基因表达相关，从而达到抗癌的目的。
此发明对促进人体的健康有着重要的意义。作为一种高效安全的生物活性肽，其良好的生物学特性，苦瓜多肽应用前景广阔。
附图说明
图1是本发明的苦瓜多肽提取流程以及功能示意图。
图2是实施例1制备的苦瓜多肽抑制胃癌AGS细胞增殖的作用随药物作用时间变化的示意图。
图3是实施例1制备的苦瓜多肽抑制胃癌MGC-803细胞增殖的作用随药物作用时间变化的示意图。
图4是实施例2制备的苦瓜多肽对AGS细胞凋亡的影响(FACS凋亡检测)示意图。
图5是实施例2制备的苦瓜多肽对MGC-803细胞凋亡的影响(FACS凋亡检测)示意图。
图6是半胱天冬酶caspase3/7检测实施例2制备的苦瓜多肽诱导肿瘤细胞AGS凋亡作用示意图。
图7是半胱天冬酶caspase3/7检测实施例2制备的苦瓜多肽诱导肿瘤细胞MGC-803凋亡作用示意图。
图8是克隆形成检测(MGC-803细胞)示意图。
图9是克隆形成检测(AGS细胞)示意图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供一种抑制肿瘤细胞增殖的苦瓜多肽的制备方法，如图1所示，所述方法包括如下步骤：
步骤一：将新鲜苦瓜用清水洗净，去除蒂，切小块备用。
步骤二：称量，以料液1：2比例加入RETSCH GM300刀式研磨仪中，2000rpm，3min，得粗研磨料液(液体采用超纯水pH＝7)。
步骤三：将粗研磨料液-60℃冷冻12h。
步骤四：解冻粗研磨料液，GM300研磨仪，2000rpm，3min，400目筛网过滤，得细研磨料液。
步骤五：细研磨料液，冷冻离心机4000转离心15min，保留上清。
步骤六：上清液以高速冷冻离心机9000转离心15min，取上清。
步骤七：采用超滤机进行超滤。膜包孔径大小为10KD，流速随液体进超滤机后压力改变量而随时设定。
步骤八：超滤后，大于10KD滤液-60℃冷冻保存，小于10KD滤液过0.22nm除菌膜，4℃保存。
小于10KD滤液为本发明目标提取的苦瓜多肽混合液。
实施例2
本实施例提供一种抑制肿瘤细胞增殖的苦瓜多肽的制备方法，所述方法包括如下步骤：
步骤一：将新鲜苦瓜用清水洗净，去除蒂，切小块备用。
步骤二：称量，以料液1：3比例加入RETSCH GM300刀式研磨仪中，2000rpm，2min，得粗研磨料液(液体采用超纯水pH＝7)。
步骤三：将粗研磨料液-40℃冷冻8h。
步骤四：解冻粗研磨料液，GM300研磨仪，2000rpm，2min，300目筛网过滤，得细研磨料液。
步骤五：细研磨料液，冷冻离心机4000转离心10min，保留上清。
步骤六：上清液以高速冷冻离心机9000转离心10min，取上清。
步骤七：采用超滤机进行超滤。膜包孔径大小为10KD，流速随液体进超滤机后压力改变量而随时设定。
步骤八：超滤后，大于10KD滤液-40℃冷冻保存，小于10KD滤液过0.22nm除菌膜，4℃保存。
小于10KD滤液为本发明目标提取的苦瓜多肽混合液。
实施例3
本实施例提供一种抑制肿瘤细胞增殖的苦瓜多肽的制备方法，所述方法包括如下步骤：
步骤一：将新鲜苦瓜用清水洗净，去除蒂，切小块备用。
步骤二：称量，以料液1：1比例加入RETSCH GM300刀式研磨仪中，2000rpm，5min，得粗研磨料液(液体采用超纯水pH＝7)。
步骤三：将粗研磨料液-80℃冷冻24h。
步骤四：解冻粗研磨料液，GM300研磨仪，2000rpm，5min，500目筛网过滤，得细研磨料液。
步骤五：细研磨料液，冷冻离心机5000转离心20min，保留上清。
步骤六：上清液以高速冷冻离心机10000转离心20min，取上清。
步骤七：采用超滤机进行超滤。膜包孔径大小为10KD，流速随液体进超滤机后压力改变量而随时设定。
步骤八：超滤后，大于10KD滤液-80℃冷冻保存，小于10KD滤液过0.22nm除菌膜，4℃保存。
小于10KD滤液为本发明目标提取的苦瓜多肽混合液。
本发明证实了苦瓜生物活性肽抗肿瘤细胞增殖的作用机制与诱导肿瘤细胞凋亡以及调控增殖、凋亡等通路中基因表达相关。这些药理作用，通过以下的药效学实验证明：
实验一：CCK8-药敏检测证实了苦瓜多肽对二株胃癌细胞增殖具有较好的抑制作用
一、实验目的
使用CCK8方法检测不同药物浓度、不同时间点作用下，苦瓜多肽对分化不同的肿瘤细胞AGS、MGC80-3增殖抑制作用(两株肿瘤细胞购自细胞库。MGC-803细胞系是取自一位53岁男子原发性胃低分化黏液样腺癌患者建立而来。AGS细胞系是取自一位54岁女性原发性胃低分化腺癌患者建立而来)。
二、实验流程
1.复苏准备目的细胞：AGS、MGC80-3；
2.配制药物溶液(实施例1制备得到)：苦瓜多肽；
3.药物处理后进行CCK8检测。
三、实验步骤
1.复苏准备细胞，开始日期：2016年10月31日
1)从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻；
2)完全解冻后，1300rpm，离心3min，75％酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜；
3)吸去冻存液上清，加入1mL新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3mL完全培养基的6-cm dish中，轻轻晃匀后置于37℃、5％CO2培养箱；
4)24h后更换一次培养液继续培养，待细胞汇合度达80％左右传代培养，保持细胞良好的生长状态。
细胞培养基信息如表1所示：
表1
| 细胞名 | 培养基信息 |
| AGS | F12+10％FBS |
| MGC80-3 | 1640+10％FBS |
配制苦瓜多肽对胃癌细胞作用检测用溶液：
母液浓度为715mg/ml，用培养基稀释10倍，使得浓度为71.5mg/ml。
CCK8药敏实验设计如表2所示：
表2
1)将处于对数生长期的各细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，并计数；
2)按4000cell/well进行细胞铺板，培养体系为每孔100μl，每组设置3孔重复；
3)统一铺好细胞后，放入细胞培养箱中培养；
4)第二天按实验设计加药，加药前，将细胞进行Celigo扫板，保存扫板图片；
5)药物作用不同时间点后(根据实验设计)，将细胞进行Celigo扫板，之后每孔加入10μl CCK-8试剂于孔中，培养箱中孵育2.5h；
6)2.5h后，无需换液，取出96孔板置于振荡器上振荡2min，酶标仪450nm检测OD值；
7)数据分析。如图2所示，苦瓜多肽具有抑制胃癌AGS细胞增殖的作用；如图3所示，苦瓜多肽具有抑制胃癌苦MGC80-3细胞增殖的作用。
实验二：苦瓜多肽在分化不同的AGS和MGC80-3胃癌细胞上的功能验证
一、实验目的
将药物作用于目的细胞，进行一系列的细胞功能检测实验，确认药物对细胞的影响。
二、实验流程
1.准备药物(实施例2制备得到)：苦瓜多肽；
2.复苏准备目的细胞：AGS；
3.药物作用于细胞后功能实验：流式细胞凋亡检测、半胱天冬酶caspase3/7检测、克隆形成实验。
三、实验步骤
1.准备药物
称取苦瓜多肽，用培养基配制浓度为710mg/ml的药物母液。
2.复苏准备细胞
调整好AGS和MGC80-3细胞状态，准备后续加药实验。
3.目的细胞加药
将处于对数生长期的细胞胰酶消化，离心，用完全培养基重悬后，将细胞接种至6孔培养板中，继续培养保证加药时细胞密度达到35％左右。
1)次日待细胞贴壁后，加入BG药物，实验设计如表3所示：
表3
2)苦瓜多肽处理细胞48小时后，收集细胞继续进行后续细胞功能检测实验。
4.目的细胞药物处理后功能检测实验
4.1细胞凋亡检测，药物处理48小时后检测
1)收集好上清，并胰酶消化细胞，完全培养基重悬成细胞悬液，与上清细胞收集于同一5mL离心管中，每组设三个复孔(为保证上机细胞数足够，细胞数目≥5×105/处理)。
2)1300rmp离心5min，弃上清，4℃预冷的D-Hanks(pH＝7.2～7.4)洗涤细胞沉淀。
3)1×bindingbuffer洗涤细胞沉淀一次，1300rmp，3min离心，收集细胞。
4)200μL 1×bindingbuffer重悬细胞沉淀。
5)加入10μLAnnexinV-APC染色，室温避光15min。
6)根据细胞量，补加400-800μL 1×binding buffer，上机检测。
7)结果分析，使用流式细胞仪分析软件guava InCyte进行分析。
8)数据分析。
苦瓜多肽对AGS细胞凋亡的影响(FACS凋亡检测)如图4所示，苦瓜多肽对MGC-803细胞凋亡的影响如图5所示。
4.2caspase3/7检测，苦瓜多肽处理细胞48小时后铺细胞检测
1)将各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，并计数，在室温中调整细胞悬液浓度至1.5×104细胞/孔，并将目的细胞与阴性对照细胞按照每孔100μl加入新的96孔板中，同时设置一组不含细胞的空对照组(只加入培养基100μl/孔)。
2)每孔中加入100μl Caspase-Glo反应液，加样过程中注意更换枪头，严格避免交叉污染。
3)将加有细胞的培养板置于摇板机上以300-500rpm的转速轻摇30分钟混匀，然后室温孵育2小时。
4)使用仪器测定信号强度。
5)数据分析。
caspase3/7检测进一步证实了苦瓜多肽诱导肿瘤细胞凋亡作用，如图6和图7所示。
4.3细胞克隆形成检测，苦瓜多肽处理细胞48小时后种板培养
1)将各实验组细胞胰酶消化，完全培养基重悬，制成细胞悬液，计数。
2)细胞接种：于6孔板培养板中各实验组接种500个细胞/孔，每个实验组设3个复孔。
3)将接种好的细胞于培养箱中继续培养10天，中途每3天进行换液并观察细胞状态。
4)实验终止前荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照，PBS洗涤细胞1次。
5)每孔加入1mL4％多聚甲醛，固定细胞60min，PBS洗涤细胞1次。
6)每孔加入洁净、无杂质GIEMSA染液500μL，染细胞20min。
7)ddH2O洗涤细胞数次，晾干，扫描孔板，并针对孔板中的克隆进行计数。
8)数据分析。
如图8和图9所示，克隆形成检测进一步证实苦瓜多肽具有抑制肿瘤细胞增殖的功能。
实验三：
一、实验目的
通过Affymetrix表达谱芯片探讨苦瓜多肽对胃癌细胞增殖抑制作用调控基因：获得对照组与苦瓜多肽处理组差异基因，发现苦瓜多肽调控增殖、凋亡、免疫调节基因。
二、实验流程
1.准备目的细胞：胃癌AGS细胞；
2.配制药物溶液(实施例3制备得到)：苦瓜多肽；
3.苦瓜多肽处理后收集细胞；
4.提取RNA，2100质检；
5.AF表达谱芯片检测；
6.IPA分析；
7.生信分析，确定HCS待筛基因列表。
三、实验步骤
1.准备细胞
调整好细胞状态，准备进行加药实验。
细胞培养基信息如表4所示：
表4
| 细胞名 | 培养基信息 |
| AGS | F12+10％FBS |
2.配制药物溶液
母液浓度为715mg/ml，用培养基稀释为8.9mg/ml，共准备17ml药物稀释液。
3.细胞加苦瓜多肽处理，制备芯片样品
1)将处于对数生长期的细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，并计数；
2)按2E+05cell/well进行细胞铺板，培养体系为每孔2ml，每组设置4孔重复，共设置2组，分别为加药处理组，及不加药处理的对照组；
3)统一铺好细胞后，放入细胞培养箱中培养；
4)第二天(细胞密度约为35％左右)按实验设计加药：
加药组细胞：换液为终浓度8.9mg/ml的BG药物稀释液；
不加药组细胞：换液为新鲜的正常培养基；
6孔板，每组4个重复孔；
5)药物作用48小时后，弃上清，收集细胞，Trizol裂解。
4.总RNA抽提
1)弃去细胞培养上清，加入1mL Trizol，充分混匀后室温静置5min，然后转移至新的1.5mL EP管中；
2)每管加入200μL氯仿，用手上下颠倒EP管15s，室温静置10min；
3)4℃、12800rpm，离心15min；
4)吸取上层液体移至新的1.5mL EP管，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后4℃静置10min；
5)4℃、12800rpm离心12min后，弃上清；
6)加入1mL、75％乙醇(用DEPC水新鲜配制)，洗涤沉淀；
7)4℃、11800rpm离心5min，弃去大部分上清；
8)4℃、11800rpm再次离心5min，弃去上清，室温干燥；
9)待RNA沉淀基本透明时，加入RNase-free水(加入体积视RNA沉淀量而定)至完全溶解，Nanodrop 2000分光光度计分析测定所抽提RNA的浓度及质量。
5.AF表达谱芯片检测
总RNA样品通过agilent 2100分析后，采用GeneChip 3’IVT Express Kit制备aRNA(amplified RNA)。即通过一链合成得到cDNA，进一步经过二链合成得到双链DNA模板，然后通过体外反转获得带生物素标记的aRNA(amplified RNA)。将aRNA进行纯化，然后将其片段化后与芯片探针杂交。杂交完成后，对芯片进行洗染，最后扫描得到图片和原始数据。
6.AF表达谱芯片数据分析(对第5步的芯片数据进行芯片分析及IPA分析)
7.根据芯片分析结果，生信分析，结合研究方向及基因发挥作用的pathway进行生物信息分析，并且结合TCGA数据，挑选待研基因
确认基因列表(包含免疫相关、代谢相关、TCGA相关基因一共30个)，后续在芯片样品中进行了qPCR验证。
结果：
AF表达谱芯片差异基因情况如表5所示：
表5
筛选到苦瓜多肽作用的30个靶基因，并采用qPCR检测30个目的基因在芯片样品中的表达，结果与基因芯片结果一致，提示苦瓜多肽作用机制中涉及到调控细胞增殖、细胞凋亡、免疫调节等基因的表达。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种抑制肿瘤细胞增殖的苦瓜多肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤一：将苦瓜切块备用；
步骤二：将苦瓜和液体一起加入到研磨仪中研磨，得到粗研磨料液；
步骤三：将粗研磨料液置于-40～-80℃下冷冻8～24h；
步骤四：解冻粗研磨料液；放入研磨仪中研磨，300～500目筛网过滤，得细研磨料液；
步骤五：将细研磨料液置于冷冻离心机中，4000～5000转离心，取上清液；
步骤六：将步骤五中所得上清液置于高速冷冻离心机中，9000～10000转离心，取上清液；
步骤七：采用超滤机将步骤六中所得上清液进行超滤，膜包孔径为10KD；
超滤后，小于10KD的滤液即为所述苦瓜多肽。
2.根据权利要求1所述的抑制肿瘤细胞增殖的苦瓜多肽的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述苦瓜和液体的质量比为1:1～1:3；所述液体为pH＝7的超纯水。
3.根据权利要求1所述的抑制肿瘤细胞增殖的苦瓜多肽的制备方法，其特征在于，步骤二中，采用RETSCH GM300刀式研磨仪，转速为2000rpm，研磨2min～5min。
4.根据权利要求1所述的抑制肿瘤细胞增殖的苦瓜多肽的制备方法，其特征在于，步骤四中，采用GM300刀式研磨仪，转速为2000rpm，研磨2min～5min。
5.根据权利要1所述的抑制肿瘤细胞增殖的苦瓜多肽的制备方法，其特征在于，步骤五中，离心10～20min。
6.根据权利要1所述的抑制肿瘤细胞增殖的苦瓜多肽的制备方法，其特征在于，步骤六中，离心10～20min。
7.根据权利要1所述的抑制肿瘤细胞增殖的苦瓜多肽的制备方法，其特征在于，步骤七中所得大于10KD滤液返回步骤三，依次重复步骤三到步骤七。
8.根据权利要1所述的抑制肿瘤细胞增殖的苦瓜多肽的制备方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：
步骤八：将小于10KD滤液过0.22nm除菌膜，4℃保存。
9.一种抑制肿瘤细胞增殖的苦瓜多肽，其特征在于，所述苦瓜多肽由如权利要求1-8中任一项所述方法制备得到。
10.一种如权利要求9所述的苦瓜多肽的应用，其特征在于，所述苦瓜多肽作为制备用于抑制肿瘤细胞增殖的特膳食品、保健食品或药品的原料。
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