CN108700591A - 用于鉴定妊娠相关疾病的体外方法 - Google Patents

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Abstract

本发明集中在用于鉴定或筛查具有患妊娠相关疾病(特别是妊娠期糖尿病或先兆子痫)的风险的人类受试者的体外方法，妊娠相关疾病违背从诸如龈沟液(GCF)的微创样品分离的一系列生物标志物的表达或浓度水平。此外，本发明的方法在妊娠的早期阶段提供高灵敏度和特异性(参见下面的实施例和附图)，这意味着它是用于在疾病的早期阶段检测妊娠相关疾病(特别是妊娠期糖尿病或先兆子痫)的强有力且成本效益好的方法，从而获得有效治疗并避免对母亲和婴儿造成显著的长期不良影响。

Description

用于鉴定妊娠相关疾病的体外方法
技术领域
本发明可以包括在个体化医学领域中，其中特异性生物标志物用于鉴定特定的疾病或病症。具体地，在本发明中使用一些生物标志物用于鉴定具有发展母体妊娠期糖尿病或先兆子痫的风险的人类受试者。
背景技术
母体妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)发生在约7％的妊娠中，是一种除了其他危险因素之外，与感染和全身性炎症有关的多因素疾病(Theassociation between Porphyromonas gingivalis-specific maternal serum IgG andlow birth weight.Dasanayake AP,Boyd D,Madianos PN,Offenbacher S,Hills E.JPeriodontol.2001Nov；72(11):1491-7.)。GDM被定义为在妊娠期间发病或首次识别的葡萄糖耐受不良(International Association of Diabetes in Pregnancy Study GroupWorking Group on Outcome D,Feig DS,Corcoy R,Jensen DM,Kautzky-Willer A,NolanCJ,et al.Diabetes in pregnancy outcomes:A systematic review and proposedcodification of definitions.Diabetes Metab Res Rev.2015)。它是一种在妊娠期间出现并通常在分娩后消失的糖尿病形式。如果不进行治疗，GDM会对母亲和婴儿造成显著的长期不良影响。围产期发病包括高胰岛素血症、巨大儿、低血糖、高胆红素血症和呼吸窘迫综合征，这些病症反过来可能产生随后的并发症。后代的长期发病包括肥胖和与遗传因素无关的糖尿病。此外，母亲的GDM与70％发展II型糖尿病的终生风险相关。
本发明面临的问题是提供一种用于在妊娠期间尽早鉴定具有发展妊娠期糖尿病风险的妊娠女性受试者(特别是妇女)的新方法，以避免对母亲和婴儿的长期不良影响。
此外，先兆子痫(PE)是一种多器官疾病，影响着全世界约3％至8％的妊娠妇女。最近的证据表明，有中等或高风险发展PE的患者在妊娠数周之前服用低剂量的阿司匹林与降低PE、宫内生长受限、早产和围产期死亡的风险相关。当前用于诊断PE的“黄金标准”是在妊娠后半期(妊娠大于24周)完成的，此时病理已经建立，并且扭转或限制对围产期结局潜在不良影响的可能性是有限的。PE是导致妊娠期间母体和幼儿死亡的主要原因。
因此需要准确预测PE的早期诊断，精确识别和提前进行患者风险分层以及有效的治疗干预和监测PE。
发明内容
本发明为上述问题提供了明确的解决方案，因为它集中在一种体外方法，该体外方法用于鉴定或筛查有患妊娠相关疾病(特别是妊娠期糖尿病或先兆子痫)的风险的人类受试者，妊娠相关疾病违背从诸如龈沟液(GCF)的微创样品分离的一系列生物标志物的表达或浓度水平。此外，本发明的方法在妊娠的早期阶段提供高灵敏度和特异性(参见下面的实施例和附图)，这意味着它是用于在疾病的早期阶段检测妊娠相关疾病(特别是妊娠期糖尿病或先兆子痫)的强有力且成本效益好的方法，从而获得有效治疗并避免对母亲和婴儿造成显著的长期不良影响。
附图说明
图1.血糖与妊娠期糖尿病状态的接受者操作特征曲线。
图2.血糖和PIGF(龈沟液)与妊娠期糖尿病状态的接受者操作特征曲线。
图3.血糖、PIGF(龈沟液)和BMI与妊娠期糖尿病状态的接受者操作特征曲线。
图4.非糖尿病与妊娠期糖尿病患者中的龈沟液中的PIGF。
图5A.对照组与将发展妊娠期糖尿病的妇女的早期妊娠体重指数对比。(27.5与30.4，p值＝0.0022)B.对照组与将发展妊娠期糖尿病的妇女的早期妊娠血糖水平对比。(p值＝0.0018)。C.对照组与将发展妊娠期糖尿病的妇女的早期妊娠舒张压水平对比。(p值＝0.018)。D.健康妇女与将发展妊娠期糖尿病的妇女在妊娠11-14周时的临床附着水平(p值＝0.918)。E.健康妇女与将发展妊娠期糖尿病的妇女在妊娠11-14周时的平均牙周袋探诊深度(p值＝0.570)。F.健康妇女与将发展妊娠期糖尿病的妇女在妊娠11-14周时的探诊出血的平均值(％)(p值＝0.160)。G.健康妇女与将发展妊娠期糖尿病的妇女在妊娠11-14周时的牙周发炎表面积的平均值(PISA)(p值＝0.294)。
图6.正常妊娠妇女(对照组)与妊娠期糖尿病患者(病例组)的母体GCF PLAP浓度的对比。先兆子痫患者的GCF-PLAP浓度显著高于健康妊娠妇女。
图7.健康者和妊娠期糖尿病牙龈病患者在妊娠11-14周时的龈沟液样品中的外泌体表征。A)健康者的外泌体的CD63+的蛋白质免疫印迹(western Blot)。B)PLAP+的蛋白质免疫印迹(western Blot)。健康者(上)和妊娠期糖尿病患者(下)的电子显微镜照片。
图8.A)从处于早期妊娠的发展妊娠期糖尿病或PE的患者与健康妊娠妇女(对照)的GCF(龈沟液)中分离出的胞外囊泡(EVs)的尺寸分布。B)处于早期妊娠的发展GDM的患者与对照组的GCF中的EVs浓度的量化。纳米颗粒跟踪分析根据制造商的说明，将使用NanoSight NS300系统(NanoSight)来分析获得的外泌体的尺寸分布。在分析之前，将从hgMSC、JEG-3细胞和胎盘外植体分离的外泌体样品在PBS中稀释。该仪器将测量纳米颗粒的布朗运动速率，并计算尺寸分布和浓度。
图9.处于早期妊娠的发展GDM的患者(n＝12)与对照组(n＝17)的GCF中的EVs浓度的量化(P＝0.0007)。
图10.A)健康妇女和将发展先兆子痫的妇女处于妊娠11-14周时测量的牙周袋探诊深度。B)健康妇女和将发展先兆子痫的妇女处于妊娠11-14周时的探诊出血(％)。C)健康妇女和将发展先兆子痫的妇女处于妊娠11-14周时的临床附着水平。
图11.A)先兆子痫与严重牙周炎之间的关联的粗略优势比(O.R＝9.36，p值＝0.009)。B)PE与严重牙周炎之间的关联的调整回归模型(根据年龄、烟草使用情况和体重指数进行调整)。
图12.A)正常妊娠妇女(对照组)与先兆子痫妇女(病例组)之间的龈沟液(GCF)和唾液sFlt-1浓度的对比。先兆子痫患者的母体GCF和唾液sFlt-1浓度的中值(144.3(p25-p75:131.9-201.9)pg/ml和180.5pg/ml(p25-p75:160.5-271.1)pg/ml)显著高于正常妊娠妇女(110.9(p25-p75:106.4-119.5)pg/ml和160.5(p25-p75:138.3-173)pg/ml)。(p值分别为0.033和0.045)。B)正常妊娠妇女和先兆子痫妇女的母体GCF和唾液中的PLAP/EVs CD63+比值。与正常妊娠者相比，先兆子痫患者具有显著更高的母体GCF PLAP/CD63+比值(p＝0.0008)。这些结果在母体唾液中并不显著。C)正常妊娠妇女(对照组)与先兆子痫妇女(病例组)之间的龈沟液(GCF)和唾液中的PlGF浓度的对比。两组之间的母体GCF和PlGF的唾液浓度的中值无显著差异。对照组在GCF中呈现出17.9(p25-p75:11.3-39.4)pg/ml，在唾液中呈现出17.2(p25-p75:10.0-28.3)pg/ml，而先兆子痫患者在GCF中呈现出13.7(p25-p75:7.5-27.0)pg/ml，在唾液样品中呈现出16.9(p25-p75:4.8-29.6)pg/ml。D)正常妊娠者(对照组)与先兆子痫患者(病例组)之间的母体GCF和唾液中的PLAP浓度的对比。与健康妊娠者相比，先兆子痫患者的GCF-PLAP浓度显著更高。与正常妊娠者(1875.9(p25-p75:1844.0-1938.4)pg/ml)相比，先兆子痫患者中的母体GCF-PLAP浓度的中值为1929.4(p25-p75:1915.4-2081.9)pg/ml。在两组的唾液中，未观察到显著差异。
具体实施方式
术语定义
为了本发明的目的，下面包括以下定义：
●术语“筛查”理解为检查或测试一组属于具有患妊娠期糖尿病风险的普通人群的个体，目的是将健康个体与患有未诊断的妊娠期糖尿病或具有高风险的患所述适应症的个体区分开来。
●如本文所用，“妊娠期糖尿病(GDM)”定义为在妊娠期间发病或首次识别的葡萄糖耐受不良。
●表达“龈沟液(GCF)”是一种炎性渗出物，可以在龈缘处或龈缝内收集。
●本发明中描述的任意生物标志物或其组合的术语“上调”或“过表达”是指相对于给定的“阈值”或“截断值”，其表达水平增加至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少>60％，至少>65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少100％，至少110％，至少120％，至少130％，至少140％，至少150％，或者更多。
●当提及本发明中描述的生物标志物的表达水平时，术语“阈值”或“截断值”是指参考表达水平，如果患者的表达水平高于所述阈值或截断值或参考水平，则该参考表达水平以给定的灵敏度和特异性指示受试者可能患妊娠期糖尿病。
●术语“包括”意味着包含，但不限于词语“包括”之后的任何内容。因此，术语“包括”的使用表示所列元素是必需的或强制性的，但其它元素是可选的，并且可以存在或可以不存在。
●“由...组成”是指包含且限于短语“由...组成”之后的任何内容。因此，短语“由...组成”表示所列元素是必需的或强制性的，并且不存在其它元素。
●还应注意的是，如本文所使用的术语“试剂盒”不限于任何特定装置并且包括适合于实施本发明的任何装置，例如但不限于微阵列、生物阵列、生物芯片或生物芯片阵列。
●如本文所用，“胎盘生长因子(PlGF)”是参与调节血管生成的生长因子的血管内皮生长因子(VEGF)家族的成员。PlGF与VEGF-A密切相关并结合至VEGF受体1(VEGFR-1，也称为可溶性fms样酪氨酸激酶1，sFlt-1)。
●如本文所用，通过在妊娠24-28周时进行口服葡萄糖耐受试验(OGTT)来证实GDM诊断。
●如本文所用，如果妇女有4颗或更多牙齿显示具有4mm或更深的牙周袋探诊深度(PPD)的一个或多个部位，并且如果它们在相同部位具有3mm或更高的临床附着丧失(CAL)，且有炎症和探诊出血(BOP)，则该妇女被诊断为患有牙周炎。在超过20％的部位显示BOP和牙龈红肿，但没有临床附着丧失的妇女则被诊断为患有牙龈炎。
●如本文所用，“血糖”是指血液或血清中葡萄糖的存在或水平。
●如本文所用，术语“妊娠相关疾病”是指妊娠特有的疾病，例如早产、先兆子痫、妊娠期糖尿病等。
●如本文所用，术语“外泌体”是指纳米囊泡的亚型，是分泌的杯形膜囊泡(30-100nm)的亚型，该分泌的杯形膜囊泡来源于晚期内涵体小室并由几乎所有细胞类型和肿瘤细胞分泌。
●如本文所用，术语“微囊泡”是指大于100-200nm的膜囊泡。
●如本文所用，术语“sFlt-1(抗血管生成因子sFlt-1)”是指称为fms样酪氨酸激酶-1的蛋白质或一种可溶性内皮受体。
●如本文所用，术语“PLAP(胎盘碱性磷酸酶)”是指特异性来源于胎盘的蛋白质，其用于胎盘来源的标记的微囊泡和外泌体。
描述
本发明涉及一种用于筛查或鉴定具有患妊娠相关疾病(特别是妊娠期糖尿病或先兆子痫)的风险或患有妊娠相关疾病(特别是妊娠期糖尿病或先兆子痫)受试者的体外方法，其基于测量在患有这种疾病的患者中上调或过表达的一些生物标志物的表达谱或表达水平来进行。本发明还涉及一种用于在受试者(优选人类受试者)中获得供诊断的有用数据或用于诊断妊娠相关疾病(特别是妊娠期糖尿病或先兆子痫)的体外方法。本发明也包括治疗方法。
具体而言，本发明基于一个发现，即外泌体和微囊泡被证实在患或患有妊娠相关疾病(特别是患或患有妊娠期糖尿病或先兆子痫)的患者的龈沟液(GCF)样品中显著上调。这清楚地展示在图8至图9中，其中结果清楚地显示，与在妊娠早期从健康的个体妊娠妇女(在妊娠晚期没有患或患有先兆子痫或妊娠期糖尿病)获得的对照GCF样品相比，在妊娠晚期患或患有先兆子痫或妊娠期糖尿病的患者的GCF中的外泌体和微囊泡的浓度水平较高(请注意，GCF样品是在妊娠早期获得的)。此外，结果显示，在患或患有先兆子痫或妊娠期糖尿病的患者妊娠结束时不仅GCF中外泌体或微囊泡的浓度(小于或约150nm)显著增加，这些个体的GCF中也呈现出高于200nm(并且优选<500nm)的显著更高的微囊泡浓度。
因此，本发明的第一个实施例涉及一种用于筛查具有发展妊娠相关疾病的风险(特别是具有发展妊娠期糖尿病或先兆子痫的风险)的受试者的体外方法，该体外方法包括：(a)测量从待筛查的受试者(优选人类受试者)的龈沟液(GCF)样品获得的至少外泌体和微囊泡的浓度水平；以及(b)将待筛查的人类受试者的至少外泌体和微囊泡的所述浓度水平与已经建立的表达谱或与未患妊娠相关疾病的个体的浓度水平进行比较，其中外泌体和微囊泡的浓度水平增加指示具有发展妊娠相关疾病的风险，特别是具有发展妊娠期糖尿病或先兆子痫的风险。优选地，可以通过测量存在于GCF样品中的外泌体和微囊泡的总量的浓度水平或通过测量存在于GCF样品中的生物标志物来进行该确定，GCF样品选自：小于或等于150nm的外泌体或微囊泡，小于或等于200nm的外泌体或微囊泡，大于200nm且优选小于500nm的微囊泡。
本发明的第二个实施例涉及根据本发明的第一个实施例的用于筛查受试者的体外方法，其进一步包括测量至少PlGF或至少PLAP(胎盘碱性磷酸酶)，或至少PlGF和血糖，或至少PlGF和PLAP(胎盘碱性磷酸酶)，或至少PIGF和sFlt-1(抗血管生成因子sFlt-1)，或至少PlGF、PLAP和sFlt-1，或至少PlGF、PLAP和血糖，或至少PlGF、sFlt-1和血糖，或至少PlGF、PLAP、sFlt-1和血糖的表达谱或表达水平，其中PlGF、PLAP和sFlt-1来自从受试者取得的GCF样品。
本发明的第三个实施例涉及一种用于诊断(优选用于早期诊断)疑似患有或患妊娠相关疾病(特别是怀疑患有或患妊娠期糖尿病或先兆子痫)的受试者的体外方法，该方法包括本发明的第一个或第二个实施例中的任一个的步骤a)和步骤b)，并且可选地(c)利用生物物理学参数和临床信息来证实存在妊娠相关疾病，即通过口服葡萄糖耐受试验(OGTT)来证实存在妊娠期糖尿病，通过蛋白尿、尿酸和/或转氨酶的量化来证实存在先兆子痫。
本发明的第四个实施例涉及一种用于获得供体外诊断疑似患有或患妊娠相关疾病(特别是疑似患有或患妊娠期糖尿病或先兆子痫)的受试者的有用数据的方法，该方法包括本发明的第一个或第二个实施例中的步骤a)和步骤b)。
本发明的第五个实施例涉及一种用于将人类受试者分类为健康受试者或者患妊娠相关疾病(特别是疑似患有或患妊娠期糖尿病或先兆子痫)的受试者的体外方法，该方法包括本发明的第一个或第二个实施例中的步骤a)和步骤b)。
本发明的第六个实施例涉及用于在患有妊娠期糖尿病的受试者中监测对治疗的应答或监测妊娠相关疾病(特别是妊娠期糖尿病或先兆子痫)的进展的体外方法，该方法包括本发明的第一个或第二个实施例中的步骤a)和步骤b)。
本发明的第七个实施例涉及一种用于治疗被诊断为患有妊娠相关疾病(特别是妊娠期糖尿病或先兆子痫)的人类受试者的方法，其包括本发明第一个或第二个实施例中的步骤a)和b)，以及(c)治疗被诊断为患有妊娠相关疾病(特别是妊娠期糖尿病或先兆子痫)的患者。
本发明的第八个实施例涉及根据本发明的第七个实施例的方法，其中患者被诊断为患有糖尿病，并且通过适当的糖尿病饮食或食物计划和/或通过口服降血糖药物(例如二甲双胍metformine)进行治疗。
本发明的第九个实施例涉及根据本发明的第七个实施例的方法，其中患者被诊断为患有先兆子痫，并且通过加速胎肺成熟的类固醇、诸如乙酰水杨酸(阿司匹林)的抗凝剂和/或缺氧诱导因子1α的抑制剂(例如二甲双胍)进行治疗。
本发明的第十个实施例涉及包括生物标志物检测试剂的试剂盒或装置的体外用途，所述生物标志物检测试剂能够确定从受试者(优选人类受试者)获得的龈沟液(GCF)样品中的至少外泌体和微囊泡的浓度水平，该试剂盒或装置用于筛查具有发展妊娠相关疾病的风险(特别是具有发展妊娠期糖尿病或先兆子痫的风险)的受试者，或用于诊断(特别是用于早期诊断)患有妊娠相关疾病(特别是患有糖尿病或先兆子痫)的受试者。
本发明还涉及一种基于测量血管生成肽(PlGF)的表达谱或表达水平来筛查或鉴定具有患或发展妊娠相关疾病的风险(特别是具有患或发展妊娠期糖尿病或先兆子痫的风险)的受试者的体外方法，其中血管生成肽(PlGF)在患妊娠期糖尿病的患者中上调或过表达，并在患先兆子痫的患者中下调。在这个意义上，明显地如图1、2、3和4以及表3、5和6所示，GCF中PIGF本身的高水平或与血清血糖的组合的高水平与妊娠期糖尿病的存在显著相关，其中与本文测试的其他生物标志物例如PLAP(胎盘碱性磷酸酶)或sFlt-1(抗血管生成因子sFlt-1)相比，PIGF提供了最佳结果。对于先兆子痫也是如此，其中如图13所示，GCF中PIGF本身的较低或下调水平与先兆子痫的存在显著相关。
因此，本发明的第十一个实施例涉及一种用于筛查具有患或发展妊娠相关疾病的风险(特别是具有患或发展妊娠期糖尿病或先兆子痫的风险)的受试者的体外方法，该方法包括：(a)测量从待筛查的受试者(优选人类受试者)的龈沟液(GCF)样品获得的至少胎盘血管生成肽(PIGF)的表达谱或表达水平；以及(b)将待筛查的人类受试者的至少PlGF的表达谱或表达水平与已经建立的表达谱或表达水平进行比较，其中至少PlGF的差异表达指示妊娠相关疾病，特别地，如果发生过表达则指示糖尿病或如果发生下调则指示先兆子痫。
本发明的第十二个实施例涉及根据本发明的第十一个实施例的用于筛查受试者的体外方法，该方法包括：测量至少PlGF和血糖，或至少PlGF和PLAP(胎盘碱性磷酸酶)，或至少PIGF和sFlt-1(抗血管生成因子sFlt-1)，或至少PlGF、PLAP和sFlt-1，或至少PlGF、PLAP和血糖，或至少PlGF、sFlt-1和血糖，或至少PlGF、PLAP、sFlt-1和血糖的表达谱或表达水平，其中PlGF、PLAP和sFlt-1从取自受试者的GCF样品获得。以及(b)将待筛查的受试者的至少PlGF和血糖，或至少PlGF和PLAP，或至少PIGF和sFlt-1，或至少PlGF、PLAP和sFlt-1，或至少PlGF、PLAP和血糖，或至少PlGF、sFlt-1和血糖，或至少PlGF、PLAP、sFlt-1和血糖的表达谱或表达水平与已经建立的表达谱或表达水平进行比较，其中，至少PlGF和血糖，或至少PlGF和PLAP，或至少PIGF和sFlt-1，或至少PlGF、PLAP和sFlt-1，或至少PlGF、PLAP和血糖，或至少PlGF、sFlt-1和血糖，或至少PlGF、PLAP、sFlt-1和血糖的差异表达水平指示妊娠相关疾病，特别地，如果发生任何上述生物标志物或其组合的过表达则指示糖尿病，或者如果发生PIGF的下调和其余的上述生物标志物的上调或过表达则指示先兆子痫。
本发明的第十三个实施例涉及一种用于诊断(特别是早期诊断)疑似患有或患妊娠相关疾病(特别是患妊娠期糖尿病或先兆子痫)的受试者的体外方法，该方法包括本发明的第十一个或第十二个实施例中的任一个的步骤a)和步骤b)，并且可选地(c)利用生物物理学参数和临床信息来证实存在妊娠相关疾病，即通过口服葡萄糖耐受试验(OGTT)来证实存在妊娠期糖尿病，通过蛋白尿、尿酸或转氨酶的量化来证实存在先兆子痫。
本发明的第十四个实施例涉及一种用于获得供体外诊断疑似患有或患妊娠相关疾病(特别是患妊娠期糖尿病或先兆子痫)的受试者的有用数据的方法，该方法包括本发明的第十一个或第十二个实施例中的步骤a)和步骤b)。
本发明的第十五个实施例涉及一种用于将人类受试者分类为健康受试者或疑似患有或患妊娠相关疾病(特别是患妊娠期糖尿病或先兆子痫)的受试者的体外方法，其包括本发明的第十一个或第十二个实施例中的步骤a)和步骤b)。
本发明的第十六个实施例涉及一种用于在受试者中监测对治疗的应答或监测妊娠相关疾病(特别是妊娠期糖尿病或先兆子痫)的进展的体外方法，该方法包括本发明的第十一个或第十二个实施例中的步骤a)和步骤b)。
本发明的第十七个实施例涉及一种用于治疗患妊娠相关疾病(特别是患妊娠期糖尿病或先兆子痫)的人类受试者的方法，该方法包括本发明第十一个或第十二个实施例中的步骤a)和b)，以及(c)治疗被诊断为患有所述妊娠相关疾病(特别是妊娠期糖尿病或先兆子痫)的患者。
本发明的第十八个实施例涉及根据本发明的第十七个实施例的方法，其中患者被诊断为患有妊娠期糖尿病，并且通过适当的糖尿病饮食或食物计划和/或通过口服降血糖药物(例如二甲双胍metformine)进行治疗。
本发明的第十九个实施例涉及根据本发明的第十七个实施例的方法，其中患者被诊断为患有先兆子痫，并且通过加速胎肺成熟的类固醇、例如乙酰水杨酸(阿司匹林)的抗凝剂和/或缺氧诱导因子1的抑制剂(例如二甲双胍)进行治疗。
本发明的第二十个实施例涉及包括生物标志物检测试剂的试剂盒的用途，所述生物标志物检测试剂能够确定GCF样品中的至少PIGF的差异表达水平，该试剂盒用于筛查具有发展妊娠相关疾病的风险(特别是具有发展妊娠期糖尿病或先兆子痫的风险)的受试者，或用于诊断患妊娠相关疾病(特别是患糖尿病或先兆子痫)的受试者。
本发明的第二十一个实施例涉及根据本发明第二十个实施例的试剂盒的用途，该试剂盒包括试剂，该试剂用于确定至少PlGF和血糖，或至少PlGF和PLAP(胎盘碱性磷酸酶)，或至少PIGF和sFlt-1(抗血管生成因子sFlt-1)，或至少PlGF、PLAP和sFlt-1，或至少PlGF、PLAP和血糖，或至少PlGF、sFlt-1和血糖，或至少PlGF、PLAP、sFlt-1和血糖的差异表达水平，其中至少PlGF和血糖，或至少PlGF和PLAP(胎盘碱性磷酸酶)，或至少PIGF和sFlt-1(抗血管生成因子sFlt-1)，或至少PlGF、PLAP和sFlt-1，或至少PlGF、PLAP和血糖，或至少PlGF、sFlt-1和血糖，或至少PlGF、PLAP、sFlt-1和血糖的差异表达指示妊娠相关疾病，特别是糖尿病或先兆子痫。
此外，本发明还涉及一种基于测量PLAP(胎盘碱性磷酸酶)的表达谱或表达水平，来筛查或鉴定具有患或发展妊娠相关疾病的风险(特别是有患或发展妊娠期糖尿病或先兆子痫的风险)的受试者的体外方法，其中PLAP(胎盘碱性磷酸酶)在患妊娠期糖尿病或先兆子痫的患者的GCF中上调或过表达。在这个意义上，明显地如图6所示，GCF中PLAP本身的高水平或与其他生物标志物的组合的高水平与妊娠期糖尿病的存在显著相关。对于先兆子痫也是如此，其中如图13所示，GCF中PLAP本身的高水平与先兆子痫的存在显著相关。
因此，本发明的第二十二个实施例涉及一种用于筛查具有患或发展妊娠相关疾病的风险(特别是有患或发展妊娠期糖尿病或先兆子痫的风险)的受试者的体外方法，该方法包括：(a)测量从待筛查的受试者(优选人类受试者)的龈沟液(GCF)样品获得的至少PLAP的表达谱或表达水平；以及(b)将待筛查的人类受试者的至少PLAP的表达谱或表达水平与已经建立的表达谱或表达水平进行比较，其中至少PLAP的过表达指示妊娠相关疾病，特别是糖尿病或先兆子痫。
本发明的第二十三个实施例涉及根据本发明的第十一个实施例的用于筛查受试者的体外方法，该方法包括：测量至少PlGF和PLAP(胎盘碱性磷酸酶)，或至少PLAP和sFlt-1(抗血管生成因子sFlt-1)，或至少PlGF、PLAP和sFlt-1，或至少PlGF、PLAP和血糖，或至少PLAP、sFlt-1和血糖，或至少PlGF、PLAP、sFlt-1和血糖的表达谱或表达水平，其中PlGF、PLAP和sFlt-1从取自受试者的GCF样品获得；以及(b)将待筛查的受试者的所述表达谱或表达水平与已经建立的表达谱或表达水平进行比较，其中任意上述组合的差异表达指示妊娠相关疾病，特别是糖尿病或先兆子痫。
本发明的第二十四个实施例涉及一种用于诊断(特别是早期诊断)疑似患有或患妊娠相关疾病(特别是患妊娠期糖尿病或先兆子痫)的受试者的体外方法，该方法包括本发明的第二十二个或第二十三个实施例中的任一个的步骤a)和步骤b)，以及可选地(c)利用生物物理学参数和临床信息来证实存在妊娠相关疾病，即通过口服葡萄糖耐受试验(OGTT)来证实存在妊娠期糖尿病，通过蛋白尿、尿酸或转氨酶的量化来证实存在先兆子痫。
本发明的第二十五个实施例涉及一种用于获得供体外诊断疑似患有或患妊娠相关疾病(特别是患妊娠期糖尿病或先兆子痫)的受试者的有用数据的方法，该方法包括本发明的第二十二个或第二十三个实施例中的步骤a)和步骤b)。
本发明的第二十六个实施例涉及一种用于将人类受试者分类为健康受试者或疑似患有或患妊娠相关疾病(特别是患妊娠期糖尿病或先兆子痫)的受试者的体外方法，该方法包括本发明的第二十二个或第二十三个实施例中的步骤a)和步骤b)。
本发明的第二十七个实施例涉及一种用于在受试者中监测对治疗的应答或监测妊娠相关疾病(特别是妊娠期糖尿病或先兆子痫)的进展的体外方法，该方法包括本发明的第二十二个或第二十三个实施例中的步骤a)和步骤b)。
本发明的第二十八个实施例涉及一种用于治疗患妊娠相关疾病(特别是患妊娠期糖尿病或先兆子痫)的人类受试者的方法，方法包括本发明第二十二个或第二十三个实施例中的步骤a)和b)，以及(c)治疗被诊断为患有所述妊娠相关疾病(特别是妊娠期糖尿病或先兆子痫)的患者。
本发明的第二十九个实施例涉及根据本发明的第二十八个实施例的方法，其中患者被诊断为患有妊娠期糖尿病，并且通过适当的糖尿病饮食或食物计划和/或通过口服降血糖药物(例如二甲双胍metformine)进行治疗。
本发明的第三十个实施例涉及根据本发明的第二十八个实施例的方法，其中患者被诊断为患有先兆子痫，并且通过加速胎肺成熟的类固醇、例如乙酰水杨酸(阿司匹林)的抗凝剂和/或缺氧诱导因子1的抑制剂(例如二甲双胍)进行治疗。
本发明的第三十一个实施例涉及包括生物标志物检测试剂的试剂盒的用途，所述生物标志物检测试剂能够测定GCF样品中的至少PLAP的差异表达水平，该试剂盒用于筛查具有发展妊娠相关疾病的风险(特别是具有发展妊娠期糖尿病或先兆子痫的风险)的受试者，或用于诊断患妊娠相关疾病(特别是患糖尿病或先兆子痫)的受试者。
本发明的第三十二个实施例涉及根据本发明第二十个实施例的试剂盒的用途，该试剂盒包括试剂，该试剂用于确定至少PlGF和PLAP(胎盘碱性磷酸酶)，或至少PLAP和sFlt-1(抗血管生成因子sFlt-1)，或至少PlGF、PLAP和sFlt-1，或至少PlGF、PLAP和血糖，或至少PLAP、sFlt-1和血糖，或至少PlGF、PLAP、sFlt-1和血糖的差异表达水平，其中至少PLAP和sFlt-1(抗血管生成因子sFlt-1)，或至少PlGF、PLAP和sFlt-1，或至少PlGF、PLAP和血糖，或至少PLAP、sFlt-1和血糖，或至少PlGF、PLAP、sFlt-1和血糖的过表达指示妊娠相关疾病，特别是糖尿病或先兆子痫。
最后，值得注意的是，本发明还涉及一种基于测量至少sFlt-1(抗血管生成因子sFlt)的表达谱或表达水平来筛查或鉴定具有患或发展先兆子痫的风险的受试者的体外方法，其中sFlt-1在患先兆子痫的患者的GCF中上调或过表达。在这个意义上，明显地如图2所示，GCF中PLAP本身的高水平或与其他生物标志物的组合的高水平与先兆子痫的存在显著相关。在这个意义上，本发明的第三十三个实施例涉及一种用于筛查具有患或发展先兆子痫的风险的受试者的体外方法，该方法包括：(a)测量从待筛查的受试者(优选人类受试者)的龈沟液(GCF)样品获得的至少sFlt-1的表达谱或表达水平；以及(b)将待筛查的人类受试者的至少sFlt-1的表达谱或表达水平与已经建立的表达谱或表达水平进行比较，其中至少sFlt-1的过表达指示妊娠相关疾病，特别是糖尿病或先兆子痫。
本发明的第三十四个实施例涉及根据本发明的第三十三个实施例的用于筛查受试者的体外方法，该方法进一步包括测量至少PLAP和sFlt-1，或至少PIGF和sFlt-1，或至少PlGF、PLAP和sFlt-1，或至少PlGF、sFlt-1和血糖，或至少PlGF、PLAP、sFlt-1和血糖的表达谱或表达水平，其中PlGF、PLAP和sFlt-1来自从受试者取得的GCF样品。
本发明的第三十五个实施例涉及一种用于诊断(特别是早期诊断)疑似患有或患先兆子痫的受试者的体外方法，该方法包括本发明的第三十三个或第三十四个实施例中的任一个的步骤a)和步骤b)，以及可选地(c)通过生物物理参数和临床信息来证实存在先兆子痫，即通过蛋白尿、尿酸或转氨酶的量化来证实存在先兆子痫。
本发明的第三十六个实施例涉及一种用于获得供体外诊断疑似患有或患先兆子痫的受试者的有用数据的方法，该方法包括本发明的第三十三个或第三十四个实施例中的步骤a)和步骤b)。
本发明的第三十七个实施例涉及一种用于将人类受试者分类为健康受试者或疑似患有或患先兆子痫的受试者的体外方法，该方法包括本发明的第三十三个或第三十四个实施例中的步骤a)和步骤b)。
本发明的第三十八个实施例涉及一种用于在受试者中监测对治疗的应答或监测先兆子痫的进展的体外方法，该方法包括本发明的第三十三个或第三十四个实施例中的步骤a)和步骤b)。
本发明的第三十九个实施例涉及一种治疗患先兆子痫的人类受试者的方法，该方法包括本发明的第三十三个或第三十四个实施例中的步骤a)和b)，以及(c)优选通过加速胎肺成熟的类固醇、例如乙酰水杨酸(阿司匹林)的抗凝剂和/或缺氧诱导因子1的抑制剂(例如二甲双胍)来治疗被诊断为患有所述先兆子痫的患者。
本发明的第四十个实施例涉及包括生物标志物检测试剂的试剂盒的用途，所述生物标志物检测试剂能够确定GCF样品中的至少sFlt-1的差异表达水平，该试剂盒用于筛查具有发展先兆子痫的风险的受试者，或用于诊断患先兆子痫的受试者。
用于建立表达的阈值或截断水平的各种统计和数学方法在现有技术中是已知的。如本发明的实施例和附图所述，例如，可以基于来自接受者操作特征(ROC)曲线的数据来选择特定生物标志物的阈值或截断表达水平。本领域技术人员将会理解，所述阈值或截断表达水平可以改变，例如，通过沿特定生物标志物或其组合的ROC曲线移动，从而获得不同的灵敏度或特异性值，从而影响整体测定性能。例如，如果从临床的角度来看，目标是要有一个强大的诊断方法，我们应该尝试有高灵敏度。但是，如果目标是要有一个成本效益好的方法，我们应该尝试获得高度的特异性。最佳截断值是指从特定生物标志物的ROC曲线获得的值，该值产生最佳的灵敏度和特异性。灵敏度和特异性值是在阈值(截断值)范围内计算的。因此，所述阈值或截断值可以选择为使得灵敏度和/或特异性在至少60％、或至少65％、70％、75％或80％的测定的患者群体中为至少约70％，并且可以是例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％。
因此，本发明的上述每个实施例优选通过以下过程来实施：确定此前在(从所述待诊断或待筛查的受试者分离的)GCF样品以及可选地血清样品(用于测定血糖)中引用的至少任意一个生物标志物的表达或浓度水平，并将所述生物标志物的表达或浓度水平与预定阈值或截断值或建立的表达或浓度谱或水平进行比较，其中所述预定阈值或截断值对应于与ROC曲线中期望灵敏度下的最高特异性相关的所述生物标志物的浓度或表达水平，所述最高特异性是基于在有患有妊娠相关疾病的患者群体中测定的生物标志物的表达或浓度水平而计算的，其中相对于所述预定截断值，至少一个所述生物标志物的差异表达(过表达或降低表达，其取决于生物标志物)以期望灵敏度指示该受试者患或患有妊娠相关疾病。此外，本发明的每个上述引用的实施例还可以优选地按照如下实施：将从待诊断或待筛查的受试者分离的所述生物标志物的表达或浓度水平与建立的、从健康群体获得的所述生物标志物的表达或浓度谱或水平进行比较，其中相对于建立的表达或浓度谱或水平，至少一个所述生物标志物的差异表达(过表达或降低表达，其取决于生物标志物)指示该受试者患有或患妊娠相关疾病。
本文说明性地描述的发明可以适当地在不存在任何一种或多种本申请未具体公开的要素或限定的情况下实施。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应当作非限制性的广义理解。另外，本文所用的术语和表达是用作描述性而非限制性的术语，且使用所述术语和表达无意排除所述和所示的特征或其部分的任何等同物，但是，应当认识到可以在要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应该理解，虽然已经通过优选实施例和可选特征具体公布了本发明，但是本领域技术人员仍然可以采取在此公开的本发明的具体实施例的修改和变化，并且这些修改和变化被认为是在本发明的范围内。
本文对本发明进行了广泛的一般性描述。落入一般性公开范围内的每个更窄的种类和亚属分组也构成本发明的一部分。这包括本发明的带有附带条件或从该属中去除任何主题的消极限制的一般描述，无论被切除的材料是否在本文中具体列举。
其他实施例在以下权利要求和非限制性实施例内。此外，在以组的形式描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明还由此根据任何个体成员或组中的亚组成员来描述。
实施例
实施例1：妊娠期糖尿病
材料与方法
进行病例对照研究。受试者的选择标准为她们是被诊断为患有GDM的妊娠妇女。在2015年1月至10月期间，从在智利圣地亚哥的Sótero del Río医院的母胎单元住院的80名妇女的产前组群总共招募了14个病例。对照组是同一组群，以产生66个对照妊娠妇女的样品。两组均由具有相同社会经济水平的、单胎妊娠的受试者组成。在妊娠11-14周时收集临床登记和人体测量数据，然后由一名牙周病医师进行牙科评估和全口牙周检查。研究中所有临床相关数据都存储在计算机数据库中。如果妇女的牙齿少于18颗，且在前3个月内曾使用全身或局部抗菌/抗炎治疗，则将其排除在外。从同意参加研究的妇女获得了书面知情同意书，该研究得到了安第斯大学伦理委员会的批准。
所研究的变量是GDM、年龄、体重指数(BMI)、牙齿数量、GCF-PLAP、PlGF、sFlt-1以及牙周临床测量和诊断。
样品收集和评估
在相同的胎龄时对两组进行牙周检查和口腔液样品的收集。用棉卷隔离牙齿后，用刮匙(Hu Friedy，Gracey，IL，USA)将龈上菌斑去除而不接触边缘龈。然后用空气注射器轻轻干燥龈沟。用纸带收集GCF(Pro-Flow，Amityville，NY，USA)。将纸带放入沟/袋中直至感觉到轻微的阻力并保持30秒。将被唾液或血液污染的纸带从研究中排除。GCF收集后，将纸带置于含有100μl的具有0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBS)(PBS-T)的Eppendorf小瓶中。通过以10,000g离心5分钟(Hermle Labortech Nik.Z-233MK-2)提取GCF。将该洗脱过程重复两次，并从4个牙周袋(1个象限)的受影响最严重的牙周部位获得GCF样品。另外，将4-6ml唾液收集至10ml FalconTM管中。收集后将两个样品均置于液氮中，并储存直至进一步分析。
ELISA试验
根据制造商的说明(PLAP，人PLAP Elisa试剂盒，目录号MBS70199584,检测范围2000pg/ml；人PlGF Quantikine Elisa试剂盒，R&D系统，目录号DPG00，检测范围15.6-1,000pg/ml；以及VEFR/Flt-1Quantikine Elisa试剂盒，R&D系统，目录号DVR100B，检测范围31.2-2000pg/ml)，使用市售ELISAs将GCF和唾液样品中的PLAP、PlGF和sFlt-1浓度进行量化。在自动ELISA酶标仪(酶标仪，ELx808，伯腾仪器(BiotekInstruments)，威努斯基，佛蒙特州，美国)中，在450nm波长下读取Elisa板。通过从标准曲线内插来确定母体口腔液样品中的sFlt-1、PlGF和PLAP的浓度。进行该试验的实验室人员不知道临床信息。
统计分析
使用Shapiro-Wilcox检验来检验数据的正态性。因为PlGF、sFLT-1和PLAP在母体GCF和唾液中的浓度不是正态分布的，所以该分析使用非参数检验。使用卡方检验(Chi-square test)或费希尔精确检验(Fisher’s exact test)进行比例之间的比较，并且使用曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test)比较连续变量。使用根据BMI、牙周诊断和烟草使用情况而调整的多元逻辑回归模型来评估关联强度。确定粗略和调整优势比(O.R)，并使用STATA软件(第11版；StataCorp，Lakeway Drive College Station，德克萨斯州，美国)进行统计分析。
结果
表1列出了病例组和对照组的人口统计学和临床特征。所有样品均由同一位牙医在妊娠11-14周之间取得。两组牙齿的中值数相同(27)。表2列出了两组中所有的牙周临床措施。
相比于在健康妊娠妇女中观察到的PLAP水平的平均值为4.7pg/ml，在发展GDM的妇女的GCF中观察到的PLAP水平的平均值为12.2pg/mL。PlGF水平在健康者中为1pg/ml，在病例组中为5.3pg/ml。
有趣的是，如表4所示，从龈沟液获得的PlGF值(pg/ml)具有统计显著性，对于血糖也是如此。此外，如图2所示，血糖的ROC曲线的面积为0.8214，其中当血糖与从GCF液获得的PIGF值结合时，该面积显著增加。
实施例2：先兆子痫
材料与方法
研究设计
进行了一项病例对照研究，包括在智利圣地亚哥Sótero del Río医院的母胎单元住院的患有PE(n＝10)的患者。随机选择正常妊娠的妇女以产生对照组(n＝20)，并与年龄和社会经济状况有关。排除患有任何相关医学疾病的妇女(例如既往高血压、肾脏疾病、贫血或糖尿病)。如果妇女的牙齿少于18颗，并在前3个月内曾使用过全身或局部抗菌/抗炎治疗，或曾接受过牙周治疗，则也将其排除在外。由一名牙周病医师进行牙科评估和全口牙周检查。用于临床和研究目的的唾液和GCF的研究和收集已经得到了洛斯安第斯大学和Sótero del Río医院的伦理委员会的批准。在收集样品之前，所有患者在登记时都提供了书面知情同意书。
定义
如果先前血压正常的妇女在妊娠20周后发生至少两次(间隔4小时)收缩压>140mmHg和/或舒张压>90mm的情况，则诊断为先兆子痫，并且应该有蛋白尿(24小时内>300mg或如果不能在24小时内收集到，则在中段尿或导管尿样品的试纸分析上的两次读数>2+)。在不存在蛋白尿的情况下，任何接下来的全身表现的新发病包括：(a)血小板减少(血小板计数<100000μL)；(b)肾功能不全(肌酸酐>1.1mg/dL或在不存在潜在肾脏疾病的情况下，肌酸酐增加两倍)；(c)肝功能异常(即肝转氨酶水平为正常的两倍)；以及(d)肺水肿；或脑或视觉症状。根据美国妇产科学院(ACOG实践公报，先兆子痫和子痫的诊断和管理)30和国家高血压教育计划(全国高血压教育计划妊娠高血压工作组报告)31，对照组被定义为无慢性疾病或产科并发症且单胎妊娠的血压正常的妇女。
如果妇女有4颗以上牙齿显示具有4mm或更深的牙周袋探诊深度的一个或多个部位，并且如果它们在相同部位具有3mm或更高的临床附着丧失，且有炎症和探诊出血(BOP)，则该妇女被诊断为患有牙周炎。在超过20％的部位显示BOP和牙龈红肿，但没有临床附着丧失的妇女则被诊断为患有牙龈炎。
样品收集和评估
在相同的胎龄时对两组进行牙周检查和口腔液样品的收集。用棉卷隔离牙齿后，用刮匙(Hu Friedy，Gracey，IL，USA)将龈上菌斑去除而不接触边缘龈。然后用空气注射器轻轻干燥龈沟。用纸带收集GCF(Pro-Flow，Amityville，NY，USA)。将纸带放入沟/袋中直至感觉到轻微的阻力并保持30秒。将被唾液或血液污染的纸带从研究中排除。GCF收集后，将纸带置于含有100μL的具有0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBS)(PBS-T)的Eppendorf小瓶中。通过以10,000g离心5分钟(Hermle Labortech Nik.Z-233MK-2)提取GCF。将该洗脱过程重复两次，并从4个牙周袋(1个象限)的受影响最严重的牙周部位获得GCF样品。另外，将4-6ml唾液收集至10ml FalconTM管中。收集后将两个样品均置于液氮中，并储存直至进一步分析。
唾液和GCF的超速离心
将唾液和GCF样品在4℃下以1500g离心10分钟。然后将上清液除去并置于另一个管中，并在4℃下以17,000g离心15分钟。在初始离心步骤之后，将上清液转移至无菌管中在4℃下以160,000g超速离心1小时。超速离心之后，除去水层，用PBS洗涤含有EVs的球团并在4℃下以160,000g再次超速离心1小时。除去上清液，并将沉淀物准备好用于CD63+的ELISA试验。
ELISA试验
根据制造商的说明(CD63exoElisa System目录号EXOEL-CD63A-1，PLAP，人PLAP Elisa试剂盒，目录号MBS70199584,检测范围2000pg/mL；人PlGF Quantikine Elisa试剂盒，R&D系统，目录号DPG00,检测范围15.6-1000pg/mL；以及VEFR/Flt-1Quantikine Elisa试剂盒，R&D系统，目录号DVR100B，范围检测31.2-2000pg/mL)，使用市售的ELISAs对GCF和唾液样品中的CD63+EVs的量、PLAP、PlGF和sFlt-1的浓度进行量化。CD63+ExoElisa用于量化EVs，结果以EVs的数量表示。在自动ELISA酶标仪(酶标仪，ELx808，伯腾仪器(Biotek Instruments)，威努斯基，佛蒙特州，美国)中，在450nm波长下读取ELISA板。通过从标准曲线内插来确定母体口腔液样品中的sFlt-1、PlGF、PLAP和CD63+EVs的浓度。进行该试验的实验室人员不知道临床信息。
实时PCR
根据制造商的说明(Qiagen，瓦伦西亚，加利福尼亚州，美国)，使用miRNeasy Mini试剂盒分离来自GCF的总RNA。然后通过光谱法(Nanodrop 1000，Thermo Scientific，威尔明顿，特拉华州，美国)对总RNA进行量化，并使用260nm和280nm处的吸光度比值来评估其质量。用DNase I进行处理80纳克的总RNA并通过使用ImProm-II逆转录系统(普洛麦格公司，麦迪逊，美国)进行逆转录。实时定量PCR试验在Stratagene Mx3000P系统(安捷伦科技公司，圣克拉拉，美国)中进行。以下基因特异性引物用于hPL：正向5'GCGATGACTATCACCTCCTAAAG3'和反向5'CATGGTTGTGCGAGTTTGTG3'。基因36B4(酸性核糖体磷蛋白)用作管家基因。在2％琼脂糖凝胶中用它们各自的阴性对照将PCR产物显现。
统计分析
使用Shapiro-Wilcox检验来检验数据的正态性。因为在母体GCF和唾液中PlGF、sFLT-1、PLAP的浓度以及CD63+Evs的量不是正态分布的，所以该分析使用非参数检验。使用卡方检验(chi-square test)或费希尔精确检验(Fisher’s exact test)进行比例之间的比较，并且使用曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test)比较连续变量。使用根据体重指数(BMI)、牙周诊断和烟草使用情况而调整的多元逻辑回归模型来评估关联强度。确定粗略和调整优势比(OR)，并使用STATA软件(第11版；StataCorp，Lakeway Drive CollegeStation，德克萨斯州，美国)进行统计分析。
结果
表7列出了病例组和对照组的人口统计学和临床特征。鉴定了各组之间的母体的中值年龄和BMI没有显著差异。一旦诊断为PE(妊娠期中值为33±1周)，所有样品均在不超过24小时的时间范围内取得。此外，用于样品过程的对照组的胎龄相同(妊娠期中值为31±3周)。PE组中存在的牙齿的中值数为26，对照组中存在的牙齿的中值数为27.5。两组的平均探诊深度相似。在PE中观察到的显示出BOP的部位的百分比为55.1％，在对照组中观察到的显示出BOP的部位的百分比为37.3％，但这种差异没有统计显著性。各组之间有斑块的部位水平也相似(数据未显示)。另外，在50％(5/10)的PE患者中发现了慢性牙周炎，其余患者被诊断为患有牙龈炎。在对照组中，40％的患者被诊断为患有慢性牙周炎，60％被诊断为患有牙龈炎。
以前的母体吸烟史在PE组30％和对照组35％为阳性。观察到PE与GCF中的PLAP(p值＝0.0499)和sFlt-1(p值＝0.033)的水平之间存在关联，但没有观察到PE与根据以前的烟草使用情况、BMI和牙周诊断而调整的PlGF和CD63+EVs(p值分别为0.358和0.595)之间存在关联。在唾液样品中，观察到了sFlt-1水平与PE诊断(p值＝0.045)之间的关联。
多元逻辑回归分析表明，根据烟草使用情况、BMI和牙周诊断而调整的妊娠患者中的GCF中的PLAP和sFlt-1水平的增加(O.R分别为1.01和1.10)与PE关联(表8)。图12A-12D分别显示了唾液和GCF中的sFlt-1、PlGF、CD63+EV和PLAP浓度。此外，患有PE的妇女患者的GCF中的PLAP/CD63+EVs比值明显高于正常妊娠妇女(p值＝0.0008)(图5)。为了证明GCF中存在特定胎盘来源的组分，测量了hPL的mRNA。在GCF中检测到了hPL的转录物。有趣的是，在对照组(n＝4)的GCF中检测到了hPL的mRNA，但在PE患者(n＝5)的GCF中没有检测到hPL的mRNA。
综上所述，本发明是首次报道在妊娠期间母体口腔液(GCF和唾液)中的PLAP、PIGF和sFlt-1浓度的鉴定和变化的研究，该研究表明，与正常妊娠相比，这些分子在PE中显著升高或降低。
表8.由粗略的以及根据烟草使用、体重指数和牙周诊断(牙龈炎/牙周炎)调整的逻辑回归模型分析的生物标志物与先兆子痫之间的关联

Claims (12)

1.用于筛查具有发展妊娠相关疾病的风险的受试者的体外方法，其中所述妊娠相关疾病选自妊娠期糖尿病或先兆子痫，所述体外方法包括：(a)测量从待筛查的受试者，优选从人类受试者获得的龈沟液(GCF)样品中的至少胎盘血管生成肽(PlGF)、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)或抗血管生成因子sFlt-1(sFlt-1)的表达谱或表达水平，或诸如外泌体或微囊泡的胞外囊泡(EVs)的浓度水平；以及(b)将待筛查的人类受试者的所述至少胎盘血管生成肽(PlGF)、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)或抗血管生成因子sFlt-1(sFlt-1)的表达谱或表达水平或诸如外泌体或微囊泡的胞外囊泡(EVs)的浓度水平与已经建立的表达谱或表达水平进行比较；其中，至少胎盘血管生成肽(PlGF)、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)或抗血管生成因子sFlt-1(sFlt-1)的差异表达或诸如外泌体或微囊泡的胞外囊泡(EVs)的浓度水平指示选自妊娠期糖尿病或先兆子痫的妊娠相关疾病。
2.根据权利要求1所述的用于筛查具有发展妊娠相关疾病风险的受试者的体外方法，其特征在于，所述妊娠相关疾病是妊娠期糖尿病，并且所述方法包括：(a)测量从待筛查的受试者，优选从人类受试者的龈沟液(GCF)样品获得的至少胎盘血管生成肽(PIGF)的表达谱或表达水平；以及(b)将待筛查的人类受试者的所述至少PlGF的表达谱或表达水平与已经建立的表达谱或表达水平进行比较，其中至少PlGF的过表达指示妊娠期糖尿病。
3.根据权利要求2所述的用于筛查受试者的体外方法，其特征在于，所述方法包括：(a)测量至少PlGF和血糖的表达谱或表达水平，或至少PlGF和PLAP(胎盘碱性磷酸酶)的表达谱或表达水平，或至少PIGF和sFlt-1(抗血管生成因子sFlt-1)的表达谱或表达水平，或至少PlGF、PLAP和sFlt-1的表达谱或表达水平，或至少PlGF、PLAP和血糖的表达谱或表达水平，或至少PlGF、sFlt-1和血糖的表达谱或表达水平，或至少PlGF、PLAP、sFlt-1和血糖的表达谱或表达水平，其中PlGF、PLAP和sFlt-1从取自受试者的GCF样品获得；以及(b)将待筛查的受试者的所述至少PlGF和血糖的表达谱或表达水平，或至少PlGF和PLAP的表达谱或表达水平，或至少PIGF和sFlt-1的表达谱或表达水平，或至少PlGF、PLAP和sFlt-1的表达谱或表达水平，或至少PlGF、PLAP和血糖的表达谱或表达水平，或至少PlGF、sFlt-1和血糖的表达谱或表达水平，或至少PlGF、PLAP、sFlt-1和血糖的表达谱或表达水平与已经建立的表达谱或表达水平进行比较，其中，至少PlGF和血糖，或至少PlGF和PLAP，或至少PIGF和sFlt-1，或至少PlGF、PLAP和sFlt-1，或至少PlGF、PLAP和血糖，或至少PlGF、sFlt-1和血糖，或至少PlGF、PLAP、sFlt-1和血糖的过表达指示妊娠期糖尿病。
4.根据权利要求2或3所述的用于筛查受试者的体外方法，其特征在于，所述体外方法进一步包括：(a)测量从待筛查的受试者，优选从人类受试者获得的龈沟液(GCF)样品中的诸如外泌体或微囊泡的胞外囊泡(EVs)的浓度水平；以及b)将所述浓度水平与已经建立的浓度谱或水平进行比较，其中与已经建立的浓度谱或水平相比，从待筛查的受试者获得的样品中的胞外囊泡(EVs)的浓度水平的浓度增加指示妊娠期糖尿病。
5.用于诊断疑似患有妊娠期糖尿病的受试者的体外方法，其特征在于，所述方法包括权利要求2或3中任一项的步骤a)和b)，以及可选地(c)通过口服葡萄糖耐受试验(OGTT)来证实存在妊娠期糖尿病。
6.用于获得供体外诊断妊娠期糖尿病的有用数据的方法，其特征在于，所述方法包括权利要求2或3中任一项的步骤a)和b)。
7.用于将人类受试者分类为健康受试者或者患妊娠期糖尿病的受试者的体外方法，其特征在于，所述方法包括权利要求2或3中任一项的步骤a)和b)。
8.用于监测对治疗的应答或用于监测妊娠期糖尿病患者中的妊娠期糖尿病的进展的体外方法，其特征在于，所述包括权利要求2或3中任一项的步骤a)和b)。
9.用于治疗患妊娠期糖尿病的人类受试者的方法，其特征在于，所述包括权利要求2或3中任一项的步骤a)和b)，以及(c)治疗被诊断为患有妊娠期糖尿病的患者。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，通过合适的糖尿病饮食或食物计划和/或通过口服降血糖药物如二甲双胍来治疗所述患者。
11.试剂盒的用途，其特征在于，所述试剂盒包括用于测定至少PIGF的差异表达水平的生物标志物检测试剂，其中至少PIGF的过表达指示妊娠期糖尿病，用于体外诊断患妊娠期糖尿病的风险。
12.根据权利要求11所述的试剂盒的用途，其特征在于，所述试剂盒包括试剂，该试剂用于测定至少PlGF和血糖的差异表达水平，或至少PlGF和PLAP(胎盘碱性磷酸酶)的差异表达水平，或至少PIGF和sFlt-1(抗血管生成因子sFlt-1)的差异表达水平，或至少PlGF、PLAP和sFlt-1的差异表达水平，或至少PlGF、PLAP和血糖的差异表达水平，或至少PlGF、sFlt-1和血糖的差异表达水平，或至少PlGF、PLAP、sFlt-1和血糖的差异表达水平，其中至少PlGF和血糖的过表达，或至少PlGF和PLAP(胎盘碱性磷酸酶)的过表达，或至少PIGF和sFlt-1(抗血管生成因子sFlt-1)的过表达，或至少PlGF、PLAP和sFlt-1的过表达，或至少PlGF、PLAP和血糖的过表达，或至少PlGF、sFlt-1和血糖的过表达，或至少PlGF、PLAP、sFlt-1和血糖的过表达指示妊娠期糖尿病。
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