CN108690808B - 一种瓜类白粉病菌的保存与繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种瓜类白粉病菌的保存与繁殖方法。该方法包括如下步骤：1)无菌条件下，将瓜类白粉病菌进行纯化，至出现新菌落；2)将新菌落侵染拟南芥植株，培养；3)更换新的拟南芥植株，培养，重复此步骤，实现瓜类白粉病菌的保存与繁殖。该方法可保障瓜类白粉菌的长期供应，为瓜类白粉病的相关研究提供极大便利，且拟南芥植株植株易于种植及培养，种子成本和种植培养成本低，且占用空间小，因而解决了长期保存和繁殖过程繁琐，种植和维护成本高、占用空间大的问题，另外，该方法简单易行，经济、便捷、适用性广。
Description
技术领域
本发明涉及植物病理技术领域，尤其涉及一种瓜类白粉病菌的保存与繁殖方法。
背景技术
瓜类白粉病是一种广泛发生的世界性病害，其主要侵染黄瓜、苦瓜、南瓜、西瓜、甜瓜、冬瓜、节瓜和蒲瓜等瓜类植株的叶片，在植株的幼苗期和成株期均可发病；若在适宜的条件下，瓜类白粉病迅速发展，几天或一周之内蔓延至整片植株，造成叶片发黄、失去功能、渐渐枯死，严重影响瓜类作物的产量及品质。
瓜类白粉病菌主要分为单囊壳白粉病菌属(Podosphaeraxanthii，原名为S.fuliginea)和二孢白粉菌属(Golorinomycescichoracearum，原名为E.cichoracearum)，其是一种专性寄生菌，只能寄生于活体寄主植物上，不能在人工培养基中培养，因此，难以在离体的条件下进行纯化和长期保存。
目前，涉及到瓜类白粉病菌的保存方法有低温离体保存、离体叶片保湿保存及活体保存。低温离体保存(液氮内或-80℃冰箱保存)需要使用液氮或超低温冰箱，资源耗费很大，且随着保存时间的延长，白粉病菌孢子萌发率低，从而失去致病力；离体叶片保湿保存虽然能进行有效地保存，但其需要光照培养且需要频繁更换叶片，工作量巨大，不利于长期保存；而活体保存通常是在室温或者光照培养箱中将白粉病菌接种到本体或其他瓜类感病品系上进行保存和繁殖。但由于瓜类作物的种子成本较高，且较难萌发，通常需要浸泡和催芽处理；另外，瓜类作物的育苗和种植维护需要花费大量的时间和精力，且植株个体大，占用空间大，种植成本高，因而，在实际操作中人们还是依赖于田间自然发病的瓜类植株提供白粉病菌，然而这种方法受环境和气候的影响很大，严重影响和制约了对瓜类白粉病抗性鉴评、白粉病抗性基因定位克隆、白粉病菌生物学和杀菌剂研制等相关研究工作的开展。
因此提供一种简单高效的瓜类白粉病菌的保存和繁殖方法，对于白粉病菌的研究及其防治具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种瓜类白粉病菌的保存与繁殖方法。该方法能有效对瓜类白粉病菌进行保存与繁殖，且该方法实用便捷、操作简单、成本低廉。
本发明所采取的技术方案是：
一种瓜类白粉病菌的保存与繁殖方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)无菌条件下，将瓜类白粉病菌进行纯化，至出现新菌落；
2)将新菌落侵染拟南芥植株，培养；
3)更换新的拟南芥植株，培养，重复此步骤，实现瓜类白粉病菌的保存与繁殖。
优选地，步骤1)在光暗交替保湿条件下进行纯化，所述光暗交替条件为23～28℃光照8～16h，20～25℃黑暗环境16～8h。
优选地，光暗交替条件为25℃光照12h，23℃黑暗环境12h。
优选地，保湿条件为保持相对湿度为65～85％。
优选地，保湿条件为保持相对湿度为75％。
优选地，上述拟南芥植株为2周龄以上的植株。
优选地，拟南芥植株为2～6周龄的植株。
更优选地，拟南芥植株为3～4周龄的植株
拟南芥易于种植和培养，有利于降低其种植及培养成本，植株远小于瓜苗，可以大大减少占地面积，同时，拟南芥植株易感瓜类白粉病菌，为瓜类白粉病菌的保存与繁殖提供了前提条件，另外，拟南芥植株在叶片长满瓜类白粉病菌后仍能继续生长，衰老缓慢，更适合对白粉病菌进行保存和繁殖。
优选地，步骤2)将新菌落侵染拟南芥植株的部分叶片，目的在于适当降低白粉菌生长对拟南芥植株生长发育的不利影响，进一步延长每一批拟南芥植株保存白粉菌的时间，使部分叶片维持白粉菌的生长和繁殖。
优选地，部分叶片例如可以是2/3的植株叶片、1/3的植株叶片、1/2的植株叶片、3/4的植株叶片、2/5的植株叶片、3/5的植株叶片。
优选地，拟南芥植株由下述步骤培养得到：
a)将拟南芥种子播种；
b)在光暗交替条件下培养，得拟南芥植株。
优选地，步骤a)中的拟南芥种子为3～5℃保存的种子。
更优选地，步骤a)中的拟南芥种子为4℃保存的种子。
优选地，步骤b)中的光暗交替条件为：光照6～12h，黑暗环境18～12h，更优选为光
照9h，黑暗环境15h。
优选地，步骤b)中培养的温度为18～25℃，更优选为20～22℃。
优选地，步骤b)中培养的光照强度为200～500μmol/(m2·s)，更优选为300～400μmol/
(m2·s)。
优选地，步骤b)中培养的相对湿度保持为60～85％，更优选为75％。
优选地，步骤b)中的培养过程中还包括每1～3周浇1次水，更优选为每2周浇1次水。
优选地，步骤2)中被侵染后的拟南芥植株在自然光照下光暗交替培养。
优选地，光暗交替条件为18～25℃光照6～12h，18～25℃黑暗条件18～12h。
优选地，光暗交替条件为20～23℃光照6～10h，20～23℃黑暗条件18～14h。
更优选地，光暗交替条件为22℃光照8h，20℃黑暗条件16h。
优选地，步骤2)中的培养过程中还包括每1～3周浇1次水，更优选为每2周浇1次水。
优选地，步骤3)更换新的拟南芥植株的时期为：被瓜类白粉病菌侵染4～8周后更换新的拟南芥植株。
更优选地，步骤3)更换新的拟南芥植株的时期为：被瓜类白粉病菌侵染5～6周后更换新的拟南芥植株。
优选地，步骤3)中的培养条件同步骤2)中的培养条件。
优选地，步骤3)还包括将步骤2)保存繁殖的白粉病菌侵染新的拟南芥植株的操作。
通过上述保存方法，发明人将瓜类白粉病菌保存至今已达2年之久，未发现任何问题，通过该保存方法有可能实现永久保存，且该保存方法非常便捷。
本发明的有益效果是：
1、该方法可依据需要实现瓜类白粉病菌任意期限的保存与繁殖。
2、本发明利用拟南芥植株易感瓜类白粉病菌，将纯化后的瓜类白粉病菌在拟南芥植株中进行保存和繁殖，打破了环境和季节对瓜类白粉病发病的制约，解决了当前瓜类白粉病菌保存时间短的问题，可保障瓜类白粉菌的长期供应，将为瓜类白粉病抗性鉴评、瓜类白粉病抗性基因定位克隆、瓜类白粉病菌生物学和杀菌剂研制等提供极大便利。
3、拟南芥植株易于种植及培养，种子成本和种植培养成本低，且占用空间小，因而解决了长期保存和繁殖过程繁琐，种植和维护成本高、占用空间大的问题。
4、该方法简单易行，经济、便捷、适用性广。
附图说明
图1为黄瓜白粉病菌(A)和苦瓜白粉病菌(B)在拟南芥植株上的生长情况图；
图2为黄瓜白粉病菌和苦瓜白粉病菌在拟南芥植株生长发育后期抽薹开花前(A)和结果荚时期(B)的生长情况图；
图3为用拟南芥植株上繁殖保存的黄瓜白粉病菌和苦瓜白粉病菌分别侵染黄瓜植株(A)和苦瓜植株(B)图。
具体实施方式
下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明阐述的原理做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适范围内的选择，而并非要限定于下文示例的具体数据。
一种瓜类白粉病菌的保存与繁殖方法，包括以下步骤：
1)黄瓜、苦瓜白粉病菌的采集与纯化：
从田间采集含有新鲜的白粉病菌有性世代闭囊壳的黄瓜、苦瓜叶，在解剖镜下挑出单个孢子或单条孢子梗，无菌条件下接种到黄瓜、苦瓜无菌苗的离体叶片上，密封置于25℃/12h，23℃/12h的光暗交替保湿条件下进行纯化，直至产生肉眼可见的新菌落。
2)纯化的黄瓜、苦瓜白粉病菌侵染拟南芥植株：
用毛笔将白粉病分离纯化的分生孢子侵染3～4周龄的拟南芥植株的2/3叶片，在自然光照培养箱内22℃光照8h，20℃黑暗条件16h的光暗条件下交替培养5～6周。
3)黄瓜、苦瓜白粉病菌的保存与繁殖：
取步骤2)中的新鲜的白粉病菌继续侵染下一批新的3～4周龄拟南芥植株的部分叶片，重复步骤2的培养条件，如此往复，从而实现白粉病菌的保存与繁殖。
拟南芥植株的种植：
将4℃保存的拟南芥植株的种子播种于体积比为1:3的营养土/蛭石中，1～3粒/小盆或密播于单个小盆(5cm x 5cm x 5cm规格)，于培养箱中光照培养，培养箱温度为21±2℃，生长的光/暗周期为9h/15h，光照强度为300～400μmol/(m2·s)，相对湿度为75％左右，每2周浇水1次，1～2周后移栽。
黄瓜白粉病菌和苦瓜白粉病菌在拟南芥植株上的生长情况见图1。
由图1可知：在拟南植株的叶片上分布大量的白色粉状霉层(即：白粉病菌)，且生长良好，这说明黄瓜白粉病菌和苦瓜白粉病菌能成功侵染拟南芥植株并在拟南芥植株中繁殖。
黄瓜白粉病菌和苦瓜白粉病菌在拟南芥植株生长发育后期抽薹开花前和结果荚时期的生长情况见图2。
由图2可知：在拟南芥植株生长发育后期抽薹开花前和结果荚时期，其叶片上依然分布有大量的白粉病菌，这说明感染白粉病菌后依然能生长到植株本身生命周期的后期，同时也说明了当拟南芥植株上长满白粉病菌后其依然能够继续生长，即：在拟南芥植株中的保存期长，这为白粉病菌的保存提供了有利的条件，也避免了频繁更换新植株造成的各种成本输出，同时，拟南芥植株干枯前的叶片上的白粉菌依然能够侵染2～6周龄的拟南芥植株，这为将白粉菌转接至下一批拟南芥进行继代培养提供了充分的自由时间。
拟南芥植株上保存的黄瓜、苦瓜白粉病菌对黄瓜、苦瓜植株叶片的侵染检验
抖落拟南芥植株叶片上新鲜的白粉病菌孢子于50毫升离心管内，加适量Tween-20(浓度为0.05％)，搅拌均匀制成孢子悬浮液；
用小型喷雾器把孢子悬浮液均匀喷雾侵染感病的黄瓜(真叶期)、苦瓜叶片(2叶期)表面，黑暗保湿24h后用专门的培养箱进行隔离培养，温度控制在白天不超过30℃，夜间不低于20℃，相对湿度控制在75％以上，结果见图3。
由图3可知：拟南芥植株上保存的黄瓜、苦瓜白粉病菌分别侵染黄瓜和苦瓜植株叶片1周后，在黄瓜和苦瓜叶片上均能明显观察到白色的斑点，且大面积存在，同时已有部分苦瓜叶片开始变黄，这说明在拟南芥植株中保存的白粉病菌能在其各自的本体植株上正常侵染和繁殖，即：在拟南芥植株上保存的白粉病菌有较强的生命力。
Claims (3)
1.一种瓜类白粉病菌的保存与繁殖方法，其特征在于：由如下步骤组成：
1）无菌条件下，将瓜类白粉病菌进行纯化，至出现新菌落；
2）将新菌落侵染拟南芥植株，培养；
3）更换新的拟南芥植株，重复步骤2）的培养条件，如此往复，实现瓜类白粉病菌的保存与繁殖；
其中，所述瓜类白粉病菌选自黄瓜白粉病菌或苦瓜白粉病菌；步骤1）在光暗交替保湿条件下进行纯化，所述光暗交替条件为23～28 ℃光照8～16 h，20～25 ℃黑暗环境16～8h；所述保湿条件为保持相对湿度为65～85%；所述拟南芥植株为2～6周龄的植株；步骤2）将新菌落侵染拟南芥植株的部分叶片；步骤2）中被侵染后的拟南芥植株在自然光照下光暗交替培养；所述步骤2）的光暗交替条件为18～25 ℃光照6～12 h，18～25 ℃黑暗环境18～12h。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）的光暗交替条件为25 ℃光照12 h，23 ℃黑暗环境12 h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3）中更换新的拟南芥植株的时期为：被瓜类白粉病菌侵染4～8周后更换新的拟南芥植株。
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