CN108697491A - 用血液处理人造骨植入物的装置和方法 - Google Patents

Abstract

用血液处理人造骨植入物的装置，所述装置包括：容器，所述容器构造成容纳人造骨植入物并用血液填充，其中所述容器包括开口；以及构造成覆盖容器的开口的盖子。本文公开了该装置的其他实施方案和使用该装置的方法。

Description

用血液处理人造骨植入物的装置和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年11月3日提交的美国临时专利申请第62/279,480号的优先权。

技术领域

本主题涉及人造骨植入物。更特别地，本主题涉及在将人造骨植入物放置在患者体内之前处理人造骨植入物。

背景技术

有时需要用各种类型的制剂和物质来处理人造骨植入物，例如牙科植入物和骨替代物，以便增强植入人造骨植入物的组织的康复。特别感兴趣的是用促进人造骨植入物的加速骨结合的制剂处理人造骨植入物。

人造骨植入物由生物相容性材料制成。例如，牙科植入物由钛制成。促进人造骨植入物在骨组织中正确沉降的过程之一是骨结合，也称为骨整合。骨结合是活骨与人造骨植入物表面之间的直接结构和功能连接。换句话说，骨结合可被定义为在人造骨植入物和骨之间形成直接界面，而不介入软组织。这通过在骨与人造骨植入物的表面之间的接触点处进行的结构联接来实现。

骨结合植入物已被用于治疗牙齿缺失，以及用于头颈部重建以促进耳廓下颌骨、上颌骨、鼻骨和眼窝植入物以及骨锚助听器的保留。

具体参考人造牙植入物，骨结合是安装的牙植入物稳定性的主要要求。类似于对骨组织的创伤性损伤，植入物腔的钻孔导致不同的阶段，包括类似于直接骨折愈合的复杂生理机制的级联。首先，由于细胞和血浆止血的机制，发生纤维蛋白聚合和血块形成。血凝块充当支持侵入骨形成细胞和新血管生成的细胞外基质。然后，成骨细胞在钻孔的边界内产生新的骨组织，到达安装的植入物的表面上。成骨细胞迁移到植入物腔的表面，分化，并导致以同位方式形成新的骨组织。植入物-钻孔界面处新骨形成的程度主要决定了安装的牙植入物的稳定性。经过3至6个月的重塑阶段后，牙植入物表面被新形成的骨覆盖60-70％，这密切反映了骨结合的程度。

可以理解的是，加速人造骨植入物的骨结合过程是重要的，例如为了在将人造骨植入物放置在骨组织中之后缩短恢复期。因为在放置牙科植入物之后需要进一步的步骤，例如将牙齿修复体(例如牙齿、桥接段或义齿)附接到植入物或放置保持牙齿修复体的基牙，所以加速牙科植入物的骨结合是非常重要的。但是，推进到这些进一步的步骤取决于植入物周围组织的愈合。牙植入物的加速骨结合缩短了放置牙植入物后的愈合时间，并加速了整个牙植入过程。

加速人造骨植入物(例如牙科植入物)的骨结合的一种方式是用促进骨结合的物质或制剂(例如生长因子)覆盖人造骨植入物的表面。此外，用另外类型的材料或制剂处理人造骨植入物是有利的。这种附加类型的材料或制剂的例子包括但不限于影响植入物周围组织愈合的材料或制剂，增加植入后的愈合时间的材料或制剂，以及改善经历植入的患者的状况的材料或制剂，例如抗生素物质，止痛药等。

用于预处理人造骨植入物的目前可用的装置和方法是麻烦且耗时的。

因此，需要用于在将人造骨植入物放置在目标骨组织中之前容易且短时间地对人造骨植入物(例如牙科植入物和骨替代物)进行预处理的装置和方法。

发明概述

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的方法和材料类似或等同的方法和材料可以用于本主题的实践或测试，但是下面描述合适的方法和材料。如果发生冲突，以包括定义在内的专利说明书为准。另外，这些材料、方法和实施例仅仅是说明性的而不是限制性的。

根据本主题的一个方面，提供了用血液处理人造骨植入物的装置，所述装置包括：容器，所述容器构造成容纳人造骨植入物并用血液填充，其中所述容器包括开口；以及构造成覆盖容器的开口的盖子。

根据一个实施方案，该装置构造成进行离心作用。

根据另一个实施方案，容器和盖构造成与周围空气压力相比保持容器中的负空气压力。

根据又一个实施方案，盖子构造成附接到人造骨植入物，使得人造骨植入物由盖子保持。

根据另一个实施方案，人造骨植入物是牙科植入物。

根据又一实施方案，容器还包括将容器分隔成上部和下部的分离器，其中分离器包括允许上部中的血液与下部中的血液接触的孔。

根据另外的实施方案，人造骨植入物是骨材料。

根据又一个实施方案，分离器构造成将骨材料保持在容器的上部中。

根据本主题的另一方面，提供了用骨结合促进剂覆盖人造骨植入物的方法，所述方法包括：从患者抽取血液；将血液转移到用血液处理人造骨植入物的装置中，其中该装置包括构造成容纳人造骨植入物并用血液填充的容器，并且其中容器包括开口；以及构造成覆盖容器的开口的盖子，并且其中容器容纳人造骨植入物；对该装置进行离心作用；并从装置中移除植入物。

根据一个实施方案，容器和盖子构造成与周围空气压力相比保持容器中的负空气压力，并且由于容器中的负空气压力，血液被转移到容器中。

根据另一个实施方案，在从患者抽取血液之后，对血液进行离心作用，并将从经离心作用的血液中分离出的血浆转移到装置中，并且其中代替对装置进行离心作用，使血浆凝固。

根据又一个实施方案，允许血浆以加速的方式凝固。

根据又一个实施方案，血液或血浆的凝固通过摇动或超声波或其任何组合加速。

附图说明

这里仅通过举例的方式参考附图来描述实施方案。现在具体参照附图详细说明，强调的是，所示出的细节是作为示例并且出于对优选实施方案的说明性讨论的目的，并且出于提供被认为是最有用的和容易理解的实施方案的原理和概念方面的描述而呈现。在这方面，没有试图以比基本理解所必需的更详细的方式显示结构细节，附图中的描述使得本领域技术人员明显了解在实践中可以如何实施若干形式。

在附图中：

-图1A-B分别示出了根据示例性实施方案的用于用全血处理人造骨植入物的装置的侧视图和透视图。

-图2示意性地示出根据示例性实施方案的用于将来自静脉的全血从患者的静脉直接抽取到包含人造骨植入物的装置中的系统。

-图3示意性地示出了根据示例性实施方案的使用本主题的装置在将人造骨植入物植入目标骨组织之前用骨结合促进剂覆盖人造骨植入物的方法的优选实施方案。

-图4A示出了在不存在抗凝剂的情况下在试管中离心作用后的全血样品。

-图4B显示从剩余的离心作用后的全血中分离的凝结的CGF层。

-图4C显示铺在纱布上的凝结的CGF层。

-图5A示意性地示出并且图6A是当容器用全血填充时，包括覆盖有附接有人造骨植入物的盖子的容器的装置的照片。

-图5B示意性地示出并且图6B是当容器在离心作用后用全血填充时，包括覆盖有附接有人造骨植入物的盖子的容器的装置的照片。

-图5C示意性地示出并且图6C是在用全血进行离心作用后，将盖子和人造骨植入物从容器中分离之后附接到装置的盖的人造骨植入物的照片。

-图7是在用图6C中看到的全血离心作用后覆盖人造骨植入物的包覆层的扫描电子显微照片(SEM)。

-图8是用全血离心作用后用CGF包覆的人造骨植入物的另一个实施方案的照片。

-图9显示来自经包覆的植入物的生长因子随时间累积释放的曲线图。

-图10A-D是用MSC培养的CGF包覆的牙植入物的SEM图像。图10A)牙科植入物。图10B)CGF包覆的牙科植入物。图10C)MSC种植的牙科植入物。图10D)与MSC一起孵育的CGF包覆的牙植入物。

-图11A-D是经处理的牙科植入物表面的SEM图像。图11A)牙科植入物表面。图11B)CGF包覆的牙植入物表面。箭头指示血小板。图11C)MSC种植的牙植入物表面。箭头表示种子细胞。图11D)与MSC一起孵育的CGF包覆的牙植入物。

-图12是显示在植入物表面上生长两天的MSC数目的曲线图。

-图13A-C示意性地示出了构造成包覆牙科植入物的装置的另一示例性实施方案。

-图14A-B示出了Boyden小室以评估CGF包覆的植入物对MSC迁移和生长速率的影响。

-图15示意性地示出了构造成由骨材料例如骨替代物形成腻子骨的装置的另一个示例性实施方案。

图16示意性地示出根据示例性实施方案的构造成由骨材料形成腻子骨的分解后的装置。

图17示意性地示出根据示例性实施方案的构造成由骨材料形成腻子骨的组装后的装置。

图18示意性地示出根据示例性实施方案的用于将来自静脉的全血直接从从患者的静脉抽取到构造成由骨材料形成腻子骨的装置中的系统。

-图19A-I是通过使用构造成由骨材料形成腻子骨的装置1制备的腻子骨700的SEM。

发明详述

在详细解释至少一个实施方案之前，应该理解的是，本主题的应用不限于在以下描述中阐述的或者在附图中示出的部件的构造和布置的细节。主题能够具有其他实施方案或以各种方式实践或执行。而且，应该理解的是，在此使用的措辞和术语是为了描述的目的，而不应被认为是限制性的。在讨论下面描述的各种附图时，相似的数字指代相似的部分。图一般不按比例绘制。

为了清楚起见，在一些附图中省略了非必要元素。

如本文所公开的术语“人造骨植入物”是指本领域已知的任何类型的人造骨植入物。人造骨植入物的实例包括但不限于由生物相容性材料如钛制成的人造骨植入物，其用于各种程序，例如人造牙科植入物。其他实例包括但不限于本领域已知的任何形式的骨替代物，粉末、颗粒等。

用于加速人造骨植入物的骨结合的目前可用的方法之一是在将人造骨植入物放置在目标骨组织中之前用全血覆盖人造骨植入物。全血包含促进骨结合的下文称为“骨结合促进剂”的组分、例如祖细胞、包含在血浆中的生长因子等。

优选地，用于处理人造骨植入物的血液样品是自体血液样品，即取自要经受人造骨植入物植入的患者的全血样品。

应该注意的是，本文所公开的术语“患者”是指任何经过人造骨植入的生物体，即任何动物患者，包括人类患者。

目前的做法是在将人造骨植入物放入目标骨组织之前，将人造骨植入物浸入全血样品，优选自体全血样品中。在浸泡期间，包括骨结合促进剂的全血粘附到人造骨植入物上。然后，将人造骨植入物与剩余的全血样品分离并置于目标骨组织中。然而，可以理解，这种方法麻烦，难做，费时，并且可能使覆盖有全血的人造骨植入物暴露于非无菌条件下，这可能增加人造骨植入物污染的几率，例如致病性病毒和细菌可能会导致植入部位周围组织的局部感染，甚至会导致系统性的危及生命的感染。

本主题提供了以简单，快速和易于使用的方式用全血处理人造骨植入物的装置。

本主题还提供了以简单，快速和易于使用的方式用全血生物活化人造骨植入物表面的装置。

本发明还进一步提供了以简单，快速和易于使用的方式用全血生物活化人造骨植入物表面以便加速人造骨植入物的骨结合的装置。

更具体地说，本主题提供了用全血生物活化人造骨植入物表面以增强成骨细胞迁移、粘附、增殖和分化的装置，所有这些都是改善骨结合的关键以及缩短植入部位的康复周期的关键因素。

本主题另外提供了使用该主题的装置用全血处理人造骨植入物的方法。

本主题还提供了使用该主题的装置用全血生物活化人造骨植入物的表面的方法。

本发明主题还提供了使用主题装置用全血生物活化人造骨植入物表面以便加速人造骨植入物的骨结合的方法。

更具体地，本主题提供了用全血生物活化人造骨植入物表面以增强成骨细胞迁移、粘附、增殖和分化的方法，所有这些都是改善骨结合的关键以及缩短植入部位的康复周期的关键因素。

应该注意的是，仅仅为了简单起见，全血偶尔在下文中偶尔被称为“血液”。

图1A-B根据示例性实施方案分别示出了用于用全血处理人造骨植入物的装置1的侧视图和透视图。根据优选实施方案，装置1构造成允许人造骨植入物覆盖有存在于全血中的骨结合促进剂。根据一个实施方案，装置1包括具有开口15(未示出)的容器10和构造成覆盖容器10的开口15的盖子20。容器10构造成容纳本领域已知的任何尺寸和结构的任何人造骨植入物30。根据优选实施方案，人造骨植入物30由生物相容性材料例如钛制成。仅为了简单起见，人造骨植入物30有时在下文中被称为“植入物30”。图1进一步示出了容纳在容器10中的牙科植入物30形式的示例性植入物30。根据优选实施方案，盖子20被配置成附接到植入物30，使得植入物30由盖子20保持。根据一个实施方案，容器10的高度类似于植入物30的长度。根据另一个实施方案，容器10的高度高于植入物30的长度，如图图1A-B所示。根据又一个实施方案，容器10构造成以当植入物30附接到盖子20并且盖子20覆盖容器10时允许植入物30浸入全血中的方式填充全血。

根据一个实施方案，例如用注射器或移液管将全血通过开口15转移到容器10中。然而，将全血转移到容器10中的这种方式是单调乏味的，耗时的，并且更重要的是增加了全血样品和人造骨植入物30暴露于非无菌条件的几率。为了克服这个问题，根据另一个实施方案，全血被转移到容器10中，同时保持容器10被盖子20密封。这可以例如通过保持容器10内的负空气压力，并且使用例如通过盖子20或通过容器的底部17(参见图1A-B)或通过任何装置容器10的一部分穿透到容器10的内部的装置将全血输送到容器10中来实现。

应该指出的是，术语“负空气压力”在下文中偶尔会简称为“真空”。因此，具有负空气压力的部件，例如容器10在下文中有时将被简称为“真空”部件，例如“真空容器”。

因此，根据另一实施方案，容器10和盖子20构造成与周围空气压力相比保持容器10中的负空气压力。根据又一个实施方案，盖子20构造成允许针状装置穿透到容器10的内部。根据又一个实施方案，容器10中的负空气压力处于允许足以覆盖由盖子20保持的人造骨植入物30的一定量的全血进入容器10中的水平。这些实施方案允许将全血转移到容器10中以通过盖子20覆盖保持在容器10内的人造骨植入物30，而不需要打开盖子20，从而避免全血和人造骨植入物30暴露于非无菌状态。

根据一个实施方案，全血从全血源转移到具有负空气压力的密封容器10内。全血源的实例包括包含有全血的注射器、血袋、患者的静脉等。全血源的优选实施方案是患者的静脉。根据另一个优选的实施方案，全血从经由人造骨植入物30植入的患者的静脉转移，即，用于处理人造骨植入物30的全血样品是自体血液样品。

根据一个实施方案，提供了用于在将人造骨植入物30植入目标骨组织之前用骨结合促进剂覆盖人造骨植入物30的方法，所述方法包括：

-提供用全血处理人造骨植入物的装置1，所述装置包括具有开口15的容器10和构造成覆盖开口15并保持人造骨植入物30的盖子20；

-将人造骨植入物30附接到盖子20；

-提供全血样品；

-用全血样品填充容器10；

-用保持人造骨植入物30的盖子20覆盖容器10，使得人造骨植入物30的至少部分浸没在全血中；

-将人造骨植入物30在全血中孵育一段时间，以允许用骨结合促进剂覆盖人造骨植入物30；

-从容器10移除带有用骨结合促进剂覆盖的人造骨植入物30的盖子20；以及

-从盖子分离用骨结合促进剂覆盖的人造骨植入物。

当在将人造骨植入物30植入目标骨组织之前，使用容器10中存在负空气压力的装置1用骨结合促进剂覆盖人造骨植入物30时，应用以下实施方案。

根据一个实施方案，提供了用于将人造骨植入物30存储在用于在负空气压力条件下用全血处理人造骨植入物的装置1中的方法，所述方法包括：

-提供用全血处理人造骨植入物的装置1，该装置包括具有开口15的容器10和构造成密封开口15的盖子20，其中容器10和盖子20构造成保持容器10中的负空气压力，盖子20构造成允许针状装置穿入容器10的内部，并且盖子20被进一步构造成保持人造骨植入物30；

-将人造骨植入物30附接到盖子20；

-以人造骨植入物30容纳在容器10中的方式，用附接有人造骨植入物30的盖子20密封容器10的开口15；以及

-在容器10中产生负空气压力。

通过本领域已知的任何方法在容器10中产生负空气压力，例如使用穿透盖子20的针状装置从容器10中抽出空气，同时保持容器10由盖子20密封。

用于在负空气压力压力条件下将人造骨植入物30存储在装置1中的方法可以例如在制造用于在负空气下压力条件下用包含有人造骨植入物30的全血处理人造骨植入物的装置1的制造过程中来执行。这样的装置1是即用型的，因此使用全血处理人造骨植入物30的过程是快速且易于使用的过程，防止人造骨植入物30和全血暴露于非无菌条件。

由上述方法制备的装置1的使用可以根据以下示例性实施方案。

根据一个实施方案，提供了用于在将人造骨植入物30植入目标骨组织之前用骨结合促进剂覆盖人造骨植入物30的方法，所述方法包括：

-提供用全血处理人造骨植入物的装置1，其包括用盖子20密封的容器10，并包含在负空气压力条件下附接到盖子20的人造骨植入物30；

-将与全血源流体连接的针状装置插入容器10的内部；

-让全血填充容器10的内部并覆盖人造骨植入物的至少部分；

-将人造骨植入物30在全血中孵育一段时间，以允许用骨结合促进剂覆盖人造骨植入物30；

-从容器10移除带有用骨结合促进剂覆盖的人造骨植入物30的盖子20；以及

-从盖子分离用骨结合促进剂覆盖的人造骨植入物。

根据一个实施方案，全血源包含自体全血样品。

根据另一个实施方案，全血源是包含有全血的注射器。

根据另一个实施方案，全血源是包含有全血的血袋。

根据优选实施方案，全血源是患者的静脉。

当全血源是患者的静脉时，优选是经受人造骨植入物30植入的患者的静脉时，插入患者静脉中的针状装置利用导管与通过盖子20插入容器10内部的针状装置流体连接。由于容器10内部的负空气压力，全血从患者的静脉通过导管被抽出到容器10中。

图2示意性地示出根据示例性实施方案的用于将来自静脉的全血直接从患者的静脉抽取到包含人造骨植入物30的装置1中的系统。根据优选实施方案，通过使用例如构造成插入到静脉中的、流体附接到护套54的皮下注射针52，通过本领域已知的静脉穿刺，从患者的静脉例如患者手50中的静脉抽取全血，护套54构造成接受全血。护套设置有塞子56，塞子56构造成塞住护套并且允许管子58插入护套54的内部。管子58包括第一端部，该第一端部构造成通过塞子56插入护套54中，以及构造成穿入装置的容器10中的第二端。这例如通过附接到管子58的第二端的第二针60实现。第二针60构造成穿入装置1的容器10中，并且装置1构造成允许第二针60穿过它穿透。这例如通过使用在其底部，即所述容器10的与容纳人造骨植入物30的盖子20相对的一侧处包括例如橡胶膜66的容器来实现。橡胶膜66构造成允许第二针60穿入容器10的内部。因此，在将皮下注射针52插入患者静脉中时，管子58的第一端部穿入以流体方式与皮下注射针52连接的护套54中时，以及附接到管子58的第二端的第二针60穿入容器10内部时，提供了直接路线，通过该路线直接从患者的静脉直接抽取全血进入容纳人造骨植入物30的容器10中。容器10中的负空气压力有助于将血液从患者的静脉直接抽出到容器10中。

该实施方案的一个优点是，一方面它消除了全血和人造骨植入物暴露于非无菌条件，并且允许以简单，快速和容易的方式用全血覆盖人造骨植入物。

在将人造骨植入物30植入目标骨组织之前用前述用于用骨结合促进剂覆盖人造骨植入物30的方法进行实验期间，令人惊讶地发现，使用不含抗凝固剂的全血样品比使用包含抗凝剂的全血样品有益，抗凝剂例如是肝素、柠檬酸盐等。发现人造骨植入物30上的血液凝结导致用骨结合促进剂更有效地覆盖人造骨植入物30。

因此，根据另一优选实施方案，涉及在将人造骨植入物30植入目标骨组织之前用骨结合促进剂覆盖人造骨植入物30的方法，全血样品不含抗凝剂。

在实验期间，还发现，在容器中有覆盖有不含抗凝剂的全血的人造骨植入物30的同时，用全血处理人造骨植入物30的装置1的离心作用导致骨结合促进剂非常有效的覆盖人造骨植入物30。

因此，根据另外的实施方案，用于用全血处理人造骨植入物的装置1构造成在包含覆盖有全血的人造骨植入物的同时进行离心作用。

根据又一个实施方案，涉及用于在将人造骨植入物30植入目标骨组织之前用骨结合促进剂覆盖人造骨植入物30的方法，所述孵育是将装置1进行离心作用一段时间，允许用骨结合促进剂覆盖人造骨植入物30包括。

根据又一个实施方案，离心作用的范围基本上为2,500-3,500克，时间范围基本上为7-10分钟。

图3根据示例性实施方案示意性地示出了在使用本主题的装置1将人造骨植入物30植入目标骨组织之前用骨结合促进剂覆盖人造骨植入物30的方法的优选实施方案，该方法100包括：

-从患者中抽出血液(112)，优选地，血液从要植入人造骨植入物30的身体中的患者静脉抽出；

-将血液转移到包含有植入物的装置1中(114)，优选地，该装置包括含有植入物的真空容器，并且将血液转移到真空容器中以覆盖植入物；

-对装置1进行离心作用(116)，根据优选实施方案，将容器在大致2,500-3,000g的范围内进行离心作用大约7-10分钟；以及

-从装置中取出植入物。

图4A显示了在不存在抗凝剂的情况下在试管中离心作用后的全血样品。在离心作用过程中，将全血分成三个主要层：上部血浆层，也称为贫血小板血浆(PPP)，下部红细胞(RBC)层和固体中间层，下文称为浓缩生长因子(CGF)层。固体CGF层包含三部分：包含白细胞(WBC)和血小板的上白部分(WP)，下红部分(RP)和中间“血沉棕黄层”(BC)部分。由于在不存在抗凝剂的情况下将全血进行离心作用，所以CGF层凝结。

图4B显示从剩余的经离心作用的全血中分离出的凝结的CGF层。

图4C显示铺在纱布上的凝结的CGF层。

用于包覆牙植入物的生物材料主要由自体浓缩生长因子(CGF)组成。它是由无菌管中收集的全静脉血制成的，不含抗凝剂。在离心作用后，产生富含生长因子的致密纤维蛋白凝块/块。由于高浓度的纤维蛋白原、因子XIII和凝血酶而产生纤维蛋白凝块/块。由凝血酶激活的因子XIII将纤维蛋白原与纤维蛋白凝块交联，增加稳定性和强度，并防止纤溶酶介导的降解。基本上，增强的纤维蛋白基质捕获多种生长因子，例如血小板衍生生长因子、转化生长因子-β、血管内皮生长因子和表皮生长因子。

图5A示意性地示出并且图6A是当容器10填充有全血500时包括容器10的装置1的照片，所述容器10覆盖有盖子20，人造骨植入物30附接到盖子20。

图5B示意性地示出并且图6B是当容器10在离心作用(例如在基本上2,500-3,000克的范围内基本上7-10分钟)之后填充有全血时包括容器10的装置1的照片，该容器10覆盖有盖子20，人造骨植入物30附接到盖子20。作为离心作用的结果，全血500被分离成两个主层，包含红细胞和血小板的下层510和包含血浆的上层520。

图5C示意性地示出并且图6C是在用全血500进行离心作用后，在盖子20和人造骨植入物30与容器10分离之后附接到装置1的盖子20的人造骨植入物30的照片。人造骨植入物30被包含血浆的一些上层520覆盖。

人造骨植入物30被盖子20保持在容器10内部，使得在离心作用之后，人造骨植入物30与上部血浆层、中间血沉棕黄层和下部红细胞层的一些上部接触。因此，离心作用将人造骨植入物与大部分红细胞分离，但允许人造骨植入物大部分与全血样品的血浆、白细胞和血小板直接接触。

作为离心作用的结果，血浆和血沉棕黄层被粘附到人造骨植入物的表面。因此，血浆和血沉棕黄层的成分附着于人造骨植入物的表面，包括骨结合促进剂，例如包含在血浆层中的生长因子和包含在血沉棕黄层中的祖细胞。

图7是在用图6C中看到的全血进行离心作用后覆盖人造骨植入物的包覆层的扫描电子显微照片(SEM)。包覆层包含纤维蛋白网络(由于离心作用而没有互锁的RBC)。人造骨植入物上的包覆层是良好编织的，并且特征是具有致密的纤维蛋白质纹理，具有约0.1微米孔径的细纤维。

图8是用全血离心作用后用CGF包覆的人造骨植入物的另一个实施方案的照片。容易看到包覆人造骨植入物的纤维蛋白凝块。

为了临床证明使用CGF包覆的植入物，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)评估包覆层的生物学活性。通过在培养基中孵育包覆的植入物并对释放到培养基中的生长因子进行定量，体外研究来自CGF包覆层的生长因子的累积释放速率。我们选择研究某些对细胞粘附、增殖和成骨分化具有生物学作用的生长因子，这些都是植入骨结合的关键因素。这些生长因子主要是从纤维蛋白网络内互锁的血小板释放的。纤维蛋白凝块形成是在离心作用过程中开始的，其中重RBC首先沉淀并因此不在纤维蛋白网络内互锁，而较轻的WBC和血小板随后沉淀，伴随纤维蛋白凝块形成，并因此在网络中互锁。纤维蛋白凝块内的这些富含血小板的浓缩物差异地释放生长因子并影响细胞分化和功能。这些生长因子包括：血小板衍生生长因子(PDGF)，其增强细胞生长，血管修复和生成以及胶原蛋白生成；血管内皮生长因子(VEGF)，其促进血管细胞的生长和新一代；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，其参与全身性炎症；转化生长因子-β1(TGF-β1)，其改善上皮细胞的生长和新生；血管细胞和伤口愈合；以及胰岛素样生长因子-1(IGF-1)，其对愈合和细胞生长至关重要。图9中显示了来自包覆植入物的生长因子累积释放的动力学。

图9显示了随着时间的推移，包覆的植入物的生长因子累积释放的曲线图。包覆的植入物在37℃的培养基中孵育不同的时间间隔(5小时，1天，3天，6天，7天或8天)，并对释放到培养基中的生长因子进行定量。使用来自三个不同供体的血液进行释放测试，每个供体都使用植入物在单独的真空容器(v1，v2和v3)中孵育。呈现了个体结果和平均结果。A)随着时间的推移PDGF-AB释放。B)随着时间的推移VEGF释放。C)TNF-α随时间释放。D)随着时间的推移TGF-β1的释放。E)随着时间的推移IGF-1的释放。

所有测试的生长因子均存在于CGF包覆层中并以缓慢的速率释放。PDGF-AB和VEGF释放似乎在八天内增加，而TNF-α，TGF-β1和IGF-1释放似乎随着时间的推移是恒定的。未来的研究将测量包含蛋白酶抑制剂的培养基中生长因子的释放，以说明降解的生长因子释放。生长因子的释放将进行更长时间的评估；长达20天。

使用SEM来表征用细胞接种的CGF包覆的牙植入物的表面。将从骨髓中分离的间充质干细胞(MSC)以100,000MSC/ml/牙植入物的密度接种到CGF包覆的植入物上，然后培养2天。这是为了验证CGF包衣对细胞粘附和生长的影响。然后将样品固定，并观察植入物包衣的三维形态和细胞的分布(图10A-D和11A-D)。

图10A-D是用MSC培养的CGF包覆的牙植入物的SEM图像。图10A)牙科植入物。图10B)CGF包覆的牙科植入物。图10C)MSC接种的牙科植入物。图10D)与MSC一起孵育的CGF包覆的牙植入物。

图11A-D是经处理的牙科植入物表面的SEM图像。图11A)牙科植入物表面。图11B)CGF包覆的牙植入物表面。箭头指示血小板。图11C)MSC种植的牙植入物表面。箭头表示种子细胞。图11D)与MSC一起孵育的CGF包覆的牙植入物。箭头表示种子细胞。

裸露的钛牙植入物表面(图11A)与CGF包覆的植入物表面不同，后者表现出纤维蛋白纤维(图11B)。细胞附着于裸露的植入物表面(图11C)，但在CGF包覆的表面上观察到更多数目(图11D)。

在证实了CGF包覆层的三维结构和生长因子释放速率之后，我们研究了CGF包衣在骨髓源性MSC上的生物学活性。由于CGF包衣含有纤维蛋白基质和生长因子，通过AlamarBlue代谢活性测定法测试了层上的MSC的粘附和增殖。将MSC以100,000MSCs/ml/牙植入物的密度接种，并评估粘附于植入物表面并增殖2天的细胞数量(图12)。

图12是显示在植入物表面上生长两天的MSC数目的曲线图。与对照样品相比，CGF包衣显著增强了MSC的粘附和增殖。纤维蛋白基质的生物相容性以及互锁因子对细胞生长的影响预计会增强MSC成骨分化。我们使用诸如荧光激活细胞扫描仪(FACS)和实时PCR等技术研究了CGF包衣对成骨基因的影响。

图13A-C示意性地示出了构造成包覆牙科植入物的装置1的另一个示例性实施方案。图13A示出了包括两个管的真空容器。将血液转移到放置牙植入物的内管中。较大的管在离心作用过程中保护内管。图13B示出了以硅帽朝下进行离心作用的组装好的真空容器。图13C示出了从其转移血液的硅帽。

图13A-C示出了真空容器，其中牙植入物被定位成使得在离心作用时发生根表面包覆。设置真空容器内适当的真空压力以抽取精确量的血液以获得最佳包覆。可以通过用硅酮和微粉化二氧化硅涂布真空容器的内腔来实现血液凝结的加速。因此，抽取到真空容器中的血液经历复杂的凝血级联，在植入物周围形成纤维蛋白的长链，最终导致均匀的网状结构。总之，真空和离心作用的参数(例如，相对离心力(rcf)、时间、速度、容器在离心机中的取向等)允许包覆过程产生400-500微米厚的纤维蛋白层，其诱捕生物活性成分如血小板和WBC，但被失去了红细胞。

为了确保程序的有效性和包覆植入物的生物活性，该包覆的植入物被设计为在包覆后立即植入，CGF包衣被进一步表征。研究了接种在CGF包覆层上的MSC的生长、增殖、迁移和分化的潜力。使用Boyden小室测定评估MSC迁移。

图14A-B示出了Boyden小室以评估CGF包覆的植入物对MSC迁移和生长速率的影响。图14A示出了CGF包覆的植入物释放的生长因子对MSC迁移的影响。图14B示出了CGF包覆的植入物释放的生长因子对MSC生长速率的影响。

将细胞置于细胞培养插入物或上部腔室中，通过多孔膜与含有CGF包覆的植入物的下部腔室分离。将细胞和植入物浸没在共用的无血清培养基中。然后允许细胞在孵育条件下经过4小时从上室迁移到插入物的下侧表面。然后机械地去除插入物上部膜表面上的细胞，并将插入物下侧表面上的迁移细胞固定，染色和计数。该技术能够评估朝向从CGF包覆的植入物释放的生长因子的MSC迁移的百分比。还可以评估并比较随着时间的推移，在上部腔室中CGF包覆的植入物存在与不存在的情况下这些因子时对下部腔室中MSC的生长速率的影响(图14B)。使用诸如FACS和实时PCR的技术确定接种在CGF包覆层上的MSC中成骨基因的表达。使用碱性磷酸酶活性测定法和细胞矿化评估体外测试接种到CGF包覆层上的MSC的成骨潜力。

带有适合CGF包覆容器的迷你和标准植入物用于概念研究验证，以证实在将CGF包覆的植入物放置在大鼠胫骨骨组织中后加速骨结合。标准尺寸的植入物也在人体中进行测试，以及用于CGF包覆的适当容器。将这些包覆的植入物放置在狗下颌骨的骨组织中，以建立人类患者的临床方案。

在存在CGF包衣的情况下表征MSC分化的体外研究之后，进行可行性研究，其中将CGF包覆的植入物移植到大鼠胫骨中以测试其在骨组织内的骨结合率。将Wistar裸鼠麻醉并在右前胫骨表面上切口。注意保护骨膜表面。使用1毫米钻头钻孔穿过一个皮层，并放置植入物。使用不可吸收的缝线将植入物周围的皮肤封闭，并控制疼痛。对两组动物进行测试和比较，即接受CGF包覆的植入物的那些动物组与接受未包覆的植入物的那些动物组进行比较。CGF包覆程序用人血进行。在不同时间点(例如，安装植入物后2周，4周，6周和10周)评估植入物骨结合。研究需要共40只老鼠。在实验结束时，将大鼠麻醉；切除安装植入物的胫骨，在福尔马林中固定，并包埋在石蜡中用于组织学分析，或用体外微CT扫描仪分析以评估骨组织形成或植入物骨结合。通过心内施用戊巴比妥钠盐处死大鼠。

在犬模型中评估CGF包覆的植入物的骨结合。两组由四只雄性比格犬组成，每只大约两岁，体重15-18千克，在拔牙之前进行放射学筛查以排除任何病理。每只狗都植入两颗下颌骨植入物，一组接受CGF包覆的植入物，另一组接受裸植入物。使用从待治疗的狗收集的自体血进行CGF植入物包覆。狗在氟烷气体麻醉下进行手术。在手术期间监测心率、体温和呼吸率。通过射线照相评估狗的咬合程序。狗的静脉血用于植入物包覆。在植入物周围的骨结合和骨组织愈合在植入后1个月、3个月、6个月进行射线照相评估。在6个月的时间点，植入物也进行组织学评估。进行组织形态学分析以确定沿植入物的骨接触长度百分比。

图15示意性地示出了装置1的另一个示例性实施方案，该装置构造成由骨材料例如骨替代物形成腻子骨。将粉末、碎片等形式的骨材料600放置在真空容器10内。容器10设置有固定的分离器40，该分离器将容器10分成两部分，即底部和上部。分离器40设置有孔，使得当容器10用全血500填充时，容器10的底部中的血液500与容器10的上部中的血液500完全接触。骨材料600位于容器10的上部，位于分离器40的顶部。在用患者血液500代替容器10中的真空之后，以类似于上述的条件对容器10进行离心作用。作为离心作用的结果，血液500被分离成：包含红血细胞和血小板的底部相510，其大部分集中在容器10的底部中，在分离器40下方，以及包含血浆的上部相520，在容器10的上部，位于分离器40上方。同样，血浆包含粘附到骨材料600上以形成准备使用的腻子骨700的骨结合促进剂。

图16根据示例性实施方案示意性地示出了构造成由骨材料形成腻子骨的分解后的装置1。示出了容器10、盖子20的示例性组件和分离器40。

图17根据示例性实施方案示意性地示出了构造成由骨材料形成腻子骨的组装后的装置1。示出了容器10、盖子20的示例性组件和分离器40。

图18示意性地示出根据示例性实施方案的用于将来自静脉的全血直接从患者的静脉抽出到构造成由骨材料形成腻子骨的装置1中的系统。系统的组件如图2中所述，并且构造成由骨材料形成腻子骨的装置1如图15中所述。

图19A-I是通过使用构造成由骨材料形成腻子骨的装置1制备的腻子骨700的SEM。

应该认识到，为了清楚起见，在单独实施方案的上下文中描述的主题的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反地，为了简洁起见，在单个实施方案的上下文中描述的主题的各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合来提供。

虽然已经结合其具体实施方案描述了主题，但显而易见的是，对于本领域技术人员而言，许多替换、修改和变化将是显而易见的。因此，旨在涵盖落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有这些替代、修改和变化。

Claims (13)

1.用血液处理人造骨植入物的装置，所述装置包括：

构造成容纳人造骨植入物并用血液填充的容器，其中所述容器包括开口；以及

构造成覆盖所述容器的所述开口的盖子。

2.根据权利要求1所述的装置，其中所述装置构造成进行离心作用。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的装置，其中所述容器和所述盖构造成构造成与周围空气压力相比保持所述容器中的负空气压力。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的装置，其中，所述盖子构造成附接到人造骨植入物，使得所述人造骨植入物由所述盖子保持。

5.根据权利要求5所述的装置，其中所述人造骨植入物是牙科植入物。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的装置，其中所述容器还包括将所述容器分隔成上部和下部的分离器，其中所述分离器包括允许所述上部中的血液与所述下部中的血液接触的孔。

7.根据权利要求6所述的装置，其中所述人造骨植入物是骨材料。

8.根据权利要求7所述的装置，其中所述分离器构造成将所述骨材料保持在所述容器的所述上部中。

9.用骨结合促进剂覆盖人造骨植入物的方法，所述方法包括：

从患者体内抽血；

将所述血液转移到用血液处理人造骨植入物的装置中，其中该装置包括构造成容纳人造骨植入物并用血液填充的容器，并且其中所述容器包括开口；以及构造成覆盖所述容器的开口的盖子，并且其中所述容器容纳所述人造骨植入物；

对所述装置进行离心作用；以及

从所述装置中移除所述植入物。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述容器和所述盖子构造成与周围空气压力相比保持所述容器中的负空气压力，并且由于所述容器中的负空气压力，所述血液被转移到所述容器中。

11.根据权利要求9所述的方法，其中在从患者抽取血液之后，对血液进行离心作用，并将经离心作用的血液中分离出的血浆转移到所述装置中，并且其中代替对所述装置进行离心作用，使血浆凝固。

12.根据权利要求11所述的方法，其中允许所述血浆以加速的方式凝对。

13.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，其中通过摇动或超声波或其任何组合加速血液或血浆的凝固。