TWI736563B

TWI736563B - 庫存之登革熱病毒減毒株的活病毒及以此等做為抗原之登革熱疫苗

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Publication number: TWI736563B
Application number: TW105138843A
Authority: TW
Inventors: 園田憲悟; 新村靖彦; 山折晋; 阿部元治; 丸野真一; 髙木翔太; 林靖久; 亀山和久; 小村英恵; 福田亜紀; 内田奈緒美; 吉村昌也
Original assignee: 日商Ｋｍ生物醫藥股份有限公司
Priority date: 2015-11-27
Filing date: 2016-11-25
Publication date: 2021-08-21
Also published as: AU2016360487C1; WO2017090762A1; IL259451B; AU2016360487A1; JP6910956B2; KR102373570B1; TW201726913A; BR112018010690A2; BR112018010690A8; AU2016360487B2; CN108699534A; IL259451A; AU2016360487A2; CN108699534B; KR102297300B1; JP2021168672A; CA3005814C; MX2018006500A; US10655110B2; CA3005814A1

Abstract

藉由單次投與而誘導對於全部4種登革熱病毒血清型之中和抗體回應，而發現不會產生一定量以上之病毒血症、安全性高的登革熱疫苗。提供藥效(中和抗體回應)及安全性(病毒血症)之成績均優良的4價登革熱病毒製劑。

Description

庫存之登革熱病毒減毒株的活病毒及以此等做為抗原之登革熱疫苗

本發明係關於包含減毒化登革熱病毒之登革熱疫苗。

登革熱病毒感染症，就特定之感染症而言，僅次於世界三大感染症(愛滋病、瘧疾、結核病)，發病者多，以世界規模蔓延。

登革熱病毒為屬於黃病毒科之單股RNA病毒，存在以抗原性區分之4種血清型。若感染到某種血清型之登革熱病毒，藉由獲得免疫，對於相同血清型之登革熱病毒，大概整個生涯不會再感染；然而，另一方面，對於相異血清型之病毒，即使交叉保護時間長，由於僅持續達約12週，仍會發生2次以上之登革熱病毒感染。尤其，已知可能致死之重症「登革出血熱」及「登革休克症候群」，在第2次以後之感染時容易發生。

登革熱病毒感染症無確立之治療法，預防法亦有限。此外，目前對於感染之對策，僅依賴對登革熱病毒宿主之蚊蟲的驅除及環境整頓，對於個人層面之對策，則為有關驅蚊劑之使用及適當服裝的指導。然而，此等在費用方面及效果方面均稱不上充分，期望可藉由能對廣泛年齡層進行接種，且顯示優良有效性之疫苗來防止感染或預防發病。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]歐洲專利第1159968號

[專利文獻2]專利第5197362號

[專利文獻3]專利第5075120號

[專利文獻4]國際公開專利WO2007/141259

[專利文獻5]國際公開專利WO2000/057910

[非專利文獻]

[非專利文獻1] Safety and immunogenicity of tetravalent live-attenuated dengue vaccines in Thai adult volunteers: role of serotype concentration, ratio, and multiple doses, Am. J. Trop MedImmune Hyg., 2002; 66(3):264-72.

[非專利文獻2] Dengue vaccines: recent developments, ongoing challenges and current candidates, Expert Rev Vaccines., 2013; 12(8):933-53.

[非專利文獻3] Efficacy of a tetravalent chimeric dengue vaccine (DENVax) in Cynomolgus macaques., Am J Trop Med Hyg., 2011; 84(6):978-87.

[非專利文獻4] Recombinant, live-attenuated tetravalent dengue virus vaccine formulations induce a balanced, broad, and protective neutralizing antibody response against each of the four serotypes in rhesus monkeys., J Virol, 2005; 79(9):5516-28.

[非專利文獻5] Evaluation of Interferences between Dengue Vaccine Serotypes in a Monkey Model, Am J Trop Med Hyg., 2009; 80(2):302-11.

[非專利文獻6] Protection of Rhesus monkeys against dengue virus challenge after tetravalent live attenuated dengue virus vaccination., J Infect Dis., 2006; 193(12):1658-65.

[發明之概要]

如上述，由於研判藉由與初次感染之相異血清型所造成之第2次以後的感染，症狀嚴重化之風險高，故期望同時賦予全部4種血清型登革熱病毒之防禦能力的4價疫苗。然而儘管經過數十年疫苗開發之功夫，對全部4種血清型顯示優良有效性之疫苗仍不存在。

登革熱病毒基因組係編碼C蛋白質、M蛋白質、E蛋白質等構造蛋白質，以及不構成病毒粒子而於複製時才作用的7個非構造(NS)蛋白質。因此，以其他病毒或特定血清型登革熱病毒做為骨架之基因重組嵌合體(chimera)活疫苗、或不活化全粒子疫苗、亞單位(subunit)疫苗、DNA疫苗等，欠缺來自登革熱病毒之成分，而僅提交藉由登革熱病毒之自然感染而於身體內所產生之各種免疫抗原中的一部分。

另一方面，藉由與自然宿主相異之細胞進行繼代馴化，獲得宿主細胞域變異之減毒化活疫苗，如同對麻疹、風疹、腮腺炎、脊髓灰質炎等有實績一樣，藉由誘導與自然感染時同樣之免疫回應，可期待對登革熱病毒感染症具高有效性。

據報告現今開發中或上市之登革熱疫苗，經複數次投與，可誘導對全部4種血清型登革熱病毒之中和抗體，然而要獲得對全部4種血清型之中和抗體需要一段時間，在流行地區，於該期間中有自然感染之風險，因此藉由單次投與，即可對全部4種血清型賦予防禦免疫的疫苗有用性可謂更高。

在登革熱病毒疫苗之調製時，各血清型之病毒株及用量之混合組成的選定並不容易。在以單價投與之情況，即使可誘導高中和抗體，若將4價混合並投與，有對各血清型登革熱病毒之中和抗體濃度變得不均勻(干擾作用)的問題。又，不充分之中和活性(交叉反應、結合)抗體亦有造成抗體依存性感染增強(ADE；Antibody-Dependent Enhancement)的問題。

已核准藥品或在臨床階段之主要開發品有3種：Sanofi之ChimeriVax-DEN(Dengvaxia(商標名))、Takeda之DENVax(商標名)及Butantan之TetraVax(商標名)，任一種均為基因重組嵌合體活疫苗。Sanofi之Dengvaxia，係以黄熱疫苗株YF-17D為骨架之基因重組嵌合體活疫苗，在墨西哥、巴西及菲律賓3個國家核准以9歲至45歲為對象，以6個月間隔接種3次的用法。

Dengvaxia之第3階段(Phase3)試驗，在東南亞5個國家中，以2歲至15歲之年齡層之約1萬人及在南美5個國家中以9至16歲之年齡層之約2萬人做為受驗者而實施。其結果，其有效性停留在約6成，尤其對血清型2之有效性低至約4成，不夠充分。又，對於無登革熱既存免疫之受驗者，有效性約4成。再者，第3階段試驗之長期追蹤及在泰國之第2b階段試驗之長期追蹤的結果，顯示於第3年之時點，小於9歲之年齡層的入院風險，高達未接種群之1.6倍，尤其5歲以下高達約5倍。此點是否視為疫苗加強(Vaccine Enhancement)的問題。就有效性低之原因而言，研判為來自登革熱之成分不足或流行株之變異等。因此，若為含有來自登革熱之全部成分，且包含未進行積極選殖之病毒的亞集團(quasispecies)，並經繼代馴化活疫苗，可期待更高的效果。

本發明人等為解決上述課題而專心研究之結果，發現藥效及安全性之成績均優良的減毒化4價登革熱活病毒疫苗。又，發現無論為單次投與，或複數次投與，藥效及安全性之成績均優良的減毒化4價登革熱活病毒疫苗。

已知有將野生型登革熱病毒(血清型1至4)，藉由犬初代腎(PDK；Primary Dog Kidney)細胞或綠猴初代腎(PGMK；Primary Green Monkey Kidney)細胞進行繼代所得到的減毒株。本發明進一步提供藉由以非洲綠猴腎(Vero)細胞進行繼代所得到之減毒化登革熱病毒，及包含將此等庫存化之活病毒做為抗原的減毒化登革熱病毒疫苗。

因此，本發明包含以下項目。

[1]一種減毒化血清型1登革熱病毒，其與血清型1登革熱病毒親株03135的同源性為95%以上，該親株具有使用次世代定序儀(sequencer)所解析之序列編號1之胺基酸序列，且該親株之483位、568位、1663位之任一者的胺基酸完全變異，再者，具有以下(1)至(4)中之任一種以上之變異：(1)K482E或K482E/K、(2)K484R或K484R/K、(3)I/T2353T、(4)A2364T、或A2364T/A。

[2]如[1]記載之減毒化血清型1登革熱病毒，其與序列編號1所示之親株03135之胺基酸序列的同源性為97%以上。

[3]如[1]記載之減毒化血清型1登革熱病毒，其與序列編號1所示之親株03135之胺基酸序列的同源性為99%以上。

[4]如[1]至[3]記載之減毒化血清型1登革熱病毒，其中483位、568位及1663位之胺基酸完全變異。

[5]如[4]記載之減毒化血清型1登革熱病毒，其中483位之變異為E483K。

[6]如[4]記載之減毒化血清型1登革熱病毒，其中568位之變異為K568R。

[7]如[4]記載之減毒化血清型1登革熱病毒，其中1663位之變異為N1663K。

[8]如[4]記載之減毒化血清型1登革熱病毒，其中483位之變異為E483K，568位之變異為K568R，1663位之變異為N1663K。

[9]如[1]至[8]中任一項記載之減毒化血清型1登革熱病毒，其具有前述(1)至(4)之全部變異。

[10]一種減毒化血清型2登革熱病毒，其與血清型2登革熱病毒親株99345的同源性為95%以上，該親株具有使用次世代定序儀所解析之序列編號2之胺基酸序列，且該親株之143位、400位、1102位、1308位、1654位的任一個胺基酸完全變異，再者，具有以下(5)或(6)之變異：(5)P2347L或P2347P/L、(6)T2828M或T2828T/M。

[11]如[10]記載之減毒化血清型2登革熱病毒，其與序列編號2所示之親株99345之胺基酸序列的同源性為97%以上。

[12]如[10]記載之減毒化血清型2登革熱病毒，其與序列編號2所示之親株99345之胺基酸序列的同源性為99%以上。

[13]如[10]至[12]記載之減毒化血清型2登革熱病毒，其中143位、400位、1102位、1308位及1654位之胺基酸完全變異。

[14]如[13]記載之減毒化血清型2登革熱病毒，其中143位之變異為D143N。

[15]如[13]記載之減毒化血清型2登革熱病毒，其中400位之變異為T400K。

[16]如[13]記載之減毒化血清型2登革熱病毒，其中1102位之變異為D1102N。

[17]如[13]記載之減毒化血清型2登革熱病毒，其中1308位之變異為L1308F。

[18]如[13]記載之減毒化血清型2登革熱病毒，其中1654位之變異為E1654K。

[19]如[13]記載之減毒化血清型2登革熱病毒，其中143位之變異為D143N，400位之變異為T400K，1102位之變異為D1102N，1308位之變異為L1308F，1654位之變異為E1654K。

[20]如[10]至[19]中任一項記載之減毒化血清型2登革熱病毒，其具有前述(5)及(6)之變異。

[21]一種減毒化血清型3登革熱病毒，其與血清型3登革熱病毒親株16562的同源性為95%以上，該親株具有使用次世代定序儀所解析之序列編號3之胺基酸序列，且該親株之209位、582位、1211位、1563位之任一者的胺基酸完全變異，再者，具有以下(7)至(10)之任一種以上之變異：(7)K/R671K、(8)A687V、(9)T764I/T、(10)A1237T。

[22]如[21]記載之減毒化血清型3登革熱病毒，其與序列編號3所示之親株16562之胺基酸序列的同源性為97%以上。

[23]如[21]記載之減毒化血清型3登革熱病毒，其與序列編號3所示之親株16562之胺基酸序列的同源性為99%以上。

[24]如[21]至[23]記載之減毒化血清型3登革熱病毒，其中209位、582位、1211位及1563位之胺基酸完全變異。

[25]如[24]記載之減毒化血清型3登革熱病毒，其中209位之變異為I209L。

[26]如[24]記載之減毒化血清型3登革熱病毒，其中582位之變異為S582G。

[27]如[24]記載之減毒化血清型3登革熱病毒，其中1211位之變異為F1211L。

[28]如[24]記載之減毒化血清型3登革熱病毒，其中1563位之變異為Q1563K。

[29]如[24]記載之減毒化血清型3登革熱病毒，其中209位之變異為I209L，582位之變異為S582G，1211位之變異為F1211L，1563位之變異為Q1563K。

[30]如[21]至[29]中任一項記載之減毒化血清型3登革熱病毒，其具有前述(7)至(10)之全部變異。

[31]一種減毒化血清型4登革熱病毒，其與血清型4登革熱病毒親株1036的同源性為95%以上，該親株具有使用次世代定序儀所解析之序列編號4之胺基酸序列，且該親株之2187位或2354位的胺基酸完全變異，再者，於624位、742位、1628位、2286位、2482位、或2508位沒有變異。

[32]如[31]記載之減毒化血清型4登革熱病毒，其與序列編號4所示之親株1036之胺基酸序列的同源性為97%以上。

[33]如[31]記載之減毒化血清型4登革熱病毒，其與序列編號4所示之親株1036之胺基酸序列的同源性為99%以上。

[34]如[31]至[33]記載之減毒化血清型4登革熱病毒，其中2187位及2354位之胺基酸完全變異。

[35]如[34]記載之減毒化血清型4登革熱病毒，其中2187位之變異為L2187F。

[36]如[34]記載之減毒化血清型4登革熱病毒，其中2354位之變異為F/L2354S。

[37]如[34]記載之減毒化血清型4登革熱病毒，其中2187位之變異為L2187F，2354位之變異為F/L2354S。

[38]如[31]至[37]中任一項記載之減毒化血清型4登革熱病毒，其中於624位、742位、1628位、2286位、2482位及2508位沒有變異。

[39]一種減毒化登革熱病毒疫苗，其含有選自[1]至[9]中任一項記載之減毒化血清型1登革熱病毒、[10]至[20]中任一項記載之減毒化血清型2登革熱病毒、[21]至[30]中任一項記載之減毒化血清型3登革熱病毒及[31]至[38]中任一項記載之減毒化血清型4登革熱病毒所成之群組中之1種以上的減毒化登革熱病毒，做為抗原。

[40]一種減毒化4價登革熱病毒疫苗，其含有[1]至[9]中任一項記載之減毒化血清型1登革熱病毒、[10]至[20]中任一項記載之減毒化血清型2登革熱病毒、[21]至[30]中任一項記載之減毒化血清型3登革熱病毒及[31]至[38]中任一項記載之減毒化血清型4登革熱病毒，做為抗原。

[41]如[39]或[40]記載之減毒化登革熱病毒疫苗，其中血清型1、2、3及4之登革熱病毒抗原的混合比率為1：1：1：1、5：3：5：3、或5：3：3：3。

[42]如[39]至[41]中任一項記載之減毒化登革熱病毒疫苗，其中血清型1、2、3及4之登革熱病毒的各抗原量為1至7log10FFU/劑。

[43]一種[1]至[9]記載之減毒化血清型1登革熱病毒的製造方法，其包含將具有使用次世代定序儀所解析之序列編號1之胺基酸序列的血清型1登革熱病毒親株03135，藉由犬初代腎(PDK)細胞進行15至25次繼代，成為減毒株，並將前述減毒株進一步藉由非洲綠猴腎(Vero)細胞進行繼代。

[44]如[1]至[9]記載之減毒化血清型1登革熱病毒的製造方法，其中包含將具有使用次世代定序儀所解析之序列編號1之胺基酸序列的血清型1登革熱病毒親株03135，藉由PDK細胞進行15次繼代，成為減毒株，並將前述減毒株進一步藉由Vero細胞進行繼代。

[45]如[10]至[20]記載之減毒化血清型2登革熱病毒的製造方法，其包含將具有使用次世代定序儀所解析之序列編號2之胺基酸序列的血清型2登革熱病毒親株99345，藉由PDK細胞進行20至35次繼代，成為減毒株，並將前述減毒株進一步藉由Vero細胞進行繼代。

[46]如[10]至[20]記載之減毒化血清型2登革熱病毒的製造方法，其包含將具有使用次世代定序儀所解析之序列編號2之胺基酸序列的血清型2登革熱病毒親株99345，藉由PDK細胞進行25次繼代，成為減毒株，並將前述減毒株進一步藉由Vero細胞進行繼代。

[47]如[21]至[30]記載之減毒化血清型3登革熱病毒的製造方法，其包含將具有使用次世代定序儀所解析之序列編號3之胺基酸序列的血清型3登革熱病毒親株16562，藉由綠猴初代腎(PGMK)細胞進行20至30次繼代，並藉由PDK細胞進行2至5次繼代，成為減毒株，並將前述減毒株進一步藉由Vero細胞進行繼代。

[48]如[21]至[30]記載之減毒化血清型3登革熱病毒的製造方法，其包含將具有使用次世代定序儀所解析之序列編號3之胺基酸序列的血清型3登革熱病毒親株16562，藉由PGMK細胞進行30次繼代、藉由PDK細胞進行4次繼代，成為減毒株，並將前述減毒株進一步藉由Vero細胞進行繼代。

[49]如[31]至[38]記載之減毒化血清型4登革熱病毒的製造方法，其包含將具有使用次世代定序儀所解析之序列編號4之胺基酸序列的血清型4登革熱病毒親株1036，藉由PDK細胞進行35至45次繼代，成為減毒株，並將前述減毒株進一步藉由Vero細胞進行繼代。

[50]如[31]至[38]記載之減毒化血清型4登革熱病毒的製造方法，其包含將具有使用次世代定序儀所解析之序列編號4之胺基酸序列的血清型4登革熱病毒親株1036，藉由PDK細胞進行40次繼代，成為減毒株，並將前述減毒株進一步藉由Vero細胞進行繼代。

本發明提供即使單次投與，亦可誘導對全部4種登革熱病毒血清型之中和抗體回應，並具有與上市之其他減毒活病毒疫苗同等程度之安全性(容忍性)的登革熱疫苗。

[第1圖]第1圖展示中和抗體價之長期經時變化(血清型1)。

[第2圖]第2圖展示中和抗體價之長期經時變化(血清型2)。

[第3圖]第3圖展示中和抗體價之長期經時變化(血清型3)。

[第4圖]第4圖展示中和抗體價之長期經時變化(血清型4)。

[第5圖]第5圖展示中和抗體價之長期經時變化及接種次數非依存性(血清型1)。

[第6圖]第6圖展示中和抗體價之長期經時變化與接種次數非依存性(血清型2)。

[第7圖]第7圖展示中和抗體價之長期經時變化與接種次數非依存性(血清型3)。

[第8圖]第8圖展示中和抗體價之長期經時變化與接種次數非依存性(血清型4)。

[第9圖]第9圖展示中和抗體回應之抗原量非依存性(血清型1)。

[第10圖]第10圖展示中和抗體回應之抗原量非依存性(血清型2)。

[第11圖]第11圖展示中和抗體回應之抗原量非依存性(血清型3)。

[第12圖]第12圖展示中和抗體回應之抗原量非依存性(血清型4)。

[第13圖]第13圖展示4價登革熱疫苗之製作流程。

[用於實施發明之態樣]

若依照本發明，可提供即使單次投與，亦可誘導對全部4種登革熱病毒血清型之中和抗體回應，並具有與上市之其他減毒活病毒疫苗同等程度之安全性(容忍性)的登革熱疫苗。

以下，詳細說明本發明之較佳實施態樣。但是，本發明並不限定於以下之實施態樣。

本發明係關於藉由將臨床分離之野生型登革熱病毒(親株)，藉由PDK細胞、或PGMK細胞與PDK細胞進行繼代所得到之減毒株，進一步藉由Vero細胞進行繼代所得到的減毒化登革熱病毒，包含做為登革熱疫苗用所使用的種株(VMS(Virus Master Seed，主病毒種)、VWS(Virus Working Seed，工作病毒庫種)等)、或製品相當繼代株(GLP試驗用塊體(Pre-CTM：Pre-Clinical Trial Material)等)及使用此等所製作之登革熱疫苗。本發明中，藉由將親株、減毒株、種株、製品相當繼代株之胺基酸序列進行比較檢討，而特定出可識別親株與減毒株的部位以及可識別減毒株與種株、製品相當繼代株的部位。

本發明之減毒化血清型1登革熱病毒，可藉著將為臨床分離株之親株03135(序列編號1)，藉由犬初代腎(PDK)細胞進行15至25次繼代所製出之減毒株1，進一步藉由Vero細胞進行繼代而得到。減毒株1伴隨繼代，相對於親株03135，於483位之麩胺酸、568位之離胺酸、1663位之天冬醯胺酸之任一者或全部變異成其他胺基酸，較佳為具有E483K、K568R、N1663K之變異。本發明之減毒化血清型1登革熱病毒，進一步藉由Vero細胞進行繼代，除上述變異之外，在482位、484位、2353位、2364位之任一者以上亦具有變異，可與減毒株1在遺傳上識別。

本發明之減毒化血清型2登革熱病毒，可藉著將為臨床分離株之親株99345(序列編號2)，藉由PDK細胞進行20至35次繼代所製作之減毒株2，進一步藉由Vero細胞進行繼代而得到。減毒株2伴隨繼代，相對於親株99345，於143位之天冬胺酸、400位之蘇胺酸、1102位之天冬胺酸、1308位之白胺酸、1654位之麩胺酸之任一者或全部變異成其他胺基酸，較佳為具有D143N、T400K、D1102N、L1308F、E1654K之變異。本發明之減毒化血清型2登革熱病毒，進一步藉由Vero細胞進行繼代，在2347位或2828位亦具有變異，可與減毒株2在遺傳上識別。

本發明之減毒化血清型3登革熱病毒，可藉著將為臨床分離株之親株16562(序列編號3)，藉由PGMK細胞進行20至30次繼代，進一步藉由PDK細胞進行2至5次繼代所製出之減毒株3，進一步藉由Vero細胞進行繼代而得到。減毒株3，相對於親株16562，於209位之異白胺酸、582位之絲胺酸、1211位之苯丙胺酸、1563位之麩醯胺酸之任一者或全部變異成其他胺基酸，較佳為具有I209L、S582G、F1211L、Q1563K之變異。本發明之減毒化血清型3登革熱病毒，進一步藉由Vero細胞進行繼代，於671位、687位、764位、1237位之任一者以上亦具有變異，可與減毒株3在遺傳上識別。

本發明之減毒化血清型4登革熱病毒，可藉著將為臨床分離株之親株1036(序列編號4)，藉由PDK細胞進行35至45次繼代所製出之減毒株4，進一步藉由Vero細胞進行繼代而得到。減毒株4，相對於親株1036，於2187位之白胺酸、2354位之苯丙胺酸/白胺酸(混合胺基酸)之任一者或兩者完全變異成其他胺基酸，較佳為具有L2187F、F/L2354S之變異。本發明之減毒化血清型4登革熱病毒，於624位、742位、1628位、2286位、2482位、或2508位不具有變異，可與減毒株4在遺傳上識別。

在本發明中，亦包含含有上述各血清型之登革熱病毒做為抗原的疫苗。可為血清型1至4之各個單價疫苗，亦可為任一種血清型之組合，亦可為4價疫苗。在4價疫苗之情況，血清型1、2、3及4之抗原混合比率可為任意，然而以1：1：1：1、5：3：5：3、5：3：3：3為特佳。亦可將本發明之登革熱病毒疫苗做為初始疫苗，其他疫苗做為追加疫苗(booster)而加以組合。又，亦可與其他黃病毒疫苗混合，或與其他感染症等之疫苗混合而使用。

疫苗之劑型可適時選擇。可為液狀製劑，亦可為粉末製劑，亦可為凍結乾燥製劑。

親株16562及親株1036，係於專利文獻1中揭示，又，在法國之CNCM(Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes)，分別以I-2482、I-2483之編號寄存。又，親株03135在GenBank，部分序列以ADJ18295.1被登錄，親株99345在GenBank，部分序列以ADJ18294.1被登錄。本發明之減毒化登革熱病毒(血清型1至4)，分別以寄存編號PTA-123506、PTA-123505、PTA-123507、PTA-123508寄存在美國之ATCC(American Type Culture Collection；10801 University Boulevard,Manassas,VA 20110 USA)。

本發明中，將登革熱病毒之鹼基序列使用次世代定序儀解析。次世代定序儀亦稱為第2世代定序儀，例如在Illumina公司之SBS定序儀的情況，可同時並行地決定數百萬個以上DNA片段之鹼基序列。原理基本上與使用毛細管電泳之先前桑格法類似，係以DNA片段做為模板，檢測每1個鹼基再合成時之螢光強度，決定鹼基序列者。相對於桑格法中將1至96個DNA片段同時處理，次世代定序儀係藉由形成相當於桑格法之毛細管的「團簇」，針對數百萬個以上DNA片段進行大量並列處理而有所不同。藉此，序列解析之速度快速地提高，而可進行以大基因組區域為對象之研究，或要求高讀數之低頻率變異的研究，或亞集團(quasispecies)之研究。

藉由使用次世代定序儀之鹼基序列解析，可進行病毒之亞集團的研究。其主要特徵為在有混合鹼基之情況，得到其混合比，而可確認亞集團。在本說明書中，將其鹼基序列變換為胺基酸序列來記載，例如，減毒株之第484部位，以離胺酸30%、精胺酸70%等方式來表示。

本說明書中，在與親株或減毒株等比較時，有變異之部位，以K482E、K482E/K等方式記載。其中，「K482E」意指482位之離胺酸變異為麩胺酸。「K482E/K」意指在有離胺酸之482位，變異之結果，變異為麩胺酸者及變異為離胺酸者，兩者混合存在。

登革熱病毒基因組係編碼所謂C蛋白質、M蛋白質、E蛋白質之構造蛋白質，以及編碼不構成病毒粒子，而於複製時作用的7個非構造(NS)蛋白質。從登革熱病毒基因組，轉譯成1條多蛋白質後，接受加工而成為各個構造蛋白質及非構造蛋白質。在本說明書中，在計數胺基酸序列中之位置上，係以多蛋白質之開始密碼子為起點。

在以次世代定序儀測定時，首先從登革熱病毒萃取RNA，經藉由隨機引子之逆轉錄、雙股化、配接(adapter)序列附加、增幅，藉由SBS定序儀得到短鏈序列之集合數據。從親株之數據藉由拼接軟體Velvet製作片段重疊組(contig)，得到與登革熱病毒同源之最長片段重疊組。將該片段重疊組與同源性高之基因庫上的序列對準，補足5’末端及/或3’末端之序列，做為重排序列(resequence)解析之參考序列。重排序列解析係使用定位軟體(mapper)BWA，將序列數據在參考序列上定位，再考量混合鹼基，而決定病毒基因組序列。從所得到之病毒基因組序列，再考量混合胺基酸，得到胺基酸序列。再者，混合胺基酸，係僅指混合比以全體之10%以上存在的胺基酸者。

次世代定序儀之機種，已知有MiSeq或HiSeq(均為Illumina公司製)等，然而其他機種亦可使用。

登革熱病毒之減毒特性，可藉由斑塊大小檢定(plaque size assay)、增殖溫度感受性試驗、或動物實驗等而確認，然而不以此等為限。斑塊大小檢定，可使用例如來自恆河猴之LLC-MK2細胞測定斑塊之直徑，與親株比較若直徑變小，可確認減毒特性。登革熱病毒之增殖溫度感受性試驗，例如使用Vero細胞，改變培養溫度，與親株比較若高溫增殖能力減小，可確認減毒特性。

登革熱病毒之藥效/安全性試驗，係使用NHP(非人靈長類(Non-Human Primate))或一部分基因重組免疫缺損小鼠而進行。NHP之代表例為食蟹獼猴。

中和抗體價測定，可使用以斑塊為指標之PRNT(斑塊縮小中和測試(Plaque Reduction Neutralizing Test))法，或將來自病毒之蛋白質以抗體標識之Immunospot PRNT或FRNT(焦點縮小中和滴定(Focus Reduction Neutralization Titer))法。

血中病毒量之測定，主要採取直接使用斑塊大小檢定，或間接檢測病毒基因組片段之RT-qPCR(即時定量聚合酶連鎖反應(Real Time Quantitative Polymerase Chain Reaction))法，然而不以此等為限。

以下，藉由實施例詳細說明本發明，然而本發明不受此等實施例任何限定。

[實施例1] (1)減毒株之製作

在泰國瑪希敦大學，依照以下順序製出為新穎疫苗候補之減毒化登革熱病毒(血清型1、血清型2、血清型3及血清型4)。血清型1之減毒化登革熱病毒，係以臨床分離株03135做為親株，藉由犬初代腎(PDK)細胞進行15次繼代而製出。血清型2之減毒化登革熱病毒，係以臨床分離株99345做為親株，藉由PDK細胞進行25次繼代而製出。血清型3之減毒化登革熱病毒，係以臨床分離株16562做為親株，使用初代綠猴腎(PGMK)細胞進行30次繼代，進一步藉由PDK細胞進行4次繼代而製出。血清型4之減毒化登革熱病毒，係使用臨床分離株1036做為親株，藉由PDK細胞進行40次繼代而製出。再者，血清型1之減毒化登革熱病毒，藉由Vero細胞進一步進行3次繼代。將此等減毒化登革熱病毒分別稱為減毒株1至4。

(2)PreVMS之製作

當進行VMS(主病毒種(Virus Master Seed))之製作時，首先，製作preVMS種。preVMS種係將減毒株1至4藉由Vero細胞，分別進行2次繼代、3次繼代、3次繼代、2次繼代而得到。以下記載關於各血清型之PreVMS種的具體製作方法。

(i)血清型1PreVMS種(PreVMS1)

第1繼代係以感染複數(Multiplicity of Infection)(MOI)0.001接種減毒株1，於37℃/5%CO₂下，經90分鐘，使病毒吸附於Vero細胞。然後，添加無血清培養基，於37℃/5%CO₂下培養，培養12日後每個培養容器進行2次凍結融解。然後，藉由離心(1500rpm/5分鐘)使細胞及細胞殘餘物沉澱，回收上清液。添加上清液之20%量的FBS(Fetal Bovine Serum；牛胎兒血清)作為安定劑後，藉由碳酸氫鈉調整pH，並於-60℃以下保存。以斑塊檢定測定之結果，感染價為1.6×10⁷PFU/mL。

第2繼代係將減毒株1經1次繼代之病毒，以MOI 0.001接種，於37℃/5%CO₂下，經90分鐘，使病毒吸附於Vero細胞。然後，添加無血清培養基，於37℃/5%CO₂下培養，培養9日後回收培養上清液。在培養上清液中，添加做為安定劑之FBS，成為20%終濃度後，藉由碳酸氫鈉調整pH，暫時凍結保存。融解後，進行0.2μm無菌過濾，並於-60℃以下保存。以斑塊檢定測定之結果，PreVMS1之感染價為5.1×10⁶PFU/mL。

(ii)血清型2PreVMS種(PreVMS2)

第1繼代係以MOI 0.001接種減毒株2，於37℃/5%CO₂下，經90分鐘，使病毒吸附於Vero細胞。然後，添加MEM+2%培養基，於37℃/5%CO2下培養，培養10日後，將每個培養容器進行2次凍結融解。然後，藉由離心(1500rpm/5分鐘)使細胞及細胞殘餘物沉澱，回收上清液。以成為20%終濃度之方式，添加FBS做為安定劑後，藉由碳酸氫鈉調整pH，並進行0.2μm無菌過濾，於-60℃以下保存。以斑塊檢定測定之結果，感染價為2.7×10⁵PFU/mL。

第2繼代係將減毒株2經1次繼代之病毒，以MOI 0.001接種，於37℃/5%CO2下，經90分鐘，使病毒吸附於Vero細胞。然後，添加MEM+2%培養基，於37℃/5%CO2下培養，培養11日後，每個培養容器進行2次凍結融解。然後，藉由離心(1500rpm/5分鐘)，使細胞及細胞殘餘物沉澱，回收上清液。進行0.2μm無菌過濾後，添加上清液之20%量的FBS做為安定劑，藉由碳酸氫鈉調整pH後，於-60℃以下保存。以斑塊檢定測定之結果，感染價為1.1×10⁴PFU/mL。

第3繼代係將減毒株2經2次繼代之病毒，以MOI 0.001接種，並於37℃，經90分鐘，使病毒吸附於Vero細胞。然後，添加MEM+2%培養基，並於37℃進行密栓培養，培養6日後，回收培養上清液。然後，藉由離心(1500rpm/5分鐘)，使細胞及細胞殘餘物沉澱，回收上清液。進行0.2μm無菌過濾後，添加上清液之20%量的FBS做為安定劑，藉由碳酸氫鈉調整pH後，於-60℃以下保存。以斑塊檢定測定之結果，PreVMS2之感染價為7.1×10⁴PFU/mL。

(iii)血清型3PreVMS種(PreVMS3)

第1繼代係以MOI 0.001減毒株3接種，於37℃/5%CO2下，經90分鐘，使病毒吸附於Vero細胞。然後，添加無血清培養基，於37℃/5%CO2下培養，培養10日後，回收培養上清液。進行0.2μm無菌過濾後，添加培養上清液之20%量的FBS做為安定劑，藉由碳酸氫鈉調整pH後，於-60℃以下保存。以斑塊檢定測定之結果，感染價為9.8×10⁴PFU/mL。

第2繼代係將減毒株3經1次繼代之病毒，以MOI 0.001接種，於37℃/5%CO2下，經90分鐘，使病毒吸附於Vero細胞。然後，添加無血清培養基，於37℃/5%CO2下培養，培養7日後，回收培養上清液。然後，藉由離心(1500rpm/5分鐘)，使細胞及細胞殘餘物沉澱，回收上清液。進行0.2μm無菌過濾後，添加上清液之20%量的FBS做為安定劑，藉由碳酸氫鈉調整pH後，於-60℃以下保存。以斑塊檢定測定之結果，感染價為1.3×10⁵PFU/mL。

第3繼代係將減毒株3經2次繼代之病毒，以MOI 0.001接種，於37℃/5%CO2下，經90分鐘，使病毒吸附於Vero細胞。然後，添加無血清培養基，於37℃/5%CO2下培養，培養7日後，回收培養上清液。然後，藉由離心(1500rpm/5分鐘)，使細胞及細胞殘餘物沉澱，回收上清液。進行0.2μm無菌過濾後，對上清液添加20%量的FBS做為安定劑後，藉由碳酸氫鈉調整pH，於-60℃以下保存。以斑塊檢定測定之結果，PreVMS3之感染價為3.7×10⁵PFU/mL。

(iv)血清型4PreVMS種(PreVMS4)

第1繼代，係以MOI0.001接種減毒株4，於37℃/ 5%CO2下，經90分鐘，使病毒吸附於Vero細胞。然後，添加無血清培養基，於37℃/5%CO2下培養，培養7日後，回收培養上清液。然後，藉由離心(1500rpm/5分鐘)，使細胞及細胞殘餘物沉澱，回收上清液。進行0.2μm無菌過濾後，以成為20%終濃度之方式，添加FBS做為安定劑，並藉由碳酸氫鈉調整pH後，於-60℃以下保存。以斑塊檢定測定之結果，感染價為1.9×10⁷PFU/mL。

第2繼代係將減毒株4經1繼代之病毒以MOI 0.001接種，於37℃/5%CO2下，90分鐘使病毒吸附於Vero細胞。然後，添加無血清培養基，於37℃/5%CO2下培養，培養5日後，回收培養上清液。然後，藉由離心(2000rpm/5分鐘)使細胞及細胞殘餘物沉澱，回收上清液。進行0.2μm無菌過濾後，添加FBS做為安定劑，成為20%終濃度後，藉由碳酸氫鈉調整pH，於-60℃以下保存。以斑塊檢定測定之結果，PreVMS4之感染價為5.5×10⁷PFU/mL。

(3)VMS之製作

將PreVMS進一步進行1次繼代，製作成為病毒庫最上游之VMS1、VMS2、VMS3及VMS4。以下，記載有關各血清型之VMS的具體製作方法。

(i)VMS1

將PreVMS1以MOI 0.01接種，於37℃/5%CO2下，經90分鐘，使病毒吸附於Vero細胞。然後，添加無血清培養基，於37℃/5%CO2下培養，培養7日後，每個培養容器進行2次凍結融解。然後，藉由離心(3000rpm/10分鐘)，使細胞及細胞殘餘物沉澱，回收上清液。以使終濃度成為20%之方式添加FBS做為安定劑，及以使終濃度成為0.2%之方式添加碳酸氫鈉，進行0.2μm無菌過濾後，於-60℃以下保存。以斑塊檢定測定之結果，VMS1之感染價為1.49×10⁶PFU/mL。

(ii)VMS2

以MOI 0.001接種PreVMS2，於37℃/5%CO2下，經90分鐘，使病毒吸附於Vero細胞。然後，添加無血清培養基，於37℃/5%CO2下培養，培養8日後，回收培養上清液。然後，藉由離心(1800rpm/10分鐘)，使細胞及細胞殘餘物沉澱，回收上清液，進行0.2μm無菌過濾。添加上清液0.258倍量的FBS做為安定劑及0.03445倍量的碳酸氫鈉，於-60℃以下保存。以斑塊檢定測定之結果，VMS2之感染價為2.07×10⁵PFU/mL。

(iii)VMS3

以MOI 0.01接種PreVMS3，於37℃/5%CO2下，經90分鐘，使病毒吸附於Vero細胞。然後，添加無血清培養基，於37℃/5%CO2下培養，培養6日後，回收培養上清液。然後，藉由離心(3000rpm/10分鐘)，使細胞及細胞殘餘物沉澱，回收上清液。添加做為安定劑之FBS使終濃度成為20%，並添加碳酸氫鈉使終濃度成為0.2%，進行0.2μm無菌過濾後，於-60℃以下保存。以斑塊檢定測定之結果，VMS3之感染價為6.49×10⁴PFU/mL。

(iv)VMS4

以MOI 0.01接種PreVMS4，於37℃/5%CO2下，經90分鐘，使病毒吸附於Vero細胞。然後，添加無血清培養基，於37℃/5%CO2下培養，培養6日後，回收培養上清液。然後，藉由離心(3000rpm/10分鐘)，使細胞及細胞殘餘物沉澱，回收上清液。添加做為安定劑之FBS使終濃度成為20%，並添加碳酸氫鈉使終濃度成為0.2%，進行0.2μm無菌過濾後，於-60℃以下保存。以斑塊檢定測定之結果，VMS4之感染價為9.39×10⁶PFU/mL。

(4)Pre-CTM之製作

繼而，製作GLP試驗用塊體(以下稱為「Pre-CTM」；Pre-Clinical Trial Material)。血清型1，係將VMS1藉由Vero細胞進行4次繼代，得到Pre-CTM1。血清型2至4，係分別將VMS2至4藉由Vero細胞進行2次繼代，製作工作病毒種(Virus Working Seed(VWS))。再者，將VWS2至4分別藉由Vero細胞進行2次繼代(從VMS算起合計4次繼代)，得到Pre-CTM2至4。從VMS至第3繼代為止，將培養上清液離心後，在該上清液中，以使終濃度成為20%之方式添加FBS做為安定劑，並以使終濃度成為0.2%之方式添加碳酸氫鈉。進行0.2μm無菌過濾後，於-60℃以下保存。在為最終繼代之4繼代時，於培養上清液中，以使終濃度成為0.2%之方式添加碳酸氫鈉，進行澄清過濾及0.2μm無菌過濾後，使用中空絲膜濃縮。將濃縮液進行0.2μm無菌過濾後，於-60℃以下保存。再者，在本實施例中未製作VWS1而製作Pre-CTM1，然而將VMS1藉由Vero細胞進行2次繼代，製作VWS1後，進一步藉由Vero細胞進行2次繼代，做為Pre-CTM1。

(5)序列決定

以下述方法調查病毒基因組序列。從各血清型之親株、減毒株、VMS、Pre-CTM分別萃取RNA，經藉由Random引子之逆轉錄、雙股化、配接序列附加、增幅，以Illumina公司之SBS定序儀，得到短鏈序列之集合數據。從親株之數據藉由拼接軟體(assembler)Velvet製作片段重疊組，得到與登革熱病毒同源之最長片段重疊組。將該片段重疊組與同源性高之基因庫上的序列對準，補足5’末端及/或3’末端之序列，做為重排序列解析之參考序列。重排序列解析係使用定位軟體BWA，將序列數據與參考序列配比，再考量混合鹼基，而決定病毒基因組序列(將親株1至4之鹼基序列分別表示在序列編號17至20中，將減毒株1至4之鹼基序列分別表示於序列編號21至24中，將VMS1至4之鹼基序列分別表示於序列編號25至28中，將Pre-CTM1至4之鹼基序列分別表示於序列編號29至32 中)。從所得到之病毒基因組序列，再考量混合胺基酸，得到胺基酸序列(將親株1至4之胺基酸序列分別表示於序列編號1至4中，將減毒株1至4之胺基酸序列分別表示於序列編號5至8中，VMS1至4之胺基酸序列分別表示於序列編號9至12中，將Pre-CTM1至4之胺基酸序列分別表示於序列編號13至16中)。再者，在表記混合胺基酸之情況，就混合比而言，只記載以全體之10%以上存在的胺基酸。又，比較胺基酸序列時，在比較各部位之各胺基酸時，以各混合比偏離10%以上當作閉值，來判定有無差異。例如，在得到親株之50位為「丙胺酸95%、甘胺酸5%」、減毒株之50位為「丙胺酸85%、甘胺酸14%、脯胺酸1%」之解析結果的情況，親株之胺基酸表記為A(只有丙胺酸)、減毒株之胺基酸表記為A/G(丙胺酸與甘胺酸之混合胺基酸)。在此部位，比較親株與減毒株之丙胺酸的混合比，由於有10%以上(10%)之偏離，親株與減毒株成為「有差異」之判定。雖然關於甘胺酸，雖只見到9%之差異，惟若最少1種胺基酸差異被見到，則判定為「有差異」。另一方面，在親株之100位為「丙胺酸94%、甘胺酸6%」、減毒株之100位為「丙胺酸85%、甘胺酸15%」之情況，亦是親株之胺基酸表記為A、減毒株之胺基酸表記為A/G。然而，若分別比較此部位之丙胺酸與甘胺酸的混合比，由於均小於10%(9%)，成為「無差異」之判定。

(6)胺基酸序列比較

比較親株與減毒株之序列，確認胺基酸之完全變異發生的部位(表1至4)。再者，關於混合胺基酸所在之親株部位，在減毒株之相同部位，變異為該親株之混合胺基酸中未含之其他胺基酸的情況，可視為完全變異。

繼而，比較減毒株、VMS、Pre-CTM之序列，確認對比於減毒株，可識別VMS及Pre-CTM之部位(表5至8)。

藉此得知，血清型1之VMS及Pre-CTM，對比於親株03135，483位之麩胺酸完全變異為離胺酸，568位之離胺酸完全變異為精胺酸，1663位之天冬醯胺酸完全變異為離胺酸，可確認在此等部位中，有與減毒株相同之變異。再者，482位之離胺酸變異為麩胺酸/離胺酸之混合胺基酸，484位之離胺酸變異為精胺酸/離胺酸之混合胺基酸，2353位之異白胺酸/蘇胺酸之混合胺基酸變異為蘇胺酸，2364位之丙胺酸變異為蘇胺酸/丙胺酸之混合胺基酸，可確認在此等部位中，與減毒株不同。

血清型2之VMS及Pre-CTM，對比於親株99345，143位之天冬胺酸完全變異為天冬醯胺酸，400位之蘇胺酸完全變異為離胺酸，1102位之天冬胺酸完全變異為天冬醯胺酸，1308位之白胺酸完全變異為苯丙胺酸，1654位之麩醯胺酸完全變異為離胺酸，確認在此等部位中，有與減毒株相同之變異。再者，2347位之脯胺酸變異為脯胺酸/白胺酸之混合胺基酸，2828位之蘇胺酸變異為蘇胺酸/甲硫胺酸之混合胺基酸，確認在此等部位中，與減毒株不同。

血清型3之VMS及Pre-CTM，對比於親株16562，209位之異白胺酸完全變異為白胺酸，582位之絲胺酸完全變異為甘胺酸，1211位之苯丙胺酸完全變異為白胺酸，1563位之麩醯胺酸完全變異為離胺酸，確認在此等部位中，與減毒株為相同之變異。再者，671位之離胺酸/精胺酸之混合胺基酸變異為離胺酸，687位之丙胺酸變異為纈胺酸，764位之蘇胺酸變異為異白胺酸/蘇胺酸之混合胺基酸，1237位之丙胺酸變異為蘇胺酸，確認在此等部位中，與減毒株不同。

血清型4之VMS及Pre-CTM，對比於親株1036，2187位之白胺酸完全變異為苯丙胺酸，2354位之苯丙胺酸/白胺酸之混合胺基酸完全變異為絲胺酸，確認在此等部位中，與減毒株為相同之變異。再者，624位、742位、1628位、2286位、2482位、2508位未有變異，確認在此等部位中，與減毒株不同。

(7)VMS之試管內減毒特性

為了確認VMS之試管內減毒特性，使用LLC-MK2細胞進行斑塊大小檢定。測定斑塊之直徑，依照測定結果，如表9之方式區分。

由此結果，VMS1、VMS2、VMS3及VMS4之斑塊大小分布，對比於各個親株，確認顯示減毒特性(表10)。

(8)VMS之增殖溫度感受性試驗

關於VMS1、VMS2及VMS4，於35℃及39℃，關於VMS3，於35℃及38℃，分別於一定日數期間藉由Vero細胞培養，確認低溫培養時及高溫培養時之增殖量的差異。由此結果，與各個親株比較，在所有VMS1、VMS2、VMS3及VMS4中，增殖溫度感受性高，確認顯示減毒特性(表11)。

[實施例2] 1．使用食蟹獼猴之4價登革熱病毒製劑的藥效/安全性評價試驗1

登革熱病毒感受性實驗動物，由於限定於NHP(Non-Human Primate(非人靈長類))或一部分基因重組免疫缺損小鼠，使用為NHP之食蟹獼猴，實施藥效(中和抗體回應)及安全性(病毒血症)之評價。再者，中和抗體回應為疫苗開發上之主要評價項目之一，病毒血症為導致人類病原性及症狀嚴重化的要素之一。

(1)4價登革熱病毒製劑(5555製劑)之調製

為了觀察接近實際之疫苗投與時的反應，將VMS1、VMS2、VMS3及VMS4藉由Vero細胞進行4次繼代後(VMSVP1、VMSVP2、VMSVP3、VMSVP4)，調製成4價登革熱病毒製劑。此時，各VMSVP之投與量，調製成5log10PFU/mL、1.0mL/劑(5555製劑)。將此5555製劑於麻醉下投與至3隻食蟹獼猴之前腕部皮下(5555群)。以投與時當做第0日，在第0、1、2、3、4、6、8、10、14、30、60日於麻醉下實施採血。

(2)藉由Immunospot PRNT法之中和抗體價測定

藉由Immunospot PRNT(Plaque Reduction Neutralizing Test(斑塊減少中和試驗))法，測定第0、14、30、60日之採血所得到之血清中的中和抗體價。其結果，對於全部3個體、全部4種血清型，於第14日以後，中和抗體轉為陽性，至少至第60日為止之期間維持陽性(轉為陽性之基準為10PRNT50以上；表12及表13)。

(3)藉由RT-qPCR法之血中基因組量測定

依照RT-qPCR(即時定量聚合酶連鎖反應(Real Time Quantitative Polymerase Chain Reaction))法，測定Day1、2、3、4、6、8、10、14所採取之血清中的病毒基因組量，全部3個體全都小於定量極限(定量極限：1型為500，2型、3型及4型為1000；單位為基因組套數(genome copy)/mL血清)。

藉由上述結果，可確認良好之藥效及安全性。

[實施例3] 1．使用食蟹獼猴之4價登革熱病毒製劑的藥效/安全性評價試驗2

為了確認血清型別之不同調配量(混合用量)對於4價登革熱病毒製劑之藥效/安全性的影響，進行以下之實驗。

(1)4價登革熱病毒製劑(5353製劑、5333製劑)之調製

調製VMSVP1及VMSVP2、VMSVP3、VMSVP4之含量分別為5log10PFU/劑、3log10PFU/劑、5log10PFU/劑、3log10PFU/劑之製劑(5353製劑)，及VMSVP1之含量為5log10PFU/劑，VMSVP2、VMSVP3及VMSVP4之含量為3log10PFU/劑的製劑(5333製劑)，使用3隻食蟹獼猴來評價中和抗體回應及病毒血症(分別為5353群、5333群)。

(2)藉由Immunospot PRNT法之中和抗體價測定

關於中和抗體回應，除5353群僅有一隻於第14日對4型未轉為陽性以外，5353群及5333群皆於第14日以後中和抗體轉為陽性，並於至第60日為止之期間維持轉為陽性(表6至表9)。又，即使於第14日未見到4型轉為陽性之5353群的一隻，亦於第30日以後轉為陽性，然後至第60日為止均維持轉為陽性(表14至17)。

(3)藉由RT-qPCR法之血中基因組量測定

在第4日，只有從5333群之一隻，驗出在血清型1及血清型4方面有稍微超過定量極限之病毒基因組(分別為1632、2808基因組/mL)，然而5333群及5353群之其他個體，均小於定量極限。又，在第4日，即使驗出病毒基因組之一隻，與將血清型1之親株及血清型4之親株分別進行等量單價接種之情況的個別高峰病毒量之幾何平均值(分別為75001(21864至592650)、9853(3006至32315)基因組/mL，N=3)相比，仍為較低值。

從上述結果，可確認5353製劑及5333製劑，顯示與5555製劑同等之藥效/安全性，未因製劑中之血清型別之病毒調配量的差異而對藥效/安全性有大的影響。

[實施例4]

對於包含來自與5555製劑、5353製劑及5333製劑相異之減毒化登革熱病毒之登革熱病毒的製劑，亦為了評價之目的，進行以下之實驗。

(1)減毒株2B及減毒株4B之製作

在上述之實施例1(1)減毒株之製作中，將以血清型2之臨床分離株99345做為親株，藉由PDK細胞進行35次繼代所製出的減毒化登革熱病毒，稱為減毒株2B。又，將以血清型4之臨床分離株1036做為親株，藉由PDK細胞進行45次繼代所製出的減毒化登革熱病毒，稱為減毒株4B。

(2)LAVVP2B及LAVVP4B之製作

將減毒株2B及減毒株4B藉由Vero細胞進行繼代，分別得到LAVVP2B(Live Attenuated Virus Vero Passaged 2B)及LAVVP4B。

(3)VMSVP123LAVVP4及VMSVP13LAVVP24之調製

調製由VMSVP1、VMSVP2、VMSVP3及LAVVP4B所組成之4價登革熱病毒製劑(各5log10PFU/劑；稱為「VMSVP123LAVVP4」)及由VMSVP1、LAVVP2B、VMSVP3及LAVVP4B所組成之4價登革熱病毒製劑(各5log10PFU/劑；稱為「VMSVP13LAVVP24」)，使用食蟹獼猴各3隻來評價中和抗體回應及病毒血症(分別為VMSVP123LAVVP4群、VMSVP13LAVVP24群)。

(4)依照PRNT法之中和抗體價測定

依照PRNT法，測定VMSVP123LAVVP4群及VMSVP13LAVVP24群之中和抗體價。其結果，兩製劑均誘導與5555製劑同等之中和抗體回應(表18及表19)。

(5)依照RT-qPCR法之血中基因組量測定

關於病毒血症，於第1日從VMSVP123LAVVP4群，驗出比較高量之4型的病毒基因組(10066基因組/mL，GMT，N=3)，於第1日從VMSVP13LAVVP24群驗出比較高量之4型的病毒基因組，及只稍微超出定量極限之量的1型及2型之病毒基因組(分別為12340、547、1337基因組/mL，GMT，N=3)。從此等結果，暗示VMSVP比LAVVP高度地減毒化。

很耐人尋味地，從VMSVP13LAVVP24群之2隻，在第1日，亦稍微驗出血清型1之病毒基因組，此暗示由VMSVP所組成之4價登革熱病毒製劑之組合特性良好。

[實施例5] (1)4價登革熱病毒製劑(5555製劑)之中和抗體價長期觀察試驗

為了對使用顯示良好藥效/安全性之VMSVP1、VMSVP2、VMSVP3及VMSVP4所調製的4價登革熱病毒製劑(5555製劑)，進行中和抗體價之長期評價，將5555製劑單次接種至全部6隻食蟹獼猴(ID 1至6號)，以接種月當做第0月，於第1、2、3、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、23、25月及2年以上，測定中和抗體價(Focus Reduction Neutralization Titer 50；以下稱為「FRNT₅₀」)。

其結果，從第1個月起可在全部個體中見到中和抗體轉為陽性(FRNT₅₀>10)。又，中和抗體價之幾何平均值，對於1至4型之任一種均為100以上。中和抗體價在其後經過2年以上仍維持相同程度，未見到下降之趨勢(第1圖至第4圖)。

因此，由於4價登革熱病毒製劑(5555製劑)在至少2年以上可見到藥效，又未見到下降之趨勢，可期待經過更長期而維持中和抗體價。

(2)接種次數及接種間隔之檢討

為了進行4價登革熱病毒製劑(5555製劑)之接種次數及接種間隔之評價，以1個月間隔接種2次，6個月間隔接種2次的進度，將本製劑接種於6隻食蟹獼猴。

其結果，在以1個月間隔接種2次、以6個月間隔接種2次之任一種情況，中和抗體價與單次接種之情況上升到大致相同程度，又，接種2次以後，在中和抗體價未見到大變化。因此，暗示包含本登革熱病毒減毒株之疫苗，藉由1次接種，可充分地誘導中和抗體回應。(第5圖至第8圖；第5圖至第8圖展示對於食蟹獼猴(N=6)，將各5log10PFU/劑之4價登革熱病毒製劑單次接種、以1個月間隔接種2次(N=6)及以6個月間隔接種2次(N=6)時之中和抗體價的幾何平均值；垂直短線表示±SD)。

(3)投與用量試驗

再者，為了確認不同用量之反應性，調製各5log10、各3log10、各2log10及各1log10FFU/劑之4價登革熱病毒製劑，並以單次接種於食蟹獼猴。測定接種週為第0週、第2週及第5週之中和抗體價。

其結果，在第2週，全部個體之中和抗體均轉為陽性，又縱使在第5週仍維持陽性。因此，可確認來自低抗原量(各1log10FFU/劑)之中和抗體回應(第9圖至第12圖；第9圖至第12圖展示將各5log10FFU/劑(N=1)、各3log10FFU/劑(N=3)、各2log10FFU/劑(N=3)、各1log10FFU/劑(N=3)之4價登革熱病毒製劑以單次接種於食蟹獼猴後，於第0星期、第2星期及第5星期之中和抗體價的幾何平均值；垂直短線表示±SD)。

[實施例6] (1)GLP藥效試驗

將實施例1所調製之Pre-CTM進行4價混合，調製5555Log10FFU/劑、4444Log10FFU/劑、3333Log10FFU/劑之4價登革熱疫苗製劑。將所調製之4價登革熱疫苗製劑或載劑單次接種於食蟹獼猴之皮下，評價中和抗體誘導能力以及對於攻擊(challenge)病毒(親株)的防禦能力。

中和抗體價係依照Immunospot PRNT法得到。在5555Log10FFU/劑接種群(N=24)、4444Log10FFU/劑接種群(N=24)、3333Log10FFU/劑接種群(N=24)之全部個體中，從第14日起均可見到中和抗體轉為陽性(表20至28)。另一方面，在載劑接種群中未見到中和抗體轉為陽性(表29、30)

為了進行對攻擊病毒(親株)之防禦能力的評價，進一步將各群以每6隻均等地分組，於第60日將各個血清型之單價親株進行皮下攻擊。接種量，各個血清型分別為5Log10PFU/劑、5Log10PFU劑、6Log10PFU/劑、5Log10PFU/劑。攻擊1、2、3、4、6，8，10、14日後，測定血清中之病毒基因組量，在載劑接種群(各N=3)多驗出病毒基因組(表31)，在疫苗接種群之任一群中，均未驗出病毒基因組。

[實施例7] (1)猴神經毒力試驗

以VMS做為受驗物質，依照WHO規程(Technical Report Series No.978，2013)實施猴神經毒力試驗。每1群分配12隻食蟹獼猴，將VMS之各血清型分別以5Log10FFU/劑、5Log10PFU/劑、5Log10FFU/劑、5Log10FFU/劑投與至頭蓋內，以及將作為參考病毒之黃熱病毒(Yellow Fever 17D)以5Log10PFU/劑投與至頭蓋內。投與後，進行30日之臨床評分並於經過30日之時點，實施局部腦組織及脊髓之剖檢。其結果，未見到有神經毒性相關問題的臨床及組織病理學發現。

[實施例8] (1)GLP反覆投與毒性試驗

將實施例1所調製之Pre-CTM進行4價混合，調製7777Log10FFU/劑(5mL)、5555Log10FFU/劑(0.5mL)之4價登革熱疫苗製劑。將4價登革熱疫苗製劑或載劑，分別投與至雌雄各6隻食蟹獼猴之皮下，實施以4週間隔投與3次的反覆投與毒性試驗。為了評價受驗物質之毒性及可逆性，食蟹獼猴之半數於最終投與3日後，剩餘之半數於最終投與28日後，進行剖檢。

評價項目，為一般狀態(Clinical signs)、行動/神經功能(general behavior and neurobehavioral function)、局部反應(skin reaction)、體重(body weight)、攝食量(food consumption)、體溫(body temperature)、眼科檢查(ophthalmology)、心電圖(electrocardiography)、呼吸數(respiratory rate)、尿檢查(urinalysis)、血液學檢查(hematology)、血液生化學檢查(blood chemistry)、剖檢(necropsy)、器官重量(organ weights)、病理組織學檢查(histopathology)、睪丸細胞數評價(quantitative examination of testes)。

於反覆毒性試驗之投與期間及回復期間死亡的個體，在任一個投與群中均未見到。又，於投與期間及回復期間，評價一般狀態、行動/神經功能、局部反應、體重、攝食量、體溫、眼科檢查、心電圖、呼吸數、尿檢查、剖檢、器官重量、睪丸細胞數時，在合計雌雄之任一投與群中均未見到與受驗物質相關的變化。

血液學方面，藉由投與受驗物質，雖然於一部分個體中可發現白血球、嗜中性球、淋巴球、單核球、嗜鹼性球、大型非染色細胞之個數增加，然而研判係因接種部位之發炎或免疫回應所造成的二次變化，在毒性學上並無意義。在病理組織學方面，只有在接種部位之血管周圍發現極小程度至中等程度的發炎性細胞浸潤，然而此等於第3次投與後4週之內顯示回復或有回復傾向。

從上述可得到以下結論：「7777Log10FFU/劑在該試驗中為未觀察到不良反應的劑量(no-observed-adverse-effect level)」。

[產業上之可利用性]

本發明可被利用做為登革熱病毒之疫苗使用。

<110> 日商KM生物醫藥股份有限公司(KM BIOLOGICS CO.,LTD.)

<120> 庫存之登革熱病毒減毒株的活病毒及以此等做為抗原之登革熱疫苗

<130> 573667

<140> JP2015-232013

<141> 2015-11-27

<160> 32

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3392

<212> PRT

<213> 登革熱病毒型1

<220>

<221> 變異體

<222> (199)..(199)

<223> Xaa表示Lys或Glu

<220>

<221> 變異體

<222> (999)..(999)

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<220>

<221> 變異體

<222> (2353)..(2353)

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<220>

<221> 變異體

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<400> 1

<210> 2

<211> 3391

<212> PRT

<213> 登革熱病毒型2

<220>

<221> 變異體

<222> (398)..(398)

<223> Xaa表示Lys或Met

<220>

<221> 變異體

<222> (484)..(484)

<223> Xaa表示Lys或Arg

<400> 2

<210> 3

<211> 3390

<212> PRT

<213> 登革熱病毒型3

<220>

<221> 變異體

<222> (196)..(196)

<223> Xaa表示Gln或His

<220>

<221> 變異體

<222> (485)..(485)

<223> Xaa表示Met或Leu

<220>

<221> 變異體

<222> (671)..(671)

<223> Xaa表示Lys或Arg

<220>

<221> 變異體

<222> (1401)..(1401)

<223> Xaa表示Glu或Asp

<220>

<221> 變異體

<222> (2439)..(2439)

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<220>

<221> 變異體

<222> (2894)..(2894)

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<400> 3

<210> 4

<211> 3387

<212> PRT

<213> 登革熱病毒型4

<220>

<221> 變異體

<222> (1429)..(1429)

<223> Xaa表示Ser或Phe

<220>

<221> 變異體

<222> (2217)..(2217)

<223> Xaa表示Lys或Arg

<220>

<221> 變異體

<222> (2255)..(2255)

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<220>

<221> 變異體

<222> (2344)..(2344)

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<220>

<221> 變異體

<222> (2354)..(2354)

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<220>

<221> 變異體

<222> (2877)..(2877)

<223> Xaa表示Asn或Lys

<400> 4

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<211> 3392

<212> PRT

<213> 登革熱病毒型1

<220>

<221> 變異體

<222> (899)..(899)

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<220>

<221> 變異體

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<211> 3391

<212> PRT

<213> 登革熱病毒型2

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<221> 變異體

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<212> PRT

<213> 登革熱病毒型3

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<212> PRT

<213> 登革熱病毒型4

<220>

<221> 變異體

<222> (742)..(742)

<223> Xaa表示Val或Met

<220>

<221> 變異體

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<223> Xaa表示Gln或His

<220>

<221> 變異體

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<223> Xaa表示Val或Leu

<220>

<221> 變異體

<222> (2286)..(2286)

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<220>

<221> 變異體

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<220>

<221> 變異體

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<211> 3392

<212> PRT

<213> 登革熱病毒型1

<220>

<221> 變異體

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<223> Xaa表示Lys或Glu

<220>

<221> 變異體

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<220>

<221> 變異體

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<220>

<221> 變異體

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<212> PRT

<213> 登革熱病毒型2

<220>

<221> 變異體

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<221> 變異體

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<220>

<221> 變異體

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<221> 變異體

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<220>

<221> 變異體

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<212> PRT

<213> 登革熱病毒型3

<220>

<221> 變異體

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<223> Xaa表示Thr或Ile

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<211> 3387

<212> PRT

<213> 登革熱病毒型4

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<211> 3392

<212> PRT

<213> 登革熱病毒型1

<220>

<221> 變異體

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<221> 變異體

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<221> 變異體

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<211> 3391

<212> PRT

<213> 登革熱病毒型2

<220>

<221> 變異體

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<220>

<221> 變異體

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<223> Xaa表示Lys或Glu

<220>

<221> 變異體

<222> (2190)..(2190)

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<220>

<221> 變異體

<222> (2347)..(2347)

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<220>

<221> 變異體

<222> (2351)..(2351)

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<220>

<221> 變異體

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<220>

<221> 變異體

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<223> Xaa表示Val或Gly

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<211> 3390

<212> PRT

<213> 登革熱病毒型3

<220>

<221> 變異體

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<223> Xaa表示Thr或Ile

<400> 15

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<211> 3387

<212> PRT

<213> 登革熱病毒型4

<220>

<221> 變異體

<222> (521)..(521)

<223> Xaa表示Val或Leu

<220>

<221> 變異體

<222> (1396)..(1396)

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<220>

<221> 變異體

<222> (1506)..(1506)

<223> Xaa表示Gly或Trp

<400> 16

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<211> 10176

<212> DNA

<213> 登革熱病毒型1

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<211> 10173

<212> DNA

<213> 登革熱病毒型2

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<212> DNA

<213> 登革熱病毒型3

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<212> DNA

<213> 登革熱病毒型4

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<212> DNA

<213> 登革熱病毒型1

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<211> 10173

<212> DNA

<213> 登革熱病毒型2

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<212> DNA

<213> 登革熱病毒型3

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<212> DNA

<213> 登革熱病毒型4

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<212> DNA

<213> 登革熱病毒型1

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<212> DNA

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<213> 登革熱病毒型3

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<212> DNA

<213> 登革熱病毒型4

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<212> DNA

<213> 登革熱病毒型1

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<212> DNA

<213> 登革熱病毒型2

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<212> DNA

<213> 登革熱病毒型3

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<211> 10161

<212> DNA

<213> 登革熱病毒型4

<400> 32

本案圖式均為實驗數據，故本案無代表圖。

Claims

一種減毒化登革熱病毒疫苗，係含有選自減毒化血清型1登革熱病毒、減毒化血清型2登革熱病毒、減毒化血清型3登革熱病毒及減毒化血清型4登革熱病毒所構成之群組中的1種以上之減毒化登革熱病毒作為抗原，其中，該減毒化血清型1登革熱病毒係與血清型1登革熱病毒親株03135之同源性為95%以上，該親株係具有使用次世代定序儀所解析之序列編號1的胺基酸序列，且該親株之483位、568位及1663位的胺基酸完全變異，再者，具有(1)K482E或K482E/K、(2)K484R或K484R/K、(3)I/T2353T及(4)A2364T、或A2364T/A之任一種以上之變異；該減毒化血清型2登革熱病毒係與血清型2登革熱病毒親株99345之同源性為95%以上，該親株係具有使用次世代定序儀所解析之序列編號2的胺基酸序列，且該親株之143位、400位、1102位、1308位及1654位的胺基酸完全變異，再者，具有(5)P2347L或P2347P/L、或(6)T2828M或T2828T/M之變異；該減毒化血清型3登革熱病毒，係與血清型3登革熱病毒親株16562之同源性為95%以上，該親株係具有使用次世代定序儀所解析之序列編號3的胺基酸序列，且該親株之209位、582位、1211位及1563位的胺基酸完全變異，再者，具有(7)K/R671K、(8)A687V、 (9)T764I/T及(10)A1237T之任一者以上之變異；該減毒化血清型4登革熱病毒，係與血清型4登革熱病毒親株1036之同源性為95%以上，該親株係具有使用次世代定序儀所解析之序列編號4之胺基酸序列，且該親株之2187位及2354位之胺基酸完全變異，再者，624位、742位、1628位、2286位、2482位、及2508位沒有變異。
如申請專利範圍第1項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該減毒化血清型1登革熱病毒係與序列編號1所示之親株03135之胺基酸序列的同源性為97%以上。
如申請專利範圍第1項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該減毒化血清型1登革熱病毒係與序列編號1所示之親株03135之胺基酸序列的同源性為99%以上。
如申請專利範圍第1項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該減毒化血清型1登革熱病毒中，該483位之變異為E483K。
如申請專利範圍第1項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該減毒化血清型1登革熱病毒中，該568位之變異為K568R。
如申請專利範圍第1項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該減毒化血清型1登革熱病毒中，該1663位之變異為N1663K。
如申請專利範圍第1項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該減毒化血清型1登革熱病毒中，該483位之變異為E483K，該568位之變異為K568R，該1663位之變異為N1663K。
如申請專利範圍第1至7項中任一項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該減毒化血清型1登革熱病毒係具有該(1)至(4)之全部變異。
如申請專利範圍第1項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該減毒化血清型2登革熱病毒係與序列編號2所示之親株99345之胺基酸序列的同源性為97%以上。
如申請專利範圍第1項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該減毒化血清型2登革熱病毒係與序列編號2所示之親株99345之胺基酸序列的同源性為99%以上。
如申請專利範圍第1項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該減毒化血清型2登革熱病毒中，該143位之變異為D143N。
如申請專利範圍第1項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該減毒化血清型2登革熱病毒中，該400位之變異為T400K。
如申請專利範圍第1項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該減毒化血清型2登革熱病毒中，該1102位之變異為D1102N。
如申請專利範圍第1項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該減毒化血清型2登革熱病毒中，該1308位之變異為L1308F。
如申請專利範圍第1項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該減毒化血清型2登革熱病毒中，1654位之變異為E1654K。
如申請專利範圍第1項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該減毒化血清型2登革熱病毒中，該143位之變異為D143N，該400位之變異為T400K，該1102位之變異為D1102N，該1308位之變異為L1308F，該1654位之變異為E1654K。
如申請專利範圍第1、9至16項中任一項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該減毒化血清型2登革熱病毒係具有該(5)及(6)之變異。
如申請專利範圍第1項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該減毒化血清型3登革熱病毒係與序列編號3所示之親株16562之胺基酸序列的同源性為97%以上。
如申請專利範圍第1項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該減毒化血清型3登革熱病毒係與序列編號3所示之親株16562之胺基酸序列的同源性為99%以上。
如申請專利範圍第1項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該減毒化血清型3登革熱病毒中，該209 位之變異為I209L。
如申請專利範圍第1項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該減毒化血清型3登革熱病毒中，該582位之變異為S582G。
如申請專利範圍第1項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該減毒化血清型3登革熱病毒中，該1211位之變異為F1211L。
如申請專利範圍第1項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該減毒化血清型3登革熱病毒中，該1563位之變異為Q1563K。
如申請專利範圍第24項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該減毒化血清型3登革熱病毒中，該209位之變異為I209L，該582位之變異為S582G，該1211位之變異為F1211L，該1563位之變異為Q1563K。
如申請專利範圍第1、18至24項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該減毒化血清型3登革熱病毒係具有該(7)至(10)之全部變異。
如申請專利範圍第1項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該減毒化血清型4登革熱病毒係與序列編號4所示之親株1036之胺基酸序列的同源性為97%以上。
如申請專利範圍第1項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該減毒化血清型4登革熱病毒係與序列編號4所示之親株1036之胺基酸序列的同源性為99%以上。
如申請專利範圍第1項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該減毒化血清型4登革熱病毒中，該2187位之變異為L2187F。
如申請專利範圍第1項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該減毒化血清型4登革熱病毒中，該2354位之變異為F/L2354S。
如申請專利範圍第1項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該減毒化血清型4登革熱病毒中，該2187位之變異為L2187F，該2354位之變異為F/L2354S。
一種減毒化4價登革熱病毒疫苗，係含有減毒化血清型1登革熱病毒、減毒化血清型2登革熱病毒、減毒化血清型3登革熱病毒、以及減毒化血清型4登革熱病毒作為抗原，其中，該減毒化血清型1登革熱病毒係與血清型1登革熱病毒親株03135之同源性為95%以上，該親株係具有使用次世代定序儀所解析之序列編號1的胺基酸序列，且該親株之483位、568位及1663位的胺基酸完全變異，再者，具有(1)K482E或K482E/K、(2)K484R或K484R/K、(3)I/T2353T及(4)A2364T、或A2364T/A之任一種以上之變異；該減毒化血清型2登革熱病毒係與血清型2登革熱病毒親株99345之同源性為95%以上，該親株係具有使用次世代定序儀所解析之序列編號2的胺基酸序列，且該親株之143位、400位、1102位、1308位及1654位的胺基酸完全變異，再者，具有(5)P2347L或P2347P/L、或(6)T2828M或T2828T/M之變異；該減毒化血清型3登革熱病毒，係與血清型3登革熱病毒親株16562之同源性為95%以上，該親株係具有使用次世代定序儀所解析之序列編號3的胺基酸序列，且該親株之209位、582位、1211位及1563位的胺基酸完全變異，再者，具有(7)K/R671K、(8)A687V、(9)T764I/T及(10)A1237T之任一者以上之變異；該減毒化血清型4登革熱病毒，係與血清型4登革熱病毒親株1036之同源性為95%以上，該親株係具有使用次世代定序儀所解析之序列編號4之胺基酸序列，且該親株之2187位及2354位之胺基酸完全變異，再者，624位、742位、1628位、2286位、2482位、及2508位沒有變異。
如申請專利範圍第1或31項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該血清型1、2、3及4之登革熱病毒抗原之混合比率為1：1：1：1、5：3：5：3、或5：3：3：3。
如申請專利範圍第1或31項中任一項所述之減毒化登革熱病毒疫苗，其中，該血清型1、2、3及4之登革熱病毒的各抗原量為1至7log10FFU/劑。