CN108690723A - 一种芭乐香料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种芭乐香料的制备方法，包括如下步骤：1)芭乐浆液的制备；2)复合微生物分解；3)复合微生物产香；4)除菌保质。本发明以芭乐为原料，首先将纤维素和果胶降解为小分子酸类物质，再通过微生物发酵技术增加小分子酯类、酸类成分，解决传统芭乐提取物存在纤维素和果胶含量较高的问题，同时引入新的小分子成分，开发出一种新型的芭乐香料，芭乐利用率高，生产过程环保，且制得的自然香料安全可靠。

Description

一种芭乐香料的制备方法
技术领域
本发明属于烟草添加剂技术领域，具体涉及一种芭乐香料的制备方法。
背景技术
随着烟草行业的更新发展和人们健康意识的逐渐提高，烟草香料在弥补卷烟因焦油含量降低而导致的香气成分不足的问题上发挥着重要的作用。烟草香料按照来源，分为天然香料和人工合成的香料。合成香料是非天然性的，香气单一，受合成方法及条件的制约；天然香料虽然绿色、健康更受欢迎，但因为主要来源于动物和植物，资源有限，提取成本高，远远满足不了日益增长的市场需求。
目前，在烟草香精香料的生物合成中应用最广泛是微生物发酵工程。微生物在发酵过程中由于产生一系列酶类物质，在酶促作用、化学作用及微生物体内复杂代谢的协同作用下,便可使底物发生分解、降解、氧化、还原、聚合、偶联、转化等作用,形成复杂的低分子化合物,其中包括各种香味化合物,如醇类、醛类、酮类、酸类、酯类、酚类、呋喃类、吡嗪类、吡啶类和萜烯类等。这些香气物质也就成为了烟草的香气组分。利用微生物发酵工程制备天然香料，生产成本低，具有较高的社会效益和经济效益。
芭乐又名番石榴，俗称拔番石榴子、那拔。原产美洲热带地区，传入我国已有300多年的历史，在我国主要栽培在广东、海南、广西等一些热带、亚热带地区。芭乐果皮薄，黄绿色，果肉厚，清甜脆爽，心小籽少，果实营养丰富，含较高的维生素A、C、纤维质及磷、钾、钙、镁等微量元素，还富含蛋白质和脂质。因果实风味独特而深受广大消费者喜爱。果实香气是其果实重要的品质性状之一。
传统工艺制备芭乐提取物，一般将纤维素和果胶除去不用，将果汁从瓜果中提取出来，浓缩制备成果汁提取物，再使用水等溶剂提取制备的果类提取物。这种方法得到的香料香气不够丰富，芭乐的利用率不高，实际操作效率不高。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种芭乐利用率更高的芭乐香料的制备方法，该制备方法得到的芭乐香料具有浓郁的芭乐酒果香，并带有宜人的甜醇香气。
本发明采用的技术方案是：一种芭乐香料的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)芭乐浆液的制备：
a.取芭乐，清洗破碎，再打浆处理，制成浆液；
b.将所制备的芭乐浆液灭菌备用；
(2)复合微生物分解：
a.将纤维素分解菌制剂与果胶分解菌制剂配成复合分解菌，再与无菌水混合配成复合分解菌生物制剂溶液；
b.将上述复合分解菌生物制剂溶液接种于步骤(1)灭菌后的芭乐浆液中，进行发酵，得到发酵液；
c.将上述得到的发酵液离心处理，取上清液，得到芭乐微生物分解液；
(3)复合微生物产香：
a.向步骤(2)得到的芭乐微生物分解液中添加葡萄糖混合均匀后，灭菌备用；
b.将酿酒酵母和产香酵母配成复合产香菌，再与无菌水混合配成复合产香菌生物制剂溶液；
c.将上述步骤中制备的复合产香菌生物制剂溶液接种于上述加糖灭菌后的芭乐微生物分解液中，进行发酵，得到发酵液；
d.将上述得到的发酵液离心处理，取上清液，得到芭乐微生物产香液；
(4)除菌保质：
a.将步骤(3)获得的芭乐微生物产香液过滤，除杂除菌；
b.在除菌后芭乐微生物产香液中添加丙二醇，得到本发明制备的芭乐香料。
具体的，步骤(1)中，芭乐碎成2～4cm*2～4cm的小块；灭菌条件为100～115℃，15～30min。
具体的，步骤(2)中，复合分解菌配方中纤维素分解菌制剂为节杆菌，果胶分解菌制剂为毛霉菌。
再具体的，步骤(2)中，节杆菌和毛霉菌的质量比为1:90～1:100；复合分解菌生物制剂溶液中复合分解菌和无菌水的质量比为1:90～1:100。
具体的，步骤(2)中，复合分解菌生物制剂溶液在芭乐浆液中的接种量为0.005～0.05％；发酵的条件为：pH值为5～8、搅拌转速为50～200rpm、通气量为0.2～1vvm、发酵温度为20～45℃、发酵时间为5～12d。
具体的，步骤(2)和步骤(3)中，离心条件为2000～9000rpm，10～30min。
具体的，步骤(3)中，葡萄糖的重量占比为芭乐微生物分解液的0.1～5％。
具体的，步骤(3)中，复合产香菌中酿酒酵母和产香酵母的质量比为1:1.5～1:3；复合产香菌生物制剂溶液中复合产香菌和无菌水的质量比为1:90～1:100。
具体的，步骤(3)中，复合产香菌生物制剂溶液在芭乐浆液中的接种量为5～20％；发酵的条件为：pH值为2.5～5.5、搅拌转速为50～200rpm、通气量为0.2～1vvm、前发酵温度为30～45℃、前发酵时间为1～5d、后发酵温度为15℃～25℃，后发酵时间为1d～7d。
本发明的有益效果在于：以芭乐为原料，通过微生物发酵技术首先采用复合分解菌降解纤维素和果胶、再采用复合产香菌发酵产香，得到一种烟用芭乐提取物，该方法具有以下优点：
1、充分应用了芭乐的成分。传统芭乐提取物将纤维素和果胶除去不用，而本发明将纤维素和果胶降解为小分子的酸类物质，然后进一步得到利用。
2、应用微生物发酵技术生产的烟用芭乐提取物，增加了小分子酯类、酸类等香气成分，开发出传统工艺所不能制备的新型香料。
3、芭乐提取物经本发明处理后，降低了纤维素和果胶含量，使得香料过滤方便，滤液澄清，解决了传统芭乐提取物存在的问题，是一种经济、高效且可定向生产天然烟用香料的制备方法。
附图说明
图1是本发明的工艺流程图。
具体实施方式
如图1所示的工艺流程图是对本发明的实施例给予进一步的说明，但并不限制本发明。
实施例1
(1)芭乐浆液的制备：
a.取1kg的新鲜芭乐，加入5倍体积的清水清洗两次。将清洗后的芭乐破碎成2cm*4cm的小块，利用榨汁机将芭乐打浆处理，收集浆液，得到芭乐浆液；
b.将所制备的芭乐浆液在100℃下灭菌30min，备用；
(2)复合微生物分解：
a.将节杆菌与毛霉菌按照质量比为1:90配成复合分解菌，得到的复合分解菌再与无菌水按照质量比为1:90配成复合分解菌生物制剂溶液；
b.在无菌条件下，将上述步骤中制备的复合分解菌生物制剂溶液以0.005％的接种量接种于步骤(1)灭菌后的芭乐浆液中；得到接种产物在pH值为5、搅拌转速为100rpm、通气量为1vvm、发酵温度为30℃、发酵时间为7d的条件下发酵，得到发酵液；
c.将微生物分解处理后的发酵液经高速离心处理，转速5000rpm，20min，取上清液，得到芭乐微生物分解液。
(3)复合微生物产香：
a.向步骤(2)中的芭乐微生物分解液添加其重量2％的葡萄糖，混合均匀后，在115℃下灭菌30min，备用；
b.将酿酒酵母和产香酵母按照质量比为1:2配成复合产香菌，得到的复合产香菌再与无菌水按照质量比为1:90配成复合产香菌生物制剂溶液；
c.在无菌条件下，将上述制备的复合产香菌生物制剂溶液以10％的接种量接种于上述加糖灭菌后的芭乐微生物分解液中，得到接种产物在pH值为4.5、搅拌转速为100rpm、通气量为0.8vvm、前发酵温度为40℃、前发酵时间为3d、后发酵温度为15℃，后发酵时间为7d的条件下发酵，得到发酵液；
d.将微生物分解处理后的发酵液经高速离心处理，转速2000rpm，30min，取上清液，得到芭乐微生物产香液。
(4)除菌保质：
a.将步骤(3)获得的芭乐微生物产香液于0.8μm微孔滤膜下过滤，除杂。取澄清液，于0.2μm微孔滤膜下过滤，除菌；
b.为防止变质，向除菌后芭乐微生物产香液中添加5％的丙二醇，即得到本发明制备的芭乐香料。
实施例2
(1)芭乐浆液的制备：
a.取1kg的新鲜芭乐，加入5倍体积的清水清洗两次。将清洗后的芭乐破碎成4cm*4cm的小块，利用榨汁机将芭乐打浆处理，收集浆液，得到芭乐浆液；
b.将所制备的芭乐浆液在115℃下灭菌15min，备用；
(2)复合微生物分解：
a.将节杆菌与毛霉菌按照质量比为1:100配成复合分解菌，得到的复合分解菌再与无菌水按照质量比为1:110配成复合分解菌生物制剂溶液；
b.在无菌条件下，将上述步骤中制备的复合分解菌生物制剂溶液以0.05％的接种量接种于步骤(1)灭菌后的芭乐浆液中；得到接种产物在pH值为6、搅拌转速为200rpm、通气量为0.2vvm、发酵温度为35℃、发酵时间为5d的条件下发酵，得到发酵液；
c.将微生物分解处理后的发酵液经高速离心处理，转速5000rpm，30min，取上清液，得到芭乐微生物分解液。
(3)复合微生物产香：
a.向步骤(2)中的芭乐微生物分解液添加其重量5％的葡萄糖，混合均匀后，在115℃下灭菌15min，备用；
b.将酿酒酵母和产香酵母按照质量比为1:1.5配成复合产香菌，得到的复合产香菌再与无菌水按照质量比为1:110配成复合产香菌生物制剂溶液；
c.在无菌条件下，将上述制备的复合产香菌生物制剂溶液以20％的接种量接种于上述加糖灭菌后的芭乐微生物分解液中，得到接种产物在pH值为2.5、搅拌转速为50rpm、通气量为0.2vvm、前发酵温度为30℃、前发酵时间为5d、后发酵温度为25℃，后发酵时间为1d的条件下发酵，得到发酵液；
d.将微生物分解处理后的发酵液经高速离心处理，转速9000rpm，10min，取上清液，得到芭乐微生物产香液。
(4)除菌保质：
a.将步骤(3)获得的芭乐微生物产香液于0.8μm微孔滤膜下过滤，除杂。取澄清液，于0.2μm微孔滤膜下过滤，除菌；
b.为防止变质，向除菌后芭乐微生物产香液中添加10％的丙二醇，即得到本发明制备的芭乐香料。
实施例3
(1)芭乐浆液的制备：
a.取1kg的新鲜芭乐，加入5倍体积的清水清洗两次。将清洗后的芭乐破碎成2cm*2cm的小块，利用榨汁机将芭乐打浆处理，收集浆液，得到芭乐浆液；
b.将所制备的芭乐浆液在110℃下灭菌20min，备用；
(2)复合微生物分解：
a.将节杆菌与毛霉菌按照质量比为1:95配成复合分解菌，得到的复合分解菌再与无菌水按照质量比为1:100配成复合分解菌生物制剂溶液；
b.在无菌条件下，将上述步骤中制备的复合分解菌生物制剂溶液以0.01％的接种量接种于步骤(1)灭菌后的芭乐浆液中；得到接种产物在pH值为8、搅拌转速为50rpm、通气量为1vvm、发酵温度为20℃、发酵时间为12d的条件下发酵，得到发酵液；
c.将微生物分解处理后的发酵液经高速离心处理，转速2000rpm，30min，取上清液，得到芭乐微生物分解液。
(3)复合微生物产香：
a.向步骤(2)中的芭乐微生物分解液添加其重量0.1％的葡萄糖，混合均匀后，在100℃下灭菌30min，备用；
b.将酿酒酵母和产香酵母按照质量比为1:2配成复合产香菌，得到的复合产香菌再与无菌水按照质量比为1:100配成复合产香菌生物制剂溶液；
c.在无菌条件下，将上述制备的复合产香菌生物制剂溶液以5％的接种量接种于上述加糖灭菌后的芭乐微生物分解液中，得到接种产物在pH值为3.5、搅拌转速为100rpm、通气量为0.5vvm、前发酵温度为35℃、前发酵时间为4d、后发酵温度为20℃，后发酵时间为3d的条件下发酵，得到发酵液；
d.将微生物分解处理后的发酵液经高速离心处理，转速7000rpm，20min，取上清液，得到芭乐微生物产香液。
(4)除菌保质：
a.将步骤(3)获得的芭乐微生物产香液于0.8μm微孔滤膜下过滤，除杂。取澄清液，于0.2μm微孔滤膜下过滤，除菌；
b.为防止变质，向除菌后芭乐微生物产香液中添加2％的丙二醇，即得到本发明制备的芭乐香料。
实施例4
(1)芭乐浆液的制备：
a.取1kg的新鲜芭乐，加入5倍体积的清水清洗两次。将清洗后的芭乐破碎成2cm*4cm的小块，利用榨汁机将芭乐打浆处理，收集浆液，得到芭乐浆液；
b.将所制备的芭乐浆液在110℃下灭菌25min，备用；
(2)复合微生物分解：
a.将节杆菌与毛霉菌按照质量比为1:100配成复合分解菌，得到的复合分解菌再与无菌水按照质量比为1:100配成复合分解菌生物制剂溶液；
b.在无菌条件下，将上述步骤中制备的复合分解菌生物制剂溶液以0.02％的接种量接种于步骤(1)灭菌后的芭乐浆液中；得到接种产物在pH值为7、搅拌转速为100rpm、通气量为0.5vvm、发酵温度为45℃、发酵时间为6d的条件下发酵，得到发酵液；
c.将微生物分解处理后的发酵液经高速离心处理，转速9000rpm，10min，取上清液，得到芭乐微生物分解液。
(3)复合微生物产香：
a.向步骤(2)中的芭乐微生物分解液添加其重量0.5％的葡萄糖，混合均匀后，在115℃下灭菌20min，备用；
b.将酿酒酵母和产香酵母按照质量比为1:3配成复合产香菌，得到的复合产香菌再与无菌水按照质量比为1:110配成复合产香菌生物制剂溶液；
c.在无菌条件下，将上述制备的复合产香菌生物制剂溶液以15％的接种量接种于上述加糖灭菌后的芭乐微生物分解液中，得到接种产物在pH值为5.5、搅拌转速为200rpm、通气量为1vvm、前发酵温度为45℃、前发酵时间为2d、后发酵温度为20℃，后发酵时间为5d的条件下发酵，得到发酵液；
d.将微生物分解处理后的发酵液经高速离心处理，转速4000rpm，25min，取上清液，得到芭乐微生物产香液。
(4)除菌保质：
a.将步骤(3)获得的芭乐微生物产香液于0.8μm微孔滤膜下过滤，除杂。取澄清液，于0.2μm微孔滤膜下过滤，除菌；
b.为防止变质，向除菌后芭乐微生物产香液中添加7％的丙二醇，即得到本发明制备的芭乐香料。
以实施例1所制备的芭乐香料为例，进行应用研究的说明。
1、芭乐香料的物理指标检测：
按上述工艺开发的芭乐香料的物理指标如下：
表1本发明制备的芭乐香料的物理指标
名称 芭乐香料
外观 澄清棕褐色液体
香气 酒香、果香
相对密度(20/20℃) 0.9815
折光指数(20℃) 1.3528
乙醇中混溶度(25℃) 1体积该提取物可溶于1-20体积水溶液
铅含量(mg/kg) ≤5.0
砷含量(mg/kg) ≤1.0
2、芭乐香料果胶含量对比
将压榨的芭乐汁、传统工艺制备的芭乐香料和本发明方法制备的芭乐香料按照中华人民共和国农牧渔业部部标准(NY 82.11—1988)检测其中果胶含量，具体步骤如下：
(1)溶液的配制：
①称取2g氢氧化钠，溶解于水中，稀释至50ml，得到1M氢氧化钠溶液。
②准确称取半乳糖醛酸100mg，溶解于水中，加入0.5ml1M氢氧化钠溶液，并定容至100ml，混匀。得到1mg/ml的半乳糖醛酸原液。
③称取0.1g咔唑，溶于无水乙醇后，稀释至100ml。得到0.1％咔唑乙醇溶液。
(2)标准曲线的测定：
移取上述半乳糖醛酸原液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0ml，分别注入100ml容量瓶中，稀释至刻度，即得一组浓度为10、20、30、40、50、60、70μg/ml的半乳糖醛酸标准溶液。
取大试管(25×200mm)，吸移入1ml上述配制的一组半乳糖醛酸标准溶液，加入0.5ml 0.1％咔唑乙醇溶液，不断摇动试管，再加入6ml浓硫酸。立刻将试管放入85℃水浴里5min，再使之冷却15min。然后立刻用分光光度计在525nm波长处，用2cm比色皿测量吸光值。空白为1mL H2O加0.5mL 0.1％咔唑乙醇溶液和6ml浓硫酸。
以测得的吸光值为纵坐标，每毫升标准溶液中的半乳糖醛酸的含量为横坐标，作图，即得到一条标准曲线。
(3)果胶的测定：
①果胶的沉淀
将15ml芭乐香料置于50ml刻度离心管中，加入95％热(75℃)乙醇溶液25ml，在85℃水浴中加热10min，充分搅拌。再加95％乙醇使总体接近50ml，离心15min，弃去上清液。在85℃水浴上再用63％乙醇洗涤沉淀。离心分离，弃去上清液。
②果胶总量提取液的制备
将按照上述方法制备出的果胶沉淀，全部洗入100ml容量瓶中。加入5ml 1M氢氧化钠溶液，用水稀释至刻度，混匀。至少放置15min，并不时摇荡。过滤后，滤液用于比色测定。
③取大试管(25×200mm)，吸移入1ml待测样品滤液，加入0.5ml 0.1％咔唑乙醇溶液，并产生白色絮状沉淀，不断摇动试管，再加入6ml浓硫酸。立刻将试管放入85℃水浴里5min，再使之冷却15min。然后立刻用分光光度计在525nm波长处，用2cm比色皿测量吸光值。空白为1ml H2O加0.5ml 0.1％咔唑乙醇溶液和6ml浓硫酸。
由上述标准曲线，根据测出的待测样品的光吸收值，即可查出待测样品的果胶含量。
芭乐香料果胶含量对比结果列于下表，从表中看出，本发明方法相比压榨的芭乐汁降低了149.59μg/L，相比传统工艺制备的芭乐香料降低了108.11μg/L。
表2芭乐香料果胶含量对比结果
3、芭乐香料透光率的对比
将压榨的芭乐汁、传统工艺制备的芭乐香料和本发明方法制备的新型芭乐香料进行透光率的检测。取不同处理后的芭乐香料，以蒸馏水为对照，在650nm下测定透光率。对比结果列于下表。由表中数据可知，透光率越高，澄清度越好越清澈，保存期间越不易沉降；透光率越低，澄清度越差越浑浊，保存期间越易沉降。
表3芭乐香料透光率的对比
4、本发明制备的新型芭乐香料的香气成分分析
(1)前处理
将400ml本发明制备的新型芭乐香料装入圆底烧瓶中，用电热套进行加热至沸腾，另一侧的圆底烧瓶中加入200ml的二氯甲烷，60℃水浴沸腾，待中间分液管处液面出现分层后计时萃取2h。萃取结束后，向二氯甲烷萃取液中加入无水硫酸钠吸水，放置过夜，过滤并浓缩至1ml，浓缩液用于进行GC-MS分析。
(2)气质分析条件
GC/MS条件色谱柱：HP-5MS(50m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱；进样温度：250℃；不分流进样；载气：He，1ml/min；升温程序：从50℃(1min)以5℃/min升到250℃(5min)；传输线温度：250℃；离子源：EI源；电子能量：70eV；扫描范围：50～650amu；使用WILEY和MINILAB谱库进行检索。
表4本发明制备的芭乐香料成分分析
通过GC/MS对新型芭乐香料进行香气成分分析，从表4中可以看出，一共鉴定出33种香气成分，其中酯类13种，酸类4种，醇类2种，以及烷烃、醛类、咖啡因等14香气物质。含量最高的还是苯乙醇，含量占22.70％。芭乐香料中的苯乙醇、苯乙醛及其酯类是形成芭乐香料特征性风味的关键致香成分。苯乙醇具有新鲜面包香、清甜的玫瑰样花香；苯乙醛有似风信子、紫丁香样的香气，有玫瑰坚果底蕴，香气强烈，留香非常持久；丁二酸二乙酯具有淡而舒适的葡萄香气；亚油酸乙酯具有特殊的花果香气等等。

Claims (9)

1.一种芭乐香料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)芭乐浆液的制备：
a.取芭乐，清洗破碎，再打浆处理，制成浆液；
b.将上述制成的浆液灭菌备用；
(2)复合微生物分解：
a.将纤维素分解菌制剂与果胶分解菌制剂配成复合分解菌，再与无菌水混合配成复合分解菌生物制剂溶液；
b.将上述复合分解菌生物制剂溶液接种于步骤(1)灭菌后的芭乐浆液中，进行发酵，得到发酵液；
c.将上述得到的发酵液离心处理，取上清液，得到芭乐微生物分解液；
(3)复合微生物产香：
a.向步骤(2)得到的芭乐微生物分解液中添加葡萄糖混合均匀后，灭菌备用；
b.将酿酒酵母和产香酵母配成复合产香菌，再与无菌水混合配成复合产香菌生物制剂溶液；
c.将上述步骤中制备的复合产香菌生物制剂溶液接种于上述加糖灭菌后的芭乐微生物分解液中，进行发酵，得到发酵液；
d.将上述得到的发酵液离心处理，取上清液，得到芭乐微生物产香液；
(4)除菌保质：
a.将步骤(3)获得的芭乐微生物产香液过滤，除杂除菌；
b.在除菌后芭乐微生物产香液中添加丙二醇，得到所需的芭乐香料。
2.根据权利要求1中所述的芭乐香料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，芭乐破碎成2～4cm*2～4cm；灭菌条件为100～115℃，15～30min。
3.根据权利要求1中所述的芭乐香料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，纤维素分解菌制剂为节杆菌，果胶分解菌制剂为毛霉菌。
4.根据权利要求3中所述的芭乐香料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，节杆菌和毛霉菌的质量比为1:90～1:100；复合分解菌生物制剂溶液中复合分解菌和无菌水的质量比为1:90～1:100。
5.根据权利要求1中所述的芭乐香料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，复合分解菌生物制剂溶液在芭乐浆液中的接种量为0.005～0.05％；发酵的条件为：pH值为5～8、搅拌转速50～200rpm、通气量为0.2～1vvm、发酵温度为20～45℃、发酵时间为5～12d。
6.根据权利要求1中所述的芭乐香料的制备方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中，所述离心条件为2000～9000rpm，10～30min。
7.根据权利要求1中所述的芭乐香料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，葡萄糖的重量占比为芭乐微生物分解液的0.1～5％。
8.根据权利要求1中所述的芭乐香料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，复合产香菌中酿酒酵母和产香酵母的质量比为1:1.5～1:3；复合产香菌生物制剂溶液中复合产香菌和无菌水的质量比为1:90～1:100。
9.根据权利要求1中所述的芭乐香料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，复合产香菌生物制剂溶液在芭乐浆液中的接种量为5～20％；发酵的条件为：pH值为2.5-5.5、搅拌转速为50～200rpm、通气量为0.2～1vvm、前发酵温度为30～45℃、前发酵时间为1～5d、后发酵温度为15℃～25℃，后发酵时间为1d～7d。
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