CN108699534B - 具有登革热病毒减毒株库的活病毒和包含其作为抗原的登革热疫苗 - Google Patents

具有登革热病毒减毒株库的活病毒和包含其作为抗原的登革热疫苗 Download PDF

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Abstract

使用单一剂量诱导对所有四种类型的登革热病毒血清型的中和抗体反应，发现了不产生超过给定量的病毒血症的高度安全的登革热疫苗。提供了在药效(中和抗体反应)和安全性(病毒血症)两个方面具有优异结果的四价登革热病毒制剂。

Description

具有登革热病毒减毒株库的活病毒和包含其作为抗原的登革 热疫苗
技术领域
本发明涉及包含减毒登革热病毒的登革热疫苗。
背景技术
登革热病毒感染，作为一种特殊的传染病，具有仅次于世界三大传染性疾病(AIDS、疟疾和结核病)的高发病率，和在全球传播。
登革热病毒是属于黄病毒科的单链RNA病毒，具有抗原性截然不同的四种血清型。认识到，一旦某种血清型的登革热病毒的感染发生，由于获得性免疫，相同血清型的登革热病毒的再感染在几乎终生时间内将绝不会发生。然而，针对不同血清型的交叉保护仅持续最长约12个周，因此登革热病毒感染可发生两次或更多次。特别地，已知"登革出血热"和"登革热休克综合征"(其为有时导致死亡的严重临床病况)可能在第二次或更后的感染时发生。
对于登革热感染，没有确定的疗法，并且它的预防有限。在现有的条件下，针对感染的对抗措施是驱蚊和改善环境，以及在个人水平上指导使用驱虫剂和合适的衣服。然而，鉴于成本和效果，这些措施是不足够的。因此，通过疫苗预防感染或预防发生是需要的，所述疫苗可在广泛的年龄范围内接种和显示优异功效。
[现有技术]
[专利参考文献]
专利参考文献1: EP 1159968
专利参考文献2: 日本专利5197362
专利参考文献3: 日本专利5075120
专利参考文献4: WO 2007/141259
专利参考文献5: WO 2000/057910
[非专利参考文献]
非专利参考文献1: Safety and immunogenicity of tetravalent live-attenuated dengue vaccines in Thai adult volunteers: role of serotypeconcentration, ratio, and multiple doses, Am. J. Trop MedImmune Hyg., 2002;66(3):264-72.
非专利参考文献2: Dengue vaccines: recent developments, ongoingchallenges and current candidates, Expert Rev Vaccines., 2013; 12(8):933-53.
非专利参考文献3: Efficacy of a tetravalent chimeric dengue vaccine(DENVax) in Cynomolgus macaque., Am J Trop Med Hyg., 2011; 84(6):978-87.
非专利参考文献4: Recombinant, live-attenuated tetravalent denguevirus vaccine formulations induce a balanced, broad, and protectiveneutralizing antibody response against each of the four serotypes in rhesusmonkeys., J Virol, 2005; 79(9):5516-28.
非专利参考文献5: Evaluation of Interferences between Dengue VaccineSerotypes in a Monkey Model, Am J Trop Med Hyg., 2009; 80(2):302-11.
非专利参考文献6: Protection of Rhesus monkeys against dengue viruschallenge after tetravalent live attenuated dengue virus vaccination., JInfect Dis., 2006; 193(12):1658-65。
发明内容
(发明要解决的技术问题)
如上所述，存在不同于第一次感染的血清型的第二次或随后感染使症状更严重的高风险。因此，需要对所有四种血清型的登革热病毒同时提供保护的四价疫苗。然而，尽管几十年来尝试开发疫苗，仍没有对所有四种血清型的登革热病毒显示优异功效的疫苗。
登革热病毒基因组编码结构蛋白，例如C蛋白、M蛋白和E蛋白，以及不构成病毒颗粒和在复制期间起作用的7种非结构(NS)蛋白。因此，具有另一种病毒或特定血清型的登革热病毒的骨架的遗传重组的嵌合活疫苗或灭活的完整颗粒疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗等缺少来自登革热病毒的组分，和仅提供在活体内通过登革热病毒的天然感染产生的各种免疫抗原的一部分。
另一方面，通过在不同于天然宿主细胞的细胞中传代和适应而获得宿主细胞突变的减毒活疫苗，可诱导类似于天然感染的免疫反应，如在麻疹、风疹、腮腺炎、脊髓灰质炎等中证明的，因此也可预期在登革热病毒感染中的高功效。
开发中或市售可得的登革热疫苗通过多次给药，能够诱导针对所有四种血清型的登革热病毒的中和抗体。然而，在获得针对所有四种血清型的中和抗体之前需要大量时间，在此期间在地方流行病区域中存在天然感染的风险。因此，以单次给药可对所有四种血清型提供保护性免疫的疫苗是更有用的。
为了制备登革热病毒疫苗，不容易选择毒株的混合组成和各个血清型的剂量。存在的问题是，即使用单价给药可诱导高的中和抗体，用四价给药，针对各个血清型的登革热病毒的中和抗体的水平也不均匀(干扰作用)。此外，由于具有不充分的中和活性的抗体(交叉反应，结合)，存在抗体依赖性增强(ADE)的问题。
在临床试验下的三种批准的药物或主要开发物是Sanofi的ChimeriVax-DEN(Dengvaxia (商标))、Takeda的DENVax (商标)和Butantan的TetraVax (商标)，其全部都是遗传重组的嵌合活疫苗。Sanofi的Dengvaxia是具有黄热病毒株YF-17D的骨架的遗传重组的嵌合活疫苗，和在三个国家墨西哥、巴西和菲律宾批准以6个月间隔的三次接种用于9-45岁的受试者。
Dengvaxia的3期试验对在东南亚的五个国家中年龄范围为2-15岁的约10,000名受试者和在南美洲的五个国家中年龄范围为9-16岁的约20,000名受试者进行。结果是，发现功效低至大约60%。特别是，对于血清型2，功效为大约40%并且是不足够的。没有对登革热病毒进行先前免疫的受试者的功效是大约40%。此外，在泰国在3期试验的长期随访中和在2b期试验的长期随访中，在不超过9岁的年龄范围中第三年的住院风险是未接种组的1.6倍，特别是，在5岁或更小的年龄范围中是约5倍。这被认为是有问题的，因为是疫苗增强。这样的低功效的原因被认为是缺少登革热来源的组分、流行株的变异等。因此，对于传代和适应的活疫苗，其包含所有登革热来源的组分，不进行活性克隆和包含病毒的准种，预期更高的功效。
(解决问题的手段)
本发明人进行认真研究以解决上述问题。结果，本发明人发现了在功效和安全性方面优异的减毒四价活登革热病毒疫苗。此外，本发明人发现了以单次给药和以多次给药在功效和安全性方面均优异的减毒四价活登革热病毒疫苗。
通过野生型登革热病毒(血清型1-4)在原代犬肾(PDK)细胞或原代绿猴肾(PGMK)细胞中传代获得的减毒株是已知的。本发明进一步提供了通过在非洲绿猴肾(Vero)细胞中传代获得的减毒登革热病毒和包含活病毒库作为抗原的减毒登革热病毒疫苗。
因此，本发明包括以下方面。
[1] 减毒血清型1登革热病毒，其中所述病毒与具有使用下一代测序仪(NextGeneration Sequencer)分析的SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的血清型1登革热病毒亲株03135具有95%或更大的同源性，在所述亲株的第483、568或1663位的任一个氨基酸残基处具有完全突变，和进一步具有以下(1)-(4)的一个或多个突变：
(1) K482E或K482E/K
(2) K484R或K484R/K
(3) I/T2353T
(4) A2364T或A2364T/A。
[2] [1]的减毒血清型1登革热病毒，其中所述病毒与具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的亲株03135具有97%或更大的同源性。
[3] [1]的减毒血清型1登革热病毒，其中所述病毒与具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的亲株03135具有99%或更大的同源性。
[4] [1]-[3]中任一项的减毒血清型1登革热病毒，其中所述病毒在第483、568和1663位的氨基酸残基处具有完全突变。
[5] [4]的减毒血清型1登革热病毒，其中第483位的突变是E483K。
[6] [4]的减毒血清型1登革热病毒，其中第568位的突变是K568R。
[7] [4]的减毒血清型1登革热病毒，其中第1663位的突变是N1663K。
[8] [4]的减毒血清型1登革热病毒，其中第483位的突变是E483K，第568位的突变是K568R和第1663位的突变是N1663K。
[9] [1]-[8]中任一项的减毒血清型1登革热病毒，其中所述病毒具有上述(1)-(4)的所有突变。
[10] 减毒血清型2登革热病毒，其中所述病毒与具有使用下一代测序仪分析的SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的血清型2登革热病毒亲株99345具有95%或更大的同源性，在所述亲株的第143、400、1102、1308或1654位的任一个氨基酸残基处具有完全突变，和进一步具有以下(5)或(6)的突变：
(5) P2347L或P2347P/L
(6) T2828M或T2828T/M。
[11] [10]的减毒血清型2登革热病毒，其中所述病毒与具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的亲株99345具有97%或更大的同源性。
[12] [10]的减毒血清型2登革热病毒，其中所述病毒与具有SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的亲株99345具有99%或更大的同源性。
[13] [10]-[12]中任一项的减毒血清型2登革热病毒，其中所述病毒在第143、400、1102、1308和1654位的氨基酸残基处具有完全突变。
[14] [13]的减毒血清型2登革热病毒，其中第143位的突变是D143N。
[15] [13]的减毒血清型2登革热病毒，其中第400位的突变是T400K。
[16] [13]的减毒血清型2登革热病毒，其中第1102位的突变是D1102N。
[17] [13]的减毒血清型2登革热病毒，其中第1308位的突变是L1308F。
[18] [13]的减毒血清型2登革热病毒，其中第1654位的突变是E1654K。
[19] [13]的减毒血清型2登革热病毒，其中第143位的突变是D143N，第400位的突变是T400K，第1102位的突变是D1102N，第1308位的突变是L1308F，和第1654位的突变是E1654K。
[20] [10]-[19]中任一项的减毒血清型2登革热病毒，其中所述病毒具有上述(5)和(6)的突变。
[21] 减毒血清型3登革热病毒，其中所述病毒与具有使用下一代测序仪分析的SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的血清型3登革热病毒亲株16562具有95%或更大的同源性，在所述亲株的第209、582、1211或1563位的任一个氨基酸残基处具有完全突变，和进一步具有以下(7)-(10)的一个或多个突变：
(7) K/R671K
(8) A687V
(9) T764I/T
(10) A1237T。
[22] [21]的减毒血清型3登革热病毒，其中所述病毒与具有SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的亲株16562具有97%或更大的同源性。
[23] [21]的减毒血清型3登革热病毒，其中所述病毒与具有SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的亲株16562具有99%或更大的同源性。
[24] [21]-[23]中任一项的减毒血清型3登革热病毒，其中所述病毒在第209、582、1211、1563和1654位的氨基酸残基处具有完全突变。
[25] [24]的减毒血清型3登革热病毒，其中第209位的突变是I209L。
[26] [24]的减毒血清型3登革热病毒，其中第582位的突变是S582G。
[27] [24]的减毒血清型3登革热病毒，其中第1211位的突变是F1211L。
[28] [24]的减毒血清型3登革热病毒，其中第1563位的突变是Q1563K。
[29] [24]的减毒血清型3登革热病毒，其中第209位的突变是I209L，第582位的突变是S582G，第1211位的突变是F1211L，和第1563位的突变是Q1563K。
[30] [21]-[29]中任一项的减毒血清型3登革热病毒，其中所述病毒具有上述(7)-(10)的所有突变。
[31] 减毒血清型4登革热病毒，其中所述病毒与具有使用下一代测序仪分析的SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的血清型4登革热病毒亲株1036具有95%或更大的同源性，在所述亲株的第2187或2354位的氨基酸残基处具有完全突变，和进一步在第624、742、1628、2286、2482或2508位处没有突变。
[32] [31]的减毒血清型4登革热病毒，其中所述病毒与具有SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的亲株1036具有97%或更大的同源性。
[33] [31]的减毒血清型4登革热病毒，其中所述病毒与具有SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的亲株1036具有99%或更大的同源性。
[34] [31]-[33]中任一项的减毒血清型4登革热病毒，其中所述病毒在第2187和2354位的氨基酸残基处具有完全突变。
[35] [34]的减毒血清型4登革热病毒，其中第2187位的突变是L2187F。
[36] [34]的减毒血清型4登革热病毒，其中第2354位的突变是F/L2354S。
[37] [34]的减毒血清型4登革热病毒，其中第2187位的突变是L2187F和第2354位的突变是F/L2354S。
[38] [31]-[37]中任一项的减毒血清型4登革热病毒，其中所述病毒在第624、742、1628、2286、2482和2508位处没有突变。
[39] 减毒登革热病毒疫苗，包含选自[1]-[9]中任一项的减毒血清型1登革热病毒、[10]-[20]中任一项的减毒血清型2登革热病毒、[21]-[30]中任一项的减毒血清型3登革热病毒和[31]-[38]中任一项的减毒血清型4登革热病毒的一种或多种减毒登革热病毒作为抗原。
[40] 减毒四价登革热病毒疫苗，包含[1]-[9]中任一项的减毒血清型1登革热病毒、[10]-[20]中任一项的减毒血清型2登革热病毒、[21]-[30]中任一项的减毒血清型3登革热病毒和[31]-[38]中任一项的减毒血清型4登革热病毒作为抗原。
[41] [39]或[40]的减毒登革热病毒疫苗，其中减毒血清型1、2、3和4登革热病毒的混合比率是1:1:1:1、5:3:5:3或5:3:3:3。
[42] [39]-[41]中任一项的减毒登革热病毒疫苗，其中减毒血清型1、2、3和4登革热病毒的各自的抗原量是1-7 log10 FFU/剂。
[43] 用于制备[1]-[9]中任一项的减毒血清型1登革热病毒的方法，其包括使具有使用下一代测序仪分析的SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的血清型1登革热病毒亲株03135在原代犬肾(PDK)细胞中进行15-25次传代培养以获得减毒株，和进一步使所述减毒株在非洲绿猴肾(Vero)细胞中进行传代培养。
[44] 用于制备[1]-[9]中任一项的减毒血清型1登革热病毒的方法，其包括使具有使用下一代测序仪分析的SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的血清型1登革热病毒亲株03135在PDK细胞中进行15次传代培养以获得减毒株，和进一步使所述减毒株在Vero细胞中进行传代培养。
[45] 用于制备[10]-[20]中任一项的减毒血清型2登革热病毒的方法，其包括使具有使用下一代测序仪分析的SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的血清型2登革热病毒亲株99345在PDK细胞中进行20-25次传代培养以获得减毒株，和进一步使所述减毒株在Vero细胞中进行传代培养。
[46] 用于制备[10]-[20]中任一项的减毒血清型2登革热病毒的方法，其包括使具有使用下一代测序仪分析的SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的血清型2登革热病毒亲株99345在PDK细胞中进行25次传代培养以获得减毒株，和进一步使所述减毒株在Vero细胞中进行传代培养。
[47] 用于制备[21]-[30]中任一项的减毒血清型3登革热病毒的方法，其包括使具有使用下一代测序仪分析的SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的血清型3登革热病毒亲株16562在原代绿猴肾(PGMK)细胞中进行20-30次传代培养和在PDK细胞中进行2-5次传代培养以获得减毒株，和进一步使所述减毒株在Vero细胞中进行传代培养。
[48] 用于制备[21]-[30]中任一项的减毒血清型3登革热病毒的方法，其包括使具有使用下一代测序仪分析的SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的血清型3登革热病毒亲株16562在PGMK细胞中进行30次传代培养和在PDK细胞中进行4次传代培养以获得减毒株，和进一步使所述减毒株在Vero细胞中进行传代培养。
[49] 用于制备[31]-[38]中任一项的减毒血清型4登革热病毒的方法，其包括使具有使用下一代测序仪分析的SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的血清型4登革热病毒亲株1036在PDK细胞中进行35-45次传代培养以获得减毒株，和进一步使所述减毒株在Vero细胞中进行传代培养。
[50] 用于制备[31]-[38]中任一项的减毒血清型4登革热病毒的方法，其包括使具有使用下一代测序仪分析的SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的血清型4登革热病毒亲株1036在PDK细胞中进行40次传代培养以获得减毒株，和进一步使所述减毒株在Vero细胞中进行传代培养。
发明效果
本发明提供了能够甚至以单次给药对所有四种血清型的登革热病毒诱导中和抗体反应，且具有等同于市售可得的其它减毒活病毒疫苗的安全性(耐受性)水平的登革热疫苗。
附图说明
图1显示中和抗体效价(血清型1)的长期转变。
图2显示中和抗体效价(血清型2)的长期转变。
图3显示中和抗体效价(血清型3)的长期转变。
图4显示中和抗体效价(血清型4)的长期转变。
图5显示中和抗体效价(血清型1)的长期转变和不依赖于接种次数。
图6显示中和抗体效价(血清型2)的长期转变和不依赖于接种次数。
图7显示中和抗体效价(血清型3)的长期转变和不依赖于接种次数。
图8显示中和抗体效价(血清型4)的长期转变和不依赖于接种次数。
图9显示中和抗体反应(血清型1)不依赖于抗原量。
图10显示中和抗体反应(血清型2)不依赖于抗原量。
图11显示中和抗体反应(血清型3)不依赖于抗原量。
图12显示中和抗体反应(血清型4)不依赖于抗原量。
图13显示制备四价登革热疫苗的流程图。
具体实施方式
根据本发明，提供能够甚至以单次给药对所有四种血清型的登革热病毒诱导中和抗体反应，且具有等同于市售可得的其它减毒活病毒疫苗的安全性(耐受性)水平的登革热疫苗。
在下文中详细解释了本发明的优选实施方案。应注意，本发明不限于以下实施方案。
本发明涉及通过使临床分离的野生型登革热病毒(亲株)在PDK细胞中或在PGMK细胞和PDK细胞中进行传代培养以获得减毒株和进一步通过使所述减毒株在Vero细胞中进行传代培养制备的减毒登革热病毒。本发明的减毒登革热病毒包括用于登革热疫苗的种株(VMS (病毒母种)、VWS (病毒工作种)等)和等同于产品的传代株(用于测试GLP的批料(bulk)(Pre-CTM：临床前试验材料)等)以及使用毒株制备的登革热疫苗。根据本发明，通过比较和研究亲株、减毒株、种株和等同于产品的传代株的氨基酸序列，特定了亲株和减毒株可区分的位置，以及减毒株和种株、等同于产品的传代株可区分的位置。
本发明的减毒血清型1登革热病毒通过使临床分离的亲株03135 (SEQ ID NO: 1)在原代犬肾(PDK)细胞进行15-25次传代培养以获得减毒株1，和进一步通过使所述减毒株1在Vero细胞中进行传代培养获得。与亲株03135相比，由于传代培养产生的减毒株1具有第483位的谷氨酸、第568位的赖氨酸和第1663位的天冬酰胺的任一个或全部至另一种氨基酸的完全突变，优选E483K、K568R、N1663K的突变。本发明的减毒血清型1登革热病毒除了上述突变之外，通过在Vero细胞中传代培养还具有在第482、484、2353、2364位的一个或多个突变，和可在遗传上区别于减毒株1。
本发明的减毒血清型2登革热病毒通过使临床分离的亲株99345 (SEQ ID NO: 2)在PDK细胞中进行20-35次传代培养以获得减毒株2，和进一步通过使所述减毒株2在Vero细胞中进行传代培养获得。与亲株99345相比，由于传代培养产生的减毒株2具有第143位的天冬氨酸、第400位的苏氨酸、第1102位的天冬氨酸、第1308位的亮氨酸和第1654位的谷氨酸的任一个或全部至另一种氨基酸的完全突变，优选D143N、T400K、D1102N、L1308F、E1654K的突变。本发明的减毒血清型2登革热病毒进一步通过在Vero细胞中传代培养具有第2347或2828位的突变，和可在遗传上区别于减毒株2。
本发明的减毒血清型3登革热病毒通过使临床分离的亲株16562 (SEQ ID NO: 3)在PGMK细胞中进行20-30次传代培养和进一步在PDK细胞中进行2-5次传代培养以获得减毒株3，和进一步通过使所述减毒株3在Vero细胞中进行传代培养获得。与亲株16562相比，减毒株3具有第209位的异亮氨酸、第582位的丝氨酸、第1211位的苯丙氨酸和第1563位的谷氨酰胺的任一个或全部至另一种氨基酸的完全突变，优选I209L、S582G、F1211L、Q1563K的突变。本发明的减毒血清型3登革热病毒进一步通过在Vero细胞中传代培养具有第671、687、764、1237位的一个或多个突变，和可在遗传上区别于减毒株3。
本发明的减毒血清型4登革热病毒通过使临床分离的亲株1036 (SEQ ID NO: 4)在PDK细胞中进行35-45次传代培养以获得减毒株4，和进一步通过使所述减毒株4在Vero细胞中进行传代培养获得。与亲株1036相比，减毒株4具有第2187位的亮氨酸和第2354位的苯丙氨酸/亮氨酸(混合氨基酸)的任一个或二者至另一种氨基酸的完全突变，优选L2187F、F/L2354S的突变。本发明的减毒血清型4登革热病毒进一步在第624、742、1628、2286、2482或2508位处没有突变，和可在遗传上区别于减毒株4。
本发明包括疫苗，其包含上述的各个血清型的登革热病毒作为抗原。本发明的疫苗可以是包含血清型1-4的任一个的单价疫苗，或包含血清型1-4的任一个的组合的疫苗，或四价疫苗。在四价疫苗的情况下，血清型1、2、3和4的混合比率可以是任何比率，但优选地是1:1:1:1、5:3:5:3或5:3:3:3。本发明的登革热病毒疫苗还可用作初种疫苗(primingvaccine)，与作为加强疫苗的另一种疫苗组合。本发明的登革热病毒疫苗还可与另一种黄病毒病毒疫苗或与另一种传染性疾病的疫苗混合使用。
疫苗的剂型可适当选择，可以是液体制剂、粉末制剂或冻干制剂。
亲株16562和1036公开于专利参考文献1，和分别作为I-2482和I-2483保藏在法国的CNCM (Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes)。对于亲株03135，其部分序列在GenBank中作为ADJ18295.1登记。对于亲株99345，其部分序列在GenBank中作为ADJ18294.1登记。本发明的减毒登革热病毒(血清型1-4)已在ATCC (美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection); 10801 University Boulevard,Manassas, VA 20110 USA)分别以保藏号PTA-123506、PTA-123505、PTA-123507和PTA-123508保藏。
根据本发明，登革热病毒的核苷酸序列使用下一代测序仪分析。下一代测序仪亦称为第二代测序仪，和例如，在Illumina的SBS测序仪的情况下，允许同时平行测定数百万或更多个DNA片段的核苷酸序列。其原理基本上类似于使用毛细管电泳的常规Sanger方法。检测在每一个核苷酸用作为模板的DNA片段再合成时的荧光强度以确定核苷酸序列。下一代测序仪不同于Sanger方法之处在于后者同时处理1-96个DNA片段，而前者通过形成对应于Sanger方法中的毛细管的"簇"，同时平行处理巨大量的数百万或更多个DNA片段。这显著改进序列分析速度，和允许靶向大的基因组区的研究、需要高读出数的低频率突变的研究和准种的研究。
使用下一代测序仪的核苷酸序列分析允许研究病毒的准种。其主要特征在于在混合核苷酸的情况下，可获得核苷酸的混合比率，和还可确定准种。为表示方便，核苷酸序列在本文被转化为氨基酸序列。例如，为表示减毒株的第484位的氨基酸残基，显示赖氨酸是30%和精氨酸是70%。
如本文使用的，当亲株和减毒株等彼此比较时，指出发生突变的位点，例如K482E、K482E/K等。"K482E"表示第482位的赖氨酸被突变为谷氨酸。"K482E/K"表示第482位的赖氨酸至谷氨酸和赖氨酸的两种突变存在。
登革热病毒基因组编码结构蛋白例如C蛋白、M蛋白和E蛋白，以及7种非结构(NS)蛋白，其不构成病毒颗粒，而是在复制期间起作用。单一多蛋白从登革热病毒基因组翻译，然后被加工成各个结构蛋白和非结构蛋白。对于氨基酸序列的位置的计数，多蛋白的起始密码子在本文用作起点。
对于用下一代测序仪的测量，首先从登革热病毒提取RNA，接着用随机引物反转录，形成双链，连接接头序列和扩增，以用SBS测序仪获得短核苷酸序列的聚合数据。从亲株的数据，与登革热病毒同源的最长毗连群(contig)使用汇编程序Velvet产生。将与所述毗连群具有高度同源性的基因库上的序列进行比对，和补充5'末端序列和/或3'末端序列用作参考序列用于再测序分析。对于再测序分析，使用映射器BWA将序列数据映射至参考序列，并且测定病毒基因组序列，包括混合的核苷酸。从获得的病毒基因组序列，获得氨基酸序列，包括混合的氨基酸。混合的氨基酸仅包括以10%或更高的混合比率存在的那些。
作为下一代测序仪，MiSeq和HiSeq (均由Illumina制造)是已知的，但也可使用其它型号。
登革热病毒的减毒特性可通过(但不限于)以下方法确定：噬斑大小测定法、生长温度敏感性测试、动物测试等。对于噬斑大小测定法，使用例如来自恒河猴(rhesusmacaque)的LLC-MK2细胞，测量噬斑直径，和当测量的直径小于亲株时确定减毒特性。对于生长温度敏感性测试，使用例如Vero细胞，改变培养温度，和与亲株比较，在较高温度下当生长潜力降低时确定减毒特性。
使用NHP (非人灵长类动物)和一些遗传重组的免疫缺陷小鼠进行登革热病毒的功效和安全性测试。代表性的NHP是食蟹猴(cynomolgus monkey)。
为测量中和抗体效价，使用具有噬斑指标的PRNT (噬斑减少中和测试)和病毒来源的蛋白用抗体标记的Immunospot PRNT或FRNT (病灶减少中和效价)。
通过但不限于，直接使用噬斑大小测定法或间接检测病毒基因组片段的RT-qPCR(实时定量聚合酶链反应)，进行血液中病毒水平的测量。
本发明用以下实施例更详细地解释，但不限于此。
[实施例1]
(1) 减毒株的制备
在泰国的玛希隆大学(Mahidol University)中，用于新疫苗的候选物的减毒登革热病毒(血清型1、血清型2、血清型3和血清型4)根据以下程序制备。减毒血清型1登革热病毒通过使临床分离的毒株03135作为亲株在原代犬肾(PDK)细胞中进行15次传代培养制备。减毒血清型2登革热病毒通过使临床分离的毒株99345作为亲株在PDK细胞中进行25次传代培养制备。减毒血清型3登革热病毒通过使临床分离的毒株16562作为亲株在原代绿猴肾(PGMK)细胞中进行30次传代培养和进一步在PDK细胞中进行4次传代培养制备。减毒血清型4登革热病毒通过使临床分离的毒株1036作为亲株在PDK细胞中进行40次传代培养制备。减毒血清型1登革热病毒进一步在Vero细胞中进行3次传代培养。这些减毒登革热病毒分别被称为减毒株1-4。
(2) PreVMS的制备
为了制备VMS (病毒母种)，首先制备preVMS种。preVMS种通过使减毒株1-4分别在Vero细胞中进行2、3、3或2次传代培养获得。在下文中，描述了用于制备各个血清型的preVMS种的具体程序。
(i) 血清型1 PreVMS种(PreVMS1)
对于首次传代培养，减毒株1以0.001的多重性感染(MOI)接种和在37℃在5% CO2下将病毒吸收至Vero细胞90分钟。之后加入无血清培养基，接着在37℃在5% CO2下培养。培养后12天，与培养容器一起，重复两次冷冻和解冻。然后进行离心(1500 rpm, 5分钟)以沉淀细胞和细胞碎片，以回收上清液。以量20%加入FBS (胎牛血清)至上清液中作为稳定剂后，用碳酸氢钠调节pH和上清液在-60℃或更低温度下贮存。作为噬斑测定法的测量结果，传染性效价是1.6 × 107 PFU/mL。
对于第二次传代培养，在首次传代培养后减毒株1以0.001的MOI接种和在37℃在5% CO2下将病毒吸收至Vero细胞90分钟。之后，加入无血清培养基，接着在37℃在5% CO2下培养。培养后9天，回收培养上清液。加入终浓度20%的FBS作为稳定剂后，用碳酸氢钠调节pH和将上清液暂时冷藏。在解冻后，将上清液以0.2 μm无菌过滤，和在-60℃或更低温度下贮存。作为噬斑测定法的测量结果，PreVMS1的传染性效价是5.1 × 106 PFU/mL。
(ii) 血清型2 PreVMS种(PreVMS2)
对于首次传代培养，减毒株2以0.001的MOI接种和在37℃在5% CO2下将病毒吸收至Vero细胞90分钟。之后加入MEM+2%培养基，接着在37℃在5% CO2下培养。培养后10天，与培养容器一起重复两次冷冻和解冻。然后，进行离心(1500 rpm, 5分钟)以沉淀细胞和细胞碎片以回收上清液。加入终浓度20%的FBS作为稳定剂后，用碳酸氢钠调节pH和将上清液以0.2 μm无菌过滤，并在-60℃或更低温度下贮存。作为噬斑测定法的测量结果，传染性效价是2.7 × 105 PFU/mL。
对于第二次传代培养，在首次传代培养后减毒株2以0.001的MOI接种和在37℃在5% CO2下将病毒吸收至Vero细胞90分钟。之后加入MEM+2%培养基，接着在37℃在5% CO2下培养。培养后11天，与培养容器一起重复两次冷冻和解冻。然后，进行离心(1500 rpm, 5分钟)以沉淀细胞和细胞碎片以回收上清液。在0.2 μm无菌过滤后，加入终浓度20%的FBS作为稳定剂，用碳酸氢钠调节pH，然后将上清液在-60℃或更低温度下贮存。作为噬斑测定法的测量结果，传染性效价是1.1 × 104 PFU/mL。
对于第三次传代培养，在第二次传代培养后减毒株2以0.001的MOI接种和在37℃在5% CO2下将病毒吸收至Vero细胞90分钟。之后加入MEM+2%培养基，接着用密封塞在37℃下培养。培养后6天，回收培养上清液。然后，进行离心(1500 rpm, 5分钟)以沉淀细胞和细胞碎片以回收上清液。在0.2 μm无菌过滤后，加入终浓度20%的FBS作为稳定剂，用碳酸氢钠调节pH，然后将上清液在-60℃或更低温度下贮存。作为噬斑测定法的测量结果，PreVMS2的传染性效价是7.1 × 104 PFU/mL。
(iii) 血清型3 PreVMS种(PreVMS3)
对于首次传代培养，减毒株3以0.001的MOI接种和在37℃在5% CO2下将病毒吸收至Vero细胞90分钟。之后加入无血清培养基，接着在37℃在5% CO2下培养。培养后10天，回收培养上清液。在0.2 μm无菌过滤后，加入终浓度20%的FBS作为稳定剂，用碳酸氢钠调节pH，然后将上清液在-60℃或更低温度下贮存。作为噬斑测定法的测量结果，PreVMS2的传染性效价是9.8 × 104 PFU/mL。
对于第二次传代培养，在首次传代培养后减毒株3以0.001的MOI接种和在37℃在5% CO2下将病毒吸收至Vero细胞90分钟。之后加入无血清培养基，接着在37℃在5% CO2下培养。培养后7天，回收培养上清液。然后进行离心(1500 rpm, 5分钟)以沉淀细胞和细胞碎片以回收上清液。在0.2 μm无菌过滤后，加入终浓度20%的FBS作为稳定剂，用碳酸氢钠调节pH，然后将上清液在-60℃或更低温度下贮存。作为噬斑测定法的测量结果，传染性效价是1.3 × 105 PFU/mL。
对于第三次传代培养，在第二次传代培养后减毒株3以0.001的MOI接种和在37℃在5% CO2下将病毒吸收至Vero细胞90分钟。之后加入无血清培养基，接着在37℃在5% CO2下培养。培养后7天，回收培养上清液。然后进行离心(1500 rpm, 5分钟)以沉淀细胞和细胞碎片以回收上清液。在0.2 μm无菌过滤后，加入终浓度20%的FBS作为稳定剂，用碳酸氢钠调节pH，然后将上清液在-60℃或更低温度下贮存。作为噬斑测定法的测量结果，PreVMS3的传染性效价是3.7 × 105 PFU/mL。
(iv) 血清型4 PreVMS种(PreVMS4)
对于首次传代培养，减毒株4以0.001的MOI接种和在37℃在5% CO2下将病毒吸收至Vero细胞90分钟。之后加入无血清培养基，接着在37℃在5% CO2下培养。培养后7天，回收培养上清液。然后进行离心(1500 rpm, 5分钟)以沉淀细胞和细胞碎片以回收上清液。在0.2 μm无菌过滤后，加入终浓度20%的FBS作为稳定剂，用碳酸氢钠调节pH，然后将上清液在-60℃或更低温度下贮存。作为噬斑测定法的测量结果，传染性效价是1.9 × 107 PFU/mL。
对于第二次传代培养，在首次传代培养后减毒株4以0.001的MOI接种和在37℃在5% CO2下将病毒吸收至Vero细胞90分钟。之后加入无血清培养基，接着在37℃在5% CO2下培养。培养后5天，回收培养上清液。然后进行离心(2000 rpm, 5分钟)以沉淀细胞和细胞碎片以回收上清液。在0.2 μm无菌过滤后，加入终浓度20%的FBS作为稳定剂，用碳酸氢钠调节pH，然后将上清液在-60℃或更低温度下贮存。作为噬斑测定法的测量结果，PreVMS4的传染性效价是5.5 × 107 PFU/mL。
(3) VMS的制备
PreVMS进一步进行1次传代培养以制备病毒库的最上游，即VMS1、VMS2、VMS3和VMS4。在下文中描述了用于制备各个血清型的VMS的具体程序。
(i) VMS1
PreVMS1以0.01的MOI接种和在37℃在5% CO2下将病毒吸收至Vero细胞90分钟。之后加入无血清培养基，接着在37℃在5% CO2下培养。培养后7天，与培养容器一起重复两次冷冻和解冻。然后进行离心(3000 rpm, 10分钟)以沉淀细胞和细胞碎片以回收上清液。加入终浓度20%的FBS作为稳定剂和终浓度0.2%的碳酸氢钠后，将上清液以0.2 μm无菌过滤和在-60℃或更低温度下贮存。作为噬斑测定法的测量结果，VMS1的传染性效价是1.49 ×106 PFU/mL。
(ii) VMS2
PreVMS2以0.001的MOI接种和在37℃在5% CO2下将病毒吸收至Vero细胞90分钟。之后加入无血清培养基，接着在37℃在5% CO2下培养。培养后8天，回收培养上清液。然后进行离心(1800 rpm, 10分钟)以沉淀细胞和细胞碎片以回收上清液，其进行0.2 μm无菌过滤。加入相对于上清液0.258倍量的FBS作为稳定剂和相对于上清液0.03445倍量的碳酸氢钠后，上清液在-60℃或更低温度下贮存。作为噬斑测定法的测量结果，VMS2的传染性效价是2.07 × 105 PFU/mL。
(iii) VMS3
PreVMS3以0.01的MOI接种和在37℃在5% CO2下将病毒吸收至Vero细胞90分钟。之后加入无血清培养基，接着在37℃在5% CO2下培养。培养后6天，回收培养上清液。然后进行离心(3000 rpm, 10分钟)以沉淀细胞和细胞碎片以回收上清液。加入终浓度20%的FBS作为稳定剂和终浓度0.2%的碳酸氢钠后，将上清液以0.2 μm无菌过滤和在-60℃或更低温度下贮存。作为噬斑测定法的测量结果，VMS3的传染性效价是6.49 × 104 PFU/mL。
(iv) VMS4
PreVMS4以0.01的MOI接种和在37℃在5% CO2下将病毒吸收至Vero细胞90分钟。之后加入无血清培养基，接着在37℃在5% CO2下培养。培养后6天，回收培养上清液。然后进行离心(3000 rpm, 10分钟)以沉淀细胞和细胞碎片以回收上清液。加入终浓度20%的FBS作为稳定剂和终浓度0.2%的碳酸氢钠后，将上清液以0.2 μm无菌过滤和在-60℃或更低温度下贮存。作为噬斑测定法的测量结果，VMS4的传染性效价是9.39 × 106 PFU/mL。
(4) Pre-CTM的制备
接下来制备用于测试GLP的批料(下文称为"Pre-CTM"；临床前试验材料)。对于血清型1，VMS1在Vero细胞中进行4次传代培养以获得Pre-CTM1。对于血清型2-4，VMS2-4在Vero细胞中进行2次传代培养以制备病毒工作种(VWS)。VWS2-4进一步进行2次传代培养(从VMS计算总共4次传代培养)以获得Pre-CTM2-4。从VMS至第三次传代培养，在离心培养上清液后，加入终浓度20%的FBS作为稳定剂和加入终浓度0.2%的碳酸氢钠。将上清液以0.2 μm无菌过滤，然后在-60℃或更低温度下贮存。对于作为最后一次传代培养的第四次传代培养，加入终浓度0.2%的碳酸氢钠至培养上清液。在澄清滤液和0.2 μm无菌过滤后，培养上清液用中空纤维膜浓缩。浓缩物进行0.2 μm无菌过滤，然后在-60℃或更低温度下贮存。在此工作实施例中，不制备VWS1，而是制备Pre-CTM1。然而，VMS1可在Vero细胞中进行2次传代培养以制备VWS1，和得到的VWS1可在Vero细胞中进行2次传代培养以制备Pre-CTM1。
(5) 测序
病毒基因组序列如下所述进行研究。从各个血清型的亲株、减毒株、VMS和Pre-CTM的每一个提取RNA，接着用随机引物反转录，形成双链，加入接头序列和扩增，以用SBS测序仪(Illumina)获得短序列的聚合数据。从亲株的数据，使用汇编程序Velvet制备毗连群以获得与登革热病毒同源的最长毗连群。将与所述毗连群具有高度同源性的基因库上的序列进行比对，和补充5'末端序列和/或3'末端序列用作参考序列用于再测序分析。对于再测序分析，使用映射器BWA将序列数据映射至参考序列，并且测定病毒基因组序列(包括混合的核苷酸)(SEQ ID NO: 17-20、21-24、25-28和29-32分别显示亲株1-4、减毒株1-4、VMS1-4和Pre-CTM1-4的核苷酸序列)。从获得的病毒基因组序列，获得氨基酸序列(包括混合的氨基酸)(SEQ ID NO: 1-4、5-8、9-12和13-16分别显示亲株1-4、减毒株1-4、VMS1-4和Pre-CTM1-4的氨基酸序列)。混合的氨基酸仅包括以10%或更高的混合比率存在的那些。为比较氨基酸序列，阈值是位置上的各个氨基酸残基的混合比率彼此不同达10%或更高，以确定氨基酸序列之间的差异。例如，当获得亲株的第50位的氨基酸残基是"丙氨酸95%、甘氨酸5%"和减毒株的第50位的氨基酸残基是"丙氨酸85%、甘氨酸14%、脯氨酸1%"的结果时，亲株的氨基酸的指示是A (仅丙氨酸)，而减毒株的氨基酸的指示是A/G (氨基酸丙氨酸和甘氨酸的混合物)。在此位置中，比较亲株和减毒株之间丙氨酸的混合比率，它们彼此不同达10%或更大(10%)，以确定亲株和减毒株之间"存在差异"。尽管对甘氨酸仅见到9%差异，但当对于至少一个氨基酸残基见到差异时确定"存在差异"。另一方面，当亲株的第100位的氨基酸残基是"丙氨酸94%、甘氨酸6%"和减毒株的第100位的氨基酸残基是"丙氨酸85%、甘氨酸15%"时，亲株的氨基酸的指示也是A (仅丙氨酸)，而减毒株的氨基酸的指示也是A/G。然而，比较亲株和减毒株之间的丙氨酸和甘氨酸的混合比率，它们均彼此不同达小于10% (9%)，以确定亲株和减毒株之间"不存在差异"。
(6) 氨基酸序列的比较
亲株和减毒株的序列彼此比较以鉴定发生氨基酸的完全突变的位置(表1-4)。对于存在混合的氨基酸的亲株位置，减毒株的相应位置突变为并非混合的氨基酸的氨基酸被视为完全突变。
表1
血清型1
Figure DEST_PATH_IMAGE001
表2
血清型2
Figure 102871DEST_PATH_IMAGE002
表3
血清型3
Figure DEST_PATH_IMAGE003
表4
血清型4
Figure 20012DEST_PATH_IMAGE004
接着，减毒株、VMS和Pre-CTM的序列彼此比较以鉴定VMS和Pre-CTM可与减毒株相区分的位置(表5-8)。
表5
血清型1
Figure DEST_PATH_IMAGE005
表6
血清型2
Figure 986699DEST_PATH_IMAGE006
表7
血清型3
Figure DEST_PATH_IMAGE007
Figure 319592DEST_PATH_IMAGE008
表8
血清型4
Figure DEST_PATH_IMAGE009
确认的是，与亲株03135相比，血清型1的VMS和Pre-CTM具有第483位从谷氨酸至赖氨酸、第568位从赖氨酸至精氨酸和第1663位从天冬酰胺至赖氨酸的完全突变，其是在这些位置中与减毒株相同的突变。还确认的是，与亲株03135相比，血清型1的VMS和Pre-CTM具有第482位从赖氨酸至谷氨酸/赖氨酸的混合的氨基酸、第484位从赖氨酸至精氨酸/赖氨酸的混合的氨基酸、第2353位从异亮氨酸/苏氨酸的混合的氨基酸至苏氨酸和第2364位从丙氨酸至苏氨酸/丙氨酸的混合的氨基酸的突变，其是在这些位置中与减毒株不同的突变。
确认的是，与亲株99345相比，血清型2的VMS和Pre-CTM具有第143位从天冬氨酸至天冬酰胺、第400位从苏氨酸至赖氨酸、第1102位从天冬氨酸至天冬酰胺、第1308位从亮氨酸至苯丙氨酸和第1654位从谷氨酸至赖氨酸的完全突变，其是在这些位置中与减毒株相同的突变。还确认的是，与亲株99345相比，血清型2的VMS和Pre-CTM具有第2347位从脯氨酸至脯氨酸/亮氨酸的混合的氨基酸和第2828位从苏氨酸至苏氨酸/甲硫氨酸的混合的氨基酸的突变，其是在这些位置中与减毒株不同的突变。
确认的是，与亲株16562相比，血清型3的VMS和Pre-CTM具有第209位从异亮氨酸至亮氨酸、第582位从丝氨酸至甘氨酸、第1211位从苯丙氨酸至亮氨酸和第1563位从谷氨酰胺至赖氨酸的完全突变，其是在这些位置中与减毒株相同的突变。还确认的是，与亲株16562相比，血清型3的VMS和Pre-CTM具有第671位从赖氨酸/精氨酸的混合的氨基酸至赖氨酸、第687位从丙氨酸至缬氨酸、第764位从苏氨酸至异亮氨酸/苏氨酸的混合的氨基酸和第1237位从丙氨酸至苏氨酸的突变，其是在这些位置中与减毒株不同的突变。
确认的是，与亲株1036相比，血清型4的VMS和Pre-CTM具有第2187位从亮氨酸至苯丙氨酸和第2354位从苯丙氨酸/亮氨酸的混合的氨基酸至丝氨酸的完全突变，其是在这些位置中与减毒株相同的突变。还确认的是，与亲株1036相比，血清型4的VMS和Pre-CTM在第624、742、1628、2286、2482和2508位没有突变，其在这些位置中与减毒株是不同的。
(7) VMS的体外减毒特性
为了确认VMS的体外减毒特性，使用LLC-MK2细胞进行噬斑大小测定法。测量噬斑的直径并分成每个区段，如表9所示。
表9
噬斑大小分段标准
Figure 320915DEST_PATH_IMAGE010
结果是，VMS1、VMS2、VMS3和VMS4的噬斑大小的分布小于亲株，以确认它们的减毒特性(表10)。
表10
噬斑测定结果
Figure DEST_PATH_IMAGE011
(8) VMS的生长温度敏感性测试
对于VMS1、VMS2和VMS4在35°C和39°C，和对于VMS3在35°C和38°C，将VMS1、VMS2、VMS3和VMS4在Vero细胞中培养给定的天数以测定在低温度下和高温度下在培养物之间的生长差异。结果是，与各自的亲株比较，VMS1、VMS2、VMS3和VMS4全部显示高的生长温度敏感性，以确认它们的减毒特性(表11)。
表11
生长温度敏感性测试结果
Figure 143377DEST_PATH_IMAGE012
[实施例2]
1. 使用食蟹猴的四价登革热病毒制剂的功效和安全性测试(1)
用于登革热病毒敏感性的试验动物限于NHP (非人灵长类动物)和一些遗传重组的缺陷小鼠。因此，使用食蟹猴(其是NHP)进行功效(中和抗体反应)和安全性(病毒血症)的评价。中和抗体反应是用于疫苗开发的主要评价项目之一。病毒血症是引起症状的致病性和严重性的要素之一。
(1) 四价登革热病毒制剂(制剂5555)的制备
为观察到接近疫苗实际给予的反应，将VMS1、VMS2、VMS3和VMS4进行4次传代培养(VMSVP1、VMSVP2、VMSVP3和VMSVP4)以制备四价登革热病毒制剂，使得各个VMSVP的剂量是5log10 PFU/mL, 1.0 mL/剂(制剂5555)。在麻醉下在前臂处皮下给予三只食蟹猴制剂5555(组5555)。给予日设定为第0天，和在第0、1、2、3、4、6、8、10、14、30和60天在麻醉下进行血液采集。
(2) 通过Immunospot PRNT测量中和抗体效价
在第0、14、30和60天通过血液采集获得的血清中的中和抗体效价通过ImmunospotPRNT (噬斑减少中和测试)测量。结果是，对于所有三只动物，和对于所有四个血清型，在第14天和之后观察到中和抗体的阳性转化，和阳性保持至少直至第60天(阳性转化的标准是10PRNT50或更大；表12和表13)。
表12
组5555的中和抗体效价(第0天、第14天)
Figure DEST_PATH_IMAGE013
表13
组5555的中和抗体效价(第30天、第60天)
Figure 348094DEST_PATH_IMAGE014
(3) 通过RT-qPCR测量血液中的基因组水平
在第1、2、3、4、6、8、10和14天通过血液采集获得的血清中的病毒基因组水平通过RT-qPCR (实时定量聚合酶链反应)测量，以显示对所有三只动物而言低于定量极限的基因组水平(定量极限：对于血清型1是500，对于血清型2、3和4是1000；单位是基因组拷贝/mL血清)。
以上显示的结果确认了良好的功效和安全性。
[实施例3]
1. 使用食蟹猴的四价登革热病毒制剂的功效和安全性测试(2)
为确认具有不同剂量(混合剂量)的各个血清型的四价登革热病毒制剂对功效和安全性的影响，进行以下实验。
(1) 四价登革热病毒制剂(制剂5353和制剂5333)的制备
制备具有含量分别为5 log10 PFU/剂、3 log10 PFU/剂、5 log10 PFU/剂和3log10 PFU/剂的VMSVP1、VMSVP2、VMSVP3和VMSVP4的制剂(制剂5353)和具有含量为5 log10PFU/剂的VMSVP1和含量为3 log10 PFU/剂的VMSVP2、VMSVP3和VMSVP4的制剂(制剂5333)。中和抗体反应和病毒血症使用三只食蟹猴进行评价(分别为组5353和组5333)。
(2) 通过Immunospot PRNT测量中和抗体效价
对于中和抗体反应，对于组5353和组5333二者在第14天和之后观察到中和抗体的阳性转化(除了组5353的一只动物在第14天没有阳性转化之外)，和阳性保持直至第60天(表6-9)。组5353在第14天没有阳性转化的一只动物在第30天和之后阳性转化，和阳性保持直至第60天(表14-17)。
表14
组5353的中和抗体效价(第0天、第14天)
Figure DEST_PATH_IMAGE015
表15
组5353的中和抗体效价(第30天、第60天)
Figure 733944DEST_PATH_IMAGE016
表16
组5333的中和抗体效价(第0天、第14天)
Figure DEST_PATH_IMAGE017
表17
组5333的中和抗体效价(第30天、第60天)
Figure 402823DEST_PATH_IMAGE018
(3) 通过RT-qPCR测量血液中的基因组水平
对于血清型1和血清型4在第4天仅从组5333的一只动物检出略微超过定量极限的水平的病毒基因组(分别为1632和2808基因组/mL)。然而，组5333和组5353的其它动物的基因组水平低于定量极限。当相等量的血清型1亲株和血清型4亲株以单价接种给予时，与每只动物的峰值病毒水平的几何平均数(分别为75001 (21864-592650)和9853 (3006-32315)基因组/mL，N=3)相比，在第4天检出的动物的病毒基因组水平低。
上述结果显示制剂5353和制剂5333的功效和安全性等同于制剂5555，确认了制剂中各个血清型的病毒剂量的差异不显著影响功效和安全性。
[实施例4]
为评价来自不同于制剂5555、制剂5353和制剂5333的减毒登革热病毒的包含登革热病毒的制剂，进行以下实验。
(1) 减毒株2B和4B的制备
类似于实施例1(1) "减毒株的制备"，减毒血清型2登革热病毒通过使临床分离的毒株99345作为亲株在PDK细胞中进行35次传代培养制备，和被称为减毒株2B。同样，减毒血清型4登革热病毒通过使临床分离的毒株1036作为亲株在PDK细胞中进行45次传代培养制备，和被称为减毒株4B。
(2) LAVVP2B和LAVVP4B的制备
减毒株2B和4B在Vero细胞中进行传代培养以分别获得LAVVP2B (活减毒病毒Vero传代2B)和LAVVP4B。
(3) VMSVP123LAVVP4和VMSVP13LAVVP24的制备
制备包含VMSVP1、VMSVP2、VMSVP3和LAVVP4B的四价登革热病毒制剂(各自5 log10PFU/剂；称为"VMSVP123LAVVP4")和包含VMSVP1、LAVVP2B、VMSVP3和LAVVP4B的四价登革热病毒制剂(各自5 log10 PFU/剂；称为"VMSVP13LAVVP24")和使用三只食蟹猴评价中和抗体反应和病毒血症(分别为组VMSVP123LAVVP4和组VMSVP13LAVVP24)。
(4) 通过PRNT测量中和抗体效价
通过PRNT，测量组VMSVP123LAVVP4和组VMSVP13LAVVP24的中和抗体效价。结果是，两种制剂诱导等同于制剂5555的中和抗体反应(表18和19)。
表18
组VMSVP123LAVVP4和组VMSVP13LAVVP24的中和抗体效价(GMT, N=3)(第0天、第14天)
Figure DEST_PATH_IMAGE019
表19
组VMSVP123LAVVP4和组VMSVP13LAVVP24的中和抗体效价(GMT, N=3)(第30天、第60天)
Figure 333870DEST_PATH_IMAGE020
(5) 通过RT-qPCR测量血液中的基因组水平
对于病毒血症，从组VMSVP123LAVVP4在第1天检出相当高水平的血清型4病毒基因组(10066基因组/mL, GMT, N=3)和从组VMSVP13LAVVP24在第1天检出相当高水平的血清型4病毒基因组和略微超过定量极限的水平的血清型1和2病毒基因组(分别为12340、547和1337基因组/mL, GMT, N=3)，表明与LAVVP相比，VMSVP是高度减毒的。
引人关注的是，血清型1病毒基因组，尽管略微检出，但从组VMSVP13LAVVP24的两只动物在第1天检出，表明在四价登革热病毒制剂中VMSVP的良好组合。
[实施例5]
(1) 四价登革热病毒制剂(制剂5555)的中和抗体效价的长期观察试验
为进行使用VMSVP1、VMSVP2、VMSVP3和VMSVP4制备的显示良好功效和安全性的四价登革热病毒制剂(制剂5555)的中和抗体效价的长期评价，总共6只食蟹猴(ID No.1-6)接受制剂5555的单次接种。接种月设定为第0月，和在第1、2、3、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、23和25月测量中和抗体效价(病灶减少中和效价50；下文称为"FRNT50")超过2年。
结果是，在第1月和之后从所有动物观察到中和抗体的阳性转化(FRNT50 > 10)。对于血清型1-4的任何一种，中和抗体效价的几何平均数是100或更大。中和抗体效价保持在相同的水平达两年或更久，和未观察到下降趋势(图1-4)。
因此，四价登革热病毒制剂(制剂5555)，因为显示功效至少2年和没有下降趋势，被预期长期保持其中和抗体效价。
(2) 接种的频率和间隔的研究
为评价接种四价登革热病毒制剂(制剂5555)的频率和间隔，以1个月间隔的两次接种和6个月间隔的两次接种的时间表，总共6只食蟹猴接受制剂5555的接种。
结果是，对于1个月间隔的两次接种和6个月间隔的两次接种，中和抗体效价增加至与单次接种相同的程度，和在第二次接种后未观察到中和抗体效价的显著变化。因此，表明包含本发明的登革热病毒减毒株的疫苗能够以单次接种诱导充分的中和抗体反应(图5-8；图5-8显示当各自5 log10 PFU/剂的四价登革热病毒制剂以单次接种(N=6)、1个月间隔的两次接种(N=6)和6个月间隔的两次接种(N=6)给予食蟹猴时中和抗体效价的几何平均数；竖线表示±SD)。
(3) 剂量试验
为研究不同的剂量的反应，各自5 log10、各自3 log10、各自2 log10和各自1log10 FFU/剂的四价登革热病毒制剂经制备和以单次接种给予食蟹猴。接种周被设定为第0周，和在第2周和第5周测量中和抗体效价。
结果是，从所有动物在第2周观察到中和抗体的阳性转化，和在第5周阳性保持。因此，以低至各自1 log10 FFU/剂的抗原量确认中和抗体反应(图9-12；图9-12显示当各自5log10 FFU/剂(N=1)、各自3 log10 FFU/剂(N=3)、各自2 log10 FFU/剂(N=3)和各自1log10 FFU/剂(N=3)的四价登革热病毒制剂在第0周、第2周和第5周以单次接种给予食蟹猴时中和抗体效价的几何平均数；竖线表示±SD)。
[实施例6]
(1) GLP功效试验
实施例1制备的Pre-CTM经混合以制备5555 Log10 FFU/剂、4444 Log10 FFU/剂和3333 Log10 FFU/剂的四价登革热疫苗制剂。将制备的四价登革热疫苗制剂或介质以单次接种给予食蟹猴，以评价诱导中和抗体的能力和针对攻击性病毒(亲株)的保护能力。
中和抗体效价通过Immunospot PRNT获得。对于来自5555 Log10 FFU/剂接种组(N=24)、4444 Log10 FFU/剂接种组(N=24)和3333 Log10 FFU/剂接种组(N=24)的所有动物在第14天和之后观察到中和抗体的阳性转化(表20-28)。另一方面，对于介质接种组未观察到中和抗体的阳性转化(表29、30)。
为评价针对攻击性病毒(亲株)的保护能力，每个组进一步分为各自由6只动物组成的统一组，和在第60天进行各个血清型的单价亲株的皮下攻击。对于各个血清型的攻击量设定为5 Log10 PFU/剂、5 Log10 PFU/剂、6 Log10 PFU/剂和5 Log10 PFU/剂。攻击后1、2、3、4、6、8、10、14天，测量血清中的病毒基因组水平以显示在介质接种组(各自N=3)中检出许多病毒基因组(表31)，而在任何疫苗接种组中未检出病毒基因组。
表20
5555 Log10 FFU/剂接种组的中和抗体效价
Figure DEST_PATH_IMAGE021
表21
Figure 275150DEST_PATH_IMAGE022
表22
Figure DEST_PATH_IMAGE023
表23
4444 Log10 FFU/剂接种组的中和抗体效价
Figure 12162DEST_PATH_IMAGE024
表24
Figure 473230DEST_PATH_IMAGE025
表25
Figure 903075DEST_PATH_IMAGE026
表26
3333 Log10 FFU/剂接种组的中和抗体效价
Figure 144700DEST_PATH_IMAGE027
表27
Figure 606774DEST_PATH_IMAGE028
表28
Figure 250245DEST_PATH_IMAGE029
表29
介质接种组的中和抗体效价
Figure 585412DEST_PATH_IMAGE030
表30
Figure 252016DEST_PATH_IMAGE031
表31
攻击后介质接种组的血液基因组水平
Figure 330831DEST_PATH_IMAGE032
[实施例7]
(1) 猴神经毒力试验
根据WHO方案(技术报告系列号978, 2013)使用VMS作为试验物质进行猴神经毒力试验。分配12只食蟹猴至各组，分别5 Log10 FFU/剂、5 Log10 PFU/剂、5 Log10 FFU/剂和5Log10 FFU/剂的各个血清型的VMS，5 Log10 PFU/剂的黄热17D作为参考病毒，经颅内给予动物。给予后，获得30天的临床评分和30天后，仅对脑组织和脊髓进行尸体解剖。结果是，未观察到关于神经毒性有问题的临床病理学和组织病理学发现。
[实施例8]
(1) GLP重复剂量毒性研究
实施例1中制备的Pre-CTM经四价混合以制备7777 Log10 FFU/剂(5mL)和5555Log10 FFU/剂(0.5mL)的四价登革热疫苗制剂。四价登革热疫苗制剂或介质以四周间隔经皮下给予各6只雄性和雌性食蟹猴三次，以进行重复给药的毒性试验。为评价试验物质的毒性和可逆性，最后一次给药后3天将一半食蟹猴进行尸体解剖，和最后一次给药后28天将剩余一半进行尸体解剖。
评价项目是临床体征、一般行为和神经行为功能、皮肤反应、体重、食物消耗、身体温度、眼科学、心电描记术、呼吸速率、尿液分析、血液学、血液化学、尸体解剖、器官重量、组织病理学和睾丸定量检查。
在重复给药毒性试验的给药期和恢复期，在任何给药组中均未发现个体死亡。同样，在给药期和恢复期，对于雄性和雌性给药组在临床体征、一般行为和神经行为功能、皮肤反应、体重、食物消耗、身体温度、眼科学、心电描记术、呼吸速率、尿液分析、尸体解剖、器官重量和睾丸定量检查方面未观察到涉及试验物质的变化。
在血液学方面，在一些个体中观察到白细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜碱白细胞和大的非染色细胞的数量增加，然而这被认为是在接种部位由炎症或免疫反应引起的次级变化，这不是毒理学上显著的。在组织病理学方面，仅在接种部位观察到微小至中度程度的血管附近炎性细胞的浸润，其然而在第三次给药后四周内恢复或显示恢复趋势。
根据上述结果得出，7777 Log10 FFU/剂在本试验中是未观察到不良作用的水平。
工业应用性
本发明可用作使用登革热病毒的疫苗。
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Claims (4)

1.减毒四价登革热病毒(Dengue virus)疫苗，包含以下作为抗原：减毒血清型1登革热病毒(DENV1)的混合物、减毒血清型2登革热病毒(DENV2)的混合物、减毒血清型3登革热病毒(DENV3)的混合物和减毒血清型4登革热病毒(DENV4)的混合物，其中所述疫苗具有以下特征中的一个或多个：
(a) 所述减毒DENV1混合物包含仅具有以下突变的DENV1病毒：E483K、K568R、N1663K、K482E/K、K484R/K、I/T2353T和A2364T/A，
其中所述突变的编号基于包含SEQ ID NO:1的DENV1亲株03135；
(b) 所述减毒DENV2混合物包含仅具有以下突变的DENV2病毒：D143N、T400K、D1102N、L1308F、E1654K、P2347P/L和T2828T/M，
其中所述突变的编号基于包含SEQ ID NO:2的DENV2亲株99345；
(c) 所述减毒DENV3混合物包含仅具有以下突变的DENV3病毒：I209L、S582G、F1211L、Q1563K、A687V、A1237T、K/R671K和T764I/T，
其中所述突变的编号基于包含SEQ ID NO:3的DENV3亲株16562；和
(d) 所述减毒DENV4混合物包含仅具有以下突变的DENV4病毒：L2187F和F/L2354S，
其中所述突变的编号基于包含SEQ ID NO:4的DENV4亲株1036，
其中所述突变中记载的氨基酸仅包括以10%或更高的混合比率存在的那些。
2.减毒四价登革热病毒疫苗，包含权利要求1(a)的减毒血清型1登革热病毒、权利要求1(b)的减毒血清型2登革热病毒、权利要求1(c)的减毒血清型3登革热病毒和权利要求1(d)的减毒血清型4登革热病毒作为抗原。
3.权利要求1或2的减毒四价登革热病毒疫苗，其中减毒血清型1、2、3和4登革热病毒的各自抗原量是1-7 log10 FFU/剂。
4.权利要求1-3中任一项的减毒四价登革热病毒疫苗，其中减毒血清型1、2、3和4登革热病毒的混合比率是1:1:1:1、5:3:5:3或5:3:3:3。
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