CN108690854A

CN108690854A - 一种利用化学-酶法生产l-草铵膦的方法

Info

Publication number: CN108690854A
Application number: CN201810338960.7A
Authority: CN
Inventors: 薛亚平; 郑裕国; 曹成浩; 徐建妙; 吴哲明
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2018-04-16
Filing date: 2018-04-16
Publication date: 2018-10-23
Anticipated expiration: 2038-04-16
Also published as: CN108690854B

Abstract

本发明公开了一种利用化学‑酶法生产L‑草铵膦的方法，所述方法为：以外消旋N‑乙酰草铵膦为底物，以含羧肽酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎后提取的纯酶为催化剂，以pH值为5～10的缓冲液为反应介质，在45℃水浴摇床200rpm条件下反应，反应完全后，获得含D‑N‑乙酰草铵膦和L‑草铵膦的反应液，将反应液分离纯化，收集D‑N‑乙酰草铵膦消旋化后用于循环拆分，同时获得L‑草铵膦。本发明方法不需要辅酶循环系统及与产物结构相似的氨基供体，反应步骤简单，易于分离，光学选择性高(ee值99％)，离子交换柱分离效果明显，更易得到高纯度的L‑草铵膦(纯度为98％)。

Description

一种利用化学-酶法生产L-草铵膦的方法

(一)技术领域

本发明涉及生物化工领域，特别涉及一种化学-酶法生产L-草铵膦的方法。

(二)背景技术

草铵膦，也称草丁膦，英文名为：Phosphinothricin(简称PPT)，化学名为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸。草铵膦是一种内吸传导型除草剂，具有广谱杀草活性。除草剂用途广泛，国内外市场巨大，草铵膦为三大除草剂之一，近几年由于其作用机理和转基因技术，其市场份额有望进一步突破。

现在市场中的草铵膦主要为外消旋体。草铵膦有两种光学异构体：L-草铵膦和D-草铵膦。但只有L-草铵膦具有除草活性，是外消旋草铵膦的两倍，而且对人和动物的毒性较小，对环境影响小。但是现在大规模生产的商品化草铵膦都是外消旋混合物的形式。外消旋草铵膦的使用，浪费巨大，而且对环境影响较为严重。为了减轻环保压力，减低生产成本，探索一条具有工业化应用前景的拆分外消旋草铵膦的生产路线具有重要的市场前景和社会意义。

现在制备L-草铵膦的方法总体主要分为化学法和生物酶法。

其中化学法主要包括化学立体合成法和手性拆分法。化学立体合成法需要用到昂贵的不对称合成试剂，主要是实验室研究规模，不利于大规模制备。化学手性拆分法也要消耗大量昂贵的手性拆分试剂，工艺较复杂，收率一般较低。

与化学法相比，生物酶法具有反应条件温和，立体选择性严格等优点。制备L-草铵膦生物酶法分为酶法不对称合成和酶法拆分。酶法不对称合成理论转化率较高，主要涉及转氨酶与氨基酸脱氢酶。

Schulz A(Stereospecific production of the herbicide phosphinothricin(glufosinate)by transamination:isolation and characterization of aphosphinothricin-specific transaminase from Escherichia coli[J].Applied andEnvironmental Microbiology,1990,56(1)：1-6)等利用从大肠杆菌中克隆的转氨酶，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，L-谷氨酸为氨基供体，制备L-草铵膦。但是可逆的反应常常造成产率降低，需要加入过量的氨基供体，这给后期的产物分离带来很大的负担。

生物酶法拆分一般是通过化学合成外消旋D,L-草铵膦或其衍生物，再利用特定的酶选择性催化某一构型的反应，获得其中一个光学异构体，未反应的另一个异构体衍生物经过分离、再消旋后、再进行酶催化反应，其理论产率可达100％。

(三)发明内容

本发明目的在于提供一种全新的化学-酶法生产L-草铵膦的方法，该方法原料转化率高、生产成本低、收率高。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种化学-酶法生产草铵膦的方法，所述方法为：以外消旋N-乙酰草铵膦为底物，以含羧肽酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎后提取的纯酶为催化剂，以pH值为5～10的缓冲液(优选pH＝8.9，50mM的Tris-HCl缓冲液)为反应介质，在45℃水浴摇床200rpm条件下反应，反应完全后，获得含D-N-乙酰草铵膦和L-草铵膦的反应液，将反应液分离纯化，收集D-N-乙酰草铵膦消旋化后用于循环拆分，同时获得L-草铵膦。

进一步，所述羧肽酶来源于寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)羧肽酶Ss1。进行密码子优化，在大肠杆菌工程菌中重组表达后，具有催化L-N-乙酰-草铵膦生产L-草铵膦的能力。所述羧肽酶Ss1的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.2所示。

进一步，所述底物终浓度以缓冲液体积计为10～100mM(优选100mM)，所述催化剂以湿菌体重量计为5～50g/L缓冲液(优选10g/L)。

进一步，所述外消旋N-乙酰草铵膦按如下方法制备：以外消旋的草铵膦为原料，加入乙酸，10-60℃(优选30-40℃)保温搅拌，加入乙酸酐，反应至溶液澄清透明，在80℃、0.075～0.085MPa条件下旋蒸除去乙酸，取浓缩物用水溶解，并用氢氧化钠水溶液调至中性(pH为8.5)，加入乙醇静置析出晶体，干燥后获得外消旋N-乙酰草铵膦；所述乙酸与外消旋的草铵膦重量比20～30：1(优选20:1)，所述乙酸酐与外消旋的草铵膦重量比为0.7～1.5：1(优选1:1)。

进一步，所述催化剂按如下方法制备：(1)湿菌体：将含羧肽酶基因的工程菌接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，再以体积浓度1％接种量接种到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀至0.4-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，收集湿菌体；(2)纯酶：将步骤(1)湿菌体悬浮于20mM、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中，振荡摇匀后超声波破碎(400W，1s破碎1s暂停)15min，破碎液于12,000rpm离心10min去除细胞碎片，收集上清液；将上清液进行Ni-NTA柱层析，先用上样平衡缓冲液平衡Ni-NTA柱后，以1.5mL/min的速率上样上清液，用上样平衡缓冲液洗脱以除去未吸附的蛋白，最后用洗脱缓冲液洗脱收集目标蛋白，目标蛋白在20mM、pH 8.5的Tris-HCl中透析，取截留液即为纯酶；所述上样平衡缓冲液为含500mM NaCl和20mM咪唑的20mM Tris-HCl，pH 8.5；所述洗脱缓冲液为含500mM NaCl和500mM咪唑的20mM Tris-HCl，pH 8.5。

进一步，所述反应液分离纯化的方法为：反应完全后，将反应液离心，取上清液调节pH值至2，抽滤，取滤液上样至氢型001x7阳离子树脂，离子交换柱柱高比15:1，上样流速为1.0BV/h，上样后用超纯水冲洗4BV，收集含有未反应底物D-N-乙酰草铵膦流出液，将D-N-乙酰草铵膦消旋化后用于循环拆分；再用2mol/L氨水以0.5BV/h流速洗脱，收集含有L-草铵膦的洗脱液，减压浓缩结晶获得L-草铵膦。

进一步，所述D-N-乙酰草铵膦消旋化方法为：将含D-N-乙酰草铵膦流出液减压蒸干，加入乙酸混合，再加入乙酸酐，在100-125℃(优选120℃)搅拌消旋反应，反应结束后将反应液减压蒸干，获得外消旋N-乙酰草铵膦，用于循环拆分；所述乙酸酐与D-N-乙酰草铵膦质量比为0.1～3：1(优选1.7:1)，乙酸与D-N-乙酰草铵膦质量比为10～20：1(优选10:1)。

本发明的有益效果体现在：本发明提供了一种化学-酶法生产L-草铵膦的方法，该方法不需要辅酶循环系统及与产物结构相似的氨基供体，反应步骤简单，易于分离。该方法催化剂羧肽酶光学选择性高(ee值99％)，离子交换柱分离效果明显，更易得到高纯度的L-草铵膦(纯度为98％)。

(四)附图说明

图1为以羧肽酶为基础的化学-酶法制备L-草铵膦的反应式。

图2为实施例1中N-乙酰草铵膦的液相谱图，保留时间为9.0min。

图3为实施例1中N-乙酰草铵膦的质谱图。

图4为实施例5中L-草铵膦和D-草铵膦的液相谱图，L-草铵膦保留时间为4.6min，D-草铵膦保留时间为5.4min。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

所述超纯水是指经过超纯水仪处理，水中除了水分子(H₂O)外，几乎没有什么杂质，没有细菌、病毒、含绿二恶英等有机物和矿物微量元素。

实施例1：外消旋N-乙酰草铵膦的合成

取5g外消旋的草铵膦，放入250mL三口烧瓶中，加入100g乙酸，40℃保温搅拌，加入5g乙酸酐，反应至溶液澄清透明。旋转蒸发仪80℃，真空度0.075～0.085MPa，蒸去乙酸。浓缩物用水溶解，氢氧化钠水溶液调至中性(pH为8.5)，加入乙醇静置析出晶体，干燥后获得外消旋N-乙酰草铵膦。利用液相色谱(岛津LC-16)检测，液相谱图为图2，质谱验证确认是N-乙酰草铵膦(图3)。色谱柱为C-18column(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为10mM磷酸溶液(pH为2.1)，流速为0.75mL/min，紫外检测波长210nm，柱温35℃。

实施例2：工程菌的构建

将一株来源于寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)，注释为羧肽酶Ss1的序列，经过密码子优化后进行全基因合成，表达质粒为pET-28b。将终止密码子定点突变，使表达的重组酶尾部(C端)含pET28b中的组氨酸标签。插入序列(氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示)测序验证无误后转入表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中用于后续重组酶的表达。

实施例3：重组酶的诱导表达

实施例2构建的工程菌接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，再以1％接种量(v/v)接种到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，150rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀至0.6左右，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃诱导培养12h后，4℃，8000rpm离心10min，收集湿菌体细胞。

实施例4：酶的分离纯化

实施例3收集的湿菌体细胞悬浮于50mL Tris-HCl缓冲液(20mM，pH 8.0)中，振荡摇匀后超声波破碎(400W、15min、1s破碎1s暂停，有效时间15min)。破碎液于12,000rpm离心10min去除细胞碎片，收集上清液(粗酶液)用于后续的分离纯化。纯化柱为Ni-NTA，装柱体积为20mL，先用上样平衡缓冲液(20mM Tris-HCl，500mM NaCl和20mM咪唑，pH 8.5)平衡Ni-NTA柱，以1.5mL/min的速率上样粗酶液，用上样平衡缓冲液洗脱以除去未吸附的蛋白，最后用洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl,500mM NaCl,和500mM咪唑，pH 8.5)洗脱收集目标蛋白。酶液在20mM，pH 8.5的Tris-HCl中透析过夜(更换2次透析液)，取最后一次透析获得的截留液即为酶液。

实施例5：酶活测定

反应体系为10mL，含Tris-HCl缓冲液(20mM,pH 8.9)，加入终浓度为7.8μg/mL的实施例4制备的酶，终浓度为20g/L的实施例1制备的外消旋N-乙酰草铵膦，45℃在水浴摇床200rpm条件下反应10min测定酶活力。反应完成后，取100μL反应液加5μL HCl(4M)终止反应，后通过衍生化法分析转化率及产物ee值。色谱柱为C-18column(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇：0.05mol/L乙酸铵溶液＝10：90(v/v)流速为1mL/min，紫外检测波长215nm，柱温35℃。衍生化试剂配制：分别称取等量的衍生化试剂OPA与NAC(0.015M)混合，无水乙醇溶解，加入配制好的硼酸缓冲液(20mM pH＝9.8)定容后置于4℃保存。衍生化反应体系：200μl样品溶液(<2.0g/L)与400μl衍生化试剂(衍生化试剂过量)常温下混合，振荡6min，L-草铵膦的液相谱图如图4所示。

酶活(U)定义：在45℃，pH 8.9的条件下，每分钟生成1微摩尔L-草铵膦所需的酶量。比酶活指每毫克酶蛋白所具有的酶活，U/mg。经测定，比酶活为23.1U/mg。

实施例6：金属离子对重组酶酶活的影响

以实施例4中收集的酶为催化剂，在Co²⁺,Cu²⁺,Fe²⁺,Ba²⁺,Mn²⁺,Mg²⁺,Fe³⁺,Ni²⁺,Al²⁺,Zn²⁺和EDTA的存在下，催化底物N-乙酰草铵膦立体选择性水解生成L-草铵膦。生物催化体系组成及操作如下：10mL反应体系，体系缓冲液为Tris-HCl(pH＝8.9，50mM)，金属离子及EDTA终浓度为1mM，重组酶添加量为8.1μg/mL，底物终浓度为20g/L。45℃在水浴摇床200rpm条件下反应，采用实施例5方法测定酶活，结果如表1所示。酶活力测定表明，Co²⁺的添加对酶活提高具有显著影响，其酶活提高了1.57倍，Zn²⁺的添加对酶具有显著的抑制作用。

表1金属离子对重组酶影响

实施例7：含有重组酶的重组大肠杆菌催化生成L-草铵膦

以实施例3中收集的重组工程菌湿菌体为生物催化剂，催化底物N-乙酰草铵膦立体选择性水解生成L-草铵膦。生物催化体系组成及操作如下：称取2.5g湿菌体悬浮于250mLTris-HCl缓冲液(pH＝8.9，50mM)中，加入终浓度100mM的N-乙酰草铵膦，45℃在水浴摇床200rpm条件下反应，30min后，反应液采用实施例5方法液相检测转化率49％，ee值99％。

实施例8：L-草铵膦和D-N-乙酰草铵膦的分离

氢型001x7阳离子树脂的预处理：(1)用去离子水洗柱，流速为1.0BV/h，洗2BV；(2)用2M氢氧化钠水溶液洗柱，流速为0.5BV/h，洗2BV；(3)用去离子水洗柱，流速为1.0BV/h，洗2BV；(4)用2M盐酸水溶液洗柱，流速为0.5BV/h，洗2BV；(5)用去离子水洗柱，流速为1.0BV/h，洗2BV。

将实施例7中反应液离心去除菌体，上清液用盐酸调pH至2抽滤，滤液上样至已经预处理好的氢型001x7阳离子树脂，柱体积为120mL，离子交换柱柱高比15:1，上样流速为1.0BV/h，上样后用超纯水冲洗4BV，收集含有未反应底物D-N-乙酰草铵膦流出液。再用2mol/L氨水以0.5BV/h流速洗脱，收集含有L-草铵膦的洗脱液。将洗脱液在60℃，真空度0.075～0.085MPa下，减压浓缩结晶得到纯度为98％的L-草铵膦。

实施例9：D-N-乙酰草铵膦的化学消旋化反应

将实施例8中含有未反应底物D-N-乙酰草铵膦的流出液100ml减压浓缩至50mL，测旋光度为-0.59，再加压蒸干，获得D-N-乙酰草铵膦3g。加入30g乙酸混合，再加入5g乙酸酐，在120℃搅拌消旋12h，反应结束后，将反应液减压蒸干，获得外消旋N-乙酰草铵膦，加水溶解到50mL，测旋光度为-0.002，保存用于循环拆分。

对比例1：从酶转化液中分离提取L-草铵膦

将实施例7中反应液离心去除菌体，减压蒸干去除部分乙酸，用水溶解后，用氢氧化钠水溶液调至中性(pH为8.5)，加入乙醇静置，并降低温度至4℃，发现并无结晶析出。再加入丙酮，发现有沉淀产生，进行液相检测，发现沉淀中含有30％～50％的D-N-乙酰草铵膦和10％～20％的L-草铵膦。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种利用化学酶法生产L-草铵膦的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 457

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

Met Ala Ala Ala Leu Pro Tyr Ile Gln Leu Glu Pro Pro Ala Val Glu

1 5 10 15

Ile Ala Met Arg Arg Ser Leu Leu Leu Ser Ala Leu Leu Leu Ala Leu

20 25 30

Pro Ala Leu Ala His Ala Gln Asp Gly Gln Arg Pro Glu Val Thr Ala

35 40 45

Ala Ala Gln Arg Leu Gln Ala Lys Val Val Glu Trp Arg Arg Asp Phe

50 55 60

His Gln His Pro Glu Leu Ser Asn Arg Glu Val Arg Thr Ser Ala Glu

65 70 75 80

Val Ala Lys Arg Leu Arg Ala Met Gly Leu Lys Pro Lys Thr Gly Ile

85 90 95

Ala His His Gly Val Val Ala Ile Ile Glu Gly Gly Lys Pro Gly Pro

100 105 110

Lys Ile Ala Leu Arg Ala Asp Met Asp Ala Leu Pro Val Thr Glu Gln

115 120 125

Thr Gly Leu Pro Phe Ala Ser Arg Ala Thr Asp Gln Tyr Arg Gly Gln

130 135 140

Thr Val Gly Val Met His Ala Cys Gly His Asp Ala His Thr Ala Thr

145 150 155 160

Leu Leu Gly Val Ala Glu Ala Leu Val Ser Met Lys Lys Asp Leu Pro

165 170 175

Gly Gln Val Met Leu Ile Phe Gln Pro Ala Glu Glu Gly Ala Pro Pro

180 185 190

Pro Glu Glu Gly Gly Ala Ala Leu Met Leu Lys Glu Gly Leu Phe Ala

195 200 205

Asp Phe Lys Pro Glu Ala Val Phe Gly Met His Val Phe Ser Ser Val

210 215 220

Gln Ala Gly Gln Ile Ala Val Arg Gly Gly Pro Leu Met Ala Ala Ser

225 230 235 240

Asp Arg Phe Gly Ile Lys Val Ile Gly Arg Gln Thr His Gly Ser Ala

245 250 255

Pro Trp Asn Gly Val Asp Pro Ile Val Ala Thr Ala Asp Leu Val Gly

260 265 270

Thr Ala Gln Thr Ile Val Ser Arg Arg Ala Asn Leu Ser Lys Gln Pro

275 280 285

Ala Val Leu Thr Phe Gly Ala Ile Asn Gly Gly Ile Arg Tyr Asn Ile

290 295 300

Ile Pro Asp Glu Val Glu Met Val Gly Thr Ile Arg Thr Phe Asp Glu

305 310 315 320

Gly Met Arg Gln Gln Ile Phe Ala Asp Leu Arg Asn Val Ala Glu His

325 330 335

Thr Ala Ala Ala His Gly Ala Lys Ala Val Thr Asp Ile Tyr Glu Ser

340 345 350

Glu Gly Asn Pro Ala Thr Val Asn Asp Pro Ala Leu Thr Ala Lys Met

355 360 365

Leu Pro Ser Leu Gln Ala Val Val Gly Lys Asp Asn Val Tyr Glu Pro

370 375 380

Pro Leu Gln Met Gly Ala Glu Asp Phe Ser Leu Tyr Ala Lys Glu Val

385 390 395 400

Pro Gly Met Phe Phe Phe Val Gly Ser Thr Ser Val Gly Ile Asp Pro

405 410 415

Ala Thr Ala Pro Ala Asn His Ser Pro Lys Phe Leu Leu Asp Glu Lys

420 425 430

Ala Leu Asp Val Gly Leu Arg Ala Leu Leu Gln Val Ser Leu Asp Tyr

435 440 445

Leu His Gly Ala Gly Thr Pro Ala Gly

450 455

<210> 2

<211> 1371

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

atggctgctg ctctgccgta catccagctg gaaccgccgg ctgttgaaat cgctatgcgt 60

cgttctctgc tgctgtctgc tctgctgctg gctctgccgg ctctggctca cgctcaggac 120

ggtcagcgtc cggaagttac cgctgctgct cagcgtctgc aggctaaagt tgttgaatgg 180

cgtcgtgact tccaccagca cccggaactg tctaaccgtg aagttcgtac ctctgctgaa 240

gttgctaaac gtctgcgtgc tatgggtctg aaaccgaaaa ccggtatcgc tcaccacggt 300

gttgttgcta tcatcgaagg tggtaaaccg ggtccgaaaa tcgctctgcg tgctgacatg 360

gacgctctgc cggttaccga acagaccggt ctgccgttcg cttctcgtgc taccgaccag 420

taccgtggtc agaccgttgg tgttatgcac gcttgcggtc acgacgctca caccgctacc 480

ctgctgggtg ttgctgaagc tctggtttct atgaaaaaag acctgccggg tcaggttatg 540

ctgatcttcc agccggctga agaaggtgct ccgccgccgg aagaaggtgg tgctgctctg 600

atgctgaaag aaggtctgtt cgctgacttc aaaccggaag ctgttttcgg tatgcacgtt 660

ttctcttctg ttcaggctgg tcagatcgct gttcgtggtg gtccgctgat ggctgcttct 720

gaccgtttcg gtatcaaagt tatcggtcgt cagacccacg gttctgctcc gtggaacggt 780

gttgacccga tcgttgctac cgctgacctg gttggtaccg ctcagaccat cgtttctcgt 840

cgtgctaacc tgtctaaaca gccggctgtt ctgaccttcg gtgctatcaa cggtggtatc 900

cgttacaaca tcatcccgga cgaagttgaa atggttggta ccatccgtac cttcgacgaa 960

ggtatgcgtc agcagatctt cgctgacctg cgtaacgttg ctgaacacac cgctgctgct 1020

cacggtgcta aagctgttac cgacatctac gaatctgaag gtaacccggc taccgttaac 1080

gacccggctc tgaccgctaa aatgctgccg tctctgcagg ctgttgttgg taaagacaac 1140

gtttacgaac cgccgctgca gatgggtgct gaagacttct ctctgtacgc taaagaagtt 1200

ccgggtatgt tcttcttcgt tggttctacc tctgttggta tcgacccggc taccgctccg 1260

gctaaccact ctccgaaatt cctgctggac gaaaaagctc tggacgttgg tctgcgtgct 1320

ctgctgcagg tttctctgga ctacctgcac ggtgctggta ccccggctgg t 1371

Claims

1.一种化学-酶法生产草铵膦的方法，其特征在于所述方法为：以外消旋N-乙酰草铵膦为底物，以含羧肽酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎后提取的纯酶为催化剂，以pH值为5～10的缓冲液为反应介质，在45℃水浴摇床200rpm条件下反应，反应完全后，获得含D-N-乙酰草铵膦和L-草铵膦的反应液，将反应液分离纯化，收集D-N-乙酰草铵膦消旋化后用于循环拆分，同时获得L-草铵膦。

2.如权利要求1所述化学-酶法生产草铵膦的方法，其特征在于所述羧肽酶基因核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述化学-酶法生产草铵膦的方法，其特征在于所述底物终浓度以缓冲液体积计为10～100mM，所述催化剂用量以湿菌体重量计为5～50g/L缓冲液。

4.如权利要求1所述化学-酶法生产草铵膦的方法，其特征在于所述外消旋N-乙酰草铵膦按如下方法制备：以外消旋的草铵膦为原料，加入乙酸，10-60℃保温搅拌，加入乙酸酐，反应至溶液澄清透明，在80℃、0.075～0.085MPa条件下旋蒸除去乙酸，取浓缩物用水溶解，并用氢氧化钠水溶液调至中性，加入乙醇静置析出晶体，干燥，获得外消旋N-乙酰草铵膦；所述乙酸与外消旋的草铵膦重量比20～30：1，所述乙酸酐与外消旋的草铵膦重量比为0.7～1.5：1。

5.如权利要求1所述化学-酶法生产草铵膦的方法，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：(1)湿菌体：将含羧肽酶基因的工程菌接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，再以体积浓度1％接种量接种到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀至0.4-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，收集湿菌体；(2)纯酶：将步骤(1)湿菌体悬浮于20mM、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中，振荡摇匀后超声波破碎15min，破碎液于12,000rpm离心10min去除细胞碎片，收集上清液；将上清液进行Ni-NTA柱层析，先用上样平衡缓冲液平衡Ni-NTA柱后，以1.5mL/min的速率上样上清液，用上样平衡缓冲液洗脱以除去未吸附的蛋白，最后用洗脱缓冲液洗脱收集目标蛋白，目标蛋白在20mM、pH 8.5的Tris-HCl中透析，取截留液即为纯酶；所述上样平衡缓冲液为含500mM NaCl和20mM咪唑的20mM Tris-HCl，pH 8.5；所述洗脱缓冲液为含500mM NaCl和500mM咪唑的20mM Tris-HCl，pH 8.5。

6.如权利要求1所述化学-酶法生产草铵膦的方法，其特征在于所述反应液分离纯化的方法为：反应完全后，将反应液离心，取上清液调节pH值至2，抽滤，取滤液上样至氢型001x7阳离子树脂，离子交换柱柱高比15:1，上样流速为1.0BV/h，上样后用超纯水冲洗4BV，收集含有未反应底物D-N-乙酰草铵膦流出液，将D-N-乙酰草铵膦消旋化后用于循环拆分；再用2mol/L氨水以0.5BV/h流速洗脱，收集含有L-草铵膦的洗脱液，将洗脱液在60℃，真空度0.075～0.085MPa下，减压浓缩，结晶得到L-草铵膦。

7.如权利要求6所述化学-酶法生产草铵膦的方法，其特征在于所述D-N-乙酰草铵膦消旋化方法为：将含D-N-乙酰草铵膦流出液减压蒸干，加入乙酸混合，再加入乙酸酐，在100-125℃搅拌消旋反应，反应结束后将反应液减压蒸干，获得外消旋N-乙酰草铵膦，用于循环拆分；所述乙酸酐与D-N-乙酰草铵膦质量比为0.1～3：1，乙酸与D-N-乙酰草铵膦质量比为10～20：1。