CN108676721A - 一种益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂及其应用，属于生物制品制备领域。为了提高益生菌在冷冻干燥工艺中细胞的存活率，本发明公开一种益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂，其由如下重量百分含量的组分组成：鼠李糖脂3.5‑5.5％，丙二醛1.5％‑2.2％，谷氨酸1.0‑1.6％，酪氨酸0.8‑1.2％，7‑癸烯‑4‑内酯2.0‑4.0％，磷酸氢二钠0.8‑1.5％、磷酸二氢钠0.8‑1.5％，维生素C 0.3‑0.5％，余量为蒸馏水。该保护剂与益生菌固形物混合后可以大幅度提高益生菌的存活率，因此具有广阔应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂及其应用，属于生物制品制备领域。
背景技术
冷冻干燥技术是将湿物料或溶液在较低的温度(－10-－50℃)下冻结成固态，然后在真空(1.3-13Pa)下使其中的水分不经液态直接升华成气态，最终使物料脱水的干燥技术。物料的干燥在冻结状态下完成，与其他干燥方法相比，物料的物理结构和分子结构变化极小，其组织结构和外观形态被较好地保存，并具有优异的复水性，可在短时间内恢复干燥前的状态。由于干燥过程是在很低的温度下进行，而且基本隔绝了空气，因此有效地抑制了热敏性物质发生生物、化学或物理变化，并较好地保存了原料中的活性物质。因此，冷冻干燥技术是目前最好的保藏菌种方法之一，广泛用于益生菌制剂冻干粉和益生菌保藏菌种等方面。
益生菌冷冻干燥技术冻干是冷冻和干燥技术的有机结合，细胞在冻干过程中要经受冷冻和干燥两种激烈因素的作用，导致细胞膜物理条件或敏感蛋白结构的变化，使细胞活力下降。微生物冷冻干燥期间细胞内外的水分冻结成冰，冰晶生长产生的机械力量会引起细胞机械损伤。同时冻干引起溶质效应会使细胞水分溢出，具有生物活性的酶蛋白和抑制因子变性失活，细胞膜发生膜渗透性增加,使胞内的物质与胞外水溶性物质无控制地进行双向交换,从而造成细胞的代谢损伤。冻干会使细胞膜上的脂肪酸发生变化,使细胞膜的完整性会受到破坏,微生物细胞因此出现损伤。
许多研究发现在乳酸菌冻干前加入适当的物质能起到保护作用，冻干保护剂如甘油、聚乙二醇、氨基酸、糖类保护剂，不仅影响乳酸菌在冻干过程中的细胞存活率，还影响保藏期间的细胞稳定性。对于绝大多数细菌冷冻干燥成功的关键在于有效保护剂的使用，保护剂可以改变生物样品冷冻干燥时的物理、化学环境，减轻或防止冷冻干燥或复水对细胞的损害，尽可能保持原有的各种生理生化特性和生物活性。糖类保护剂如单糖、双糖、多糖等对微生物细胞的冻干脱水具有显著的保护作用。糖类保护剂中二糖的保护作用是近年来国内外学者研究的热点。严佩峰研究发现嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌冻干保护剂的最优配方为：脱脂乳10％、维生素C0.5％、谷氨酸钠0.5％、明胶1.5％。且在冷冻干燥过程中保护作用越好的冻干保护剂，其在保藏过程中的保护作用也越明显。在所选的6种冻干保护剂中，甘油的冻干保护效果最好，其次是麦芽糊精、蔗糖、维生素C、乳糖、谷氨酸钠。复合冻干保护剂对嗜酸乳杆菌冻干保护效果显著，最佳冻干保护剂组合为5％甘油、2％麦芽糊精、2.5％蔗糖。
中国专利申请201310285984.8公开了一种益生菌超低温冷冻工艺、适合这种工艺的全盐冷冻保护剂配方及其制备的益生菌超低温冷冻颗粒。所述益生菌超低温冷冻工艺包括以下步骤：(1)配制发酵培养基；(2)培养益生菌；(3)离心处理；(4)配制保护剂；(5)添加保护剂；(6)速冻成型。其提供了利用所述益生菌超低温冷冻颗粒制备的益生菌制剂及其制备方法。本发明所述益生菌超低温冷冻颗粒为益生菌冷冻菌株，其不需要干燥除水，具有冷冻速度快、活菌率高、复水性能好等优点。
发明内容
为了克服现有技术中益生菌在冷冻干燥工艺中活细胞损失较大的技术不足，本发明提供一种益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂及其应用，所述的复合保护剂由鼠李糖脂、丙二醛、，谷氨酸、酪氨酸以及7-癸烯-4-内酯等组分制备得到，其中各组分在提高益生菌在冷冻干燥工艺的存活率方面具有显著的协同作用，因此具有广阔的应用前景。
本发明通过下述方案实现上述技术效果：
一种益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂，其由如下重量百分含量的组分组成：鼠李糖脂3.5-5.5％，丙二醛1.5％-2.2％，谷氨酸1.0-1.6％，酪氨酸0.8-1.2％，7-癸烯-4-内酯2.0-4.0％，磷酸氢二钠0.8-1.5％、磷酸二氢钠0.8-1.5％，维生素C 0.3-0.5％，余量为蒸馏水。
优选地，所述的益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂中鼠李糖脂与7-癸烯-4-内酯的重量比为2:1。在此重量配比下，鼠李糖脂和7-癸烯-4-内酯在保护益生菌细胞方面具有显著的协同作用。
更优选地，所述的益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂由如下重量百分含量的组分组成：鼠李糖脂5％，丙二醛1.8％，谷氨酸1.4％，酪氨酸1.0％，7-癸烯-4-内酯2.5％，磷酸氢二钠1.2％、磷酸二氢钠1.2％，维生素C 0.4％，余量为蒸馏水。在此配方比例下，益生菌细胞在冷冻干燥工艺中的细胞损失率最少。
本发明还请求保护所述复合保护剂在益生菌冷冻干燥工艺中的应用。优选地，在益生菌制剂冷冻干燥前，将本发明所述的益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂与益生菌固形物按照1:20-60的比例混合，更优选地，所述的低温冷冻干燥用复合保护剂与益生菌固形物的混合比例为1:40。
优选地，所述的冷冻干燥工艺菌体包括如下步骤：将益生菌载体在离心转速为8000-10000rpm，离心时间为10-20min条件下离心得到益生菌固形物，将冷冻干燥用复合保护剂与益生菌固形物中混合均匀，放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥,按照每半小时降温10℃的降温速度降至至-20℃--60℃，真空度维持在20-40pa持续4-8小时，按照每半小时5℃的升温速度升温至30℃，控制真空度为40-60pa继续干燥10小时，即冷冻干燥完成。其中所述的益生菌载体为包含益生菌的发酵液或者包含益生菌的细胞悬液。
实验结果显示，本发明复合保护剂对冷冻干燥工艺前后益生菌具有十分显著的保护作用，冷冻干燥工艺中细胞的存活率均在80％以上，与未添加任何保护剂的工艺相比具有极显著性差异，与现有技术中其他冷冻工艺相比具有显著性差异。其中实施例4所述的复合保护剂的保护效果最佳。对比实施例2和对比实施例3调整了其中鼠李糖脂与7-癸烯-4-内酯的重量比，其效果相对于对比文件4存活率明显下降，这表明鼠李糖脂与7-癸烯-4-内酯在本发明低温保护剂中具有显著的协同效果，鼠李糖脂与7-癸烯-4-内酯的最佳重量比为2:1。
本发明所述的益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂与现有技术相比具有如下技术优势：
1)本发明所述的复合保护剂含有多种活性组分，其组分明确，且在提高益生菌在冷冻干燥工艺中的存活率方面具有显著的协同作用，其效果显著由于未添加任何保护剂的工艺以及现有技术中其他冷冻工艺。
2)本发明所述的复合保护剂使用范围广，其对于乳杆菌属以及双歧杆菌属的菌种均具有很到的保护作用，其应用前景可期。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步描述本发明，但所述实施例并不以任何方式限定专利保护的范围。
实施例1本发明益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂及其冷冻干燥工艺
一种益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂，其由如下重量百分含量的组分组成：鼠李糖脂3.5％，丙二醛1.5％，谷氨酸1.0％，酪氨酸0.8％，7-癸烯-4-内酯2.0％，磷酸氢二钠0.8％、磷酸二氢钠0.8％，维生素C 0.3％，余量为蒸馏水。
所述的冷冻干燥工艺包括如下步骤：将益生菌载体在离心转速为8000rpm，离心时间为10min条件下离心得到益生菌固形物，将冷冻干燥用复合保护剂与益生菌固形物中混合均匀，放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥,按照每半小时降温10℃的降温速度降至至-20℃，真空度维持在20pa持续4小时，按照每半小时5℃的升温速度升温至30℃，控制真空度为40pa继续干燥10小时，即冷冻干燥完成。其中所述的益生菌载体为包含益生菌的发酵液或者包含益生菌的细胞悬液。
实施例2本发明益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂及其冷冻干燥工艺
一种益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂，其由如下重量百分含量的组分组成：鼠李糖脂5.5％，丙二醛2.2％，谷氨酸1.6％，酪氨酸1.2％，7-癸烯-4-内酯4.0％，磷酸氢二钠1.5％、磷酸二氢钠1.5％，维生素C 0.5％，余量为蒸馏水。
所述的冷冻干燥工艺包括如下步骤：将益生菌载体在离心转速为10000rpm，离心时间为20min条件下离心得到益生菌固形物，将冷冻干燥用复合保护剂与益生菌固形物中混合均匀，放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥,按照每半小时降温10℃的降温速度降至至-60℃，真空度维持在40pa持续8小时，按照每半小时5℃的升温速度升温至30℃，控制真空度为60pa继续干燥10小时，即冷冻干燥完成。其中所述的益生菌载体为包含益生菌的发酵液或者包含益生菌的细胞悬液。
实施例3本发明益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂及其冷冻干燥工艺
一种益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂，其由如下重量百分含量的组分组成：鼠李糖脂4.5％，丙二醛1.8％，谷氨酸1.3％，酪氨酸1.0％，7-癸烯-4-内酯2.5％，磷酸氢二钠1.2％、磷酸二氢钠1.2％，维生素C 0.4％，余量为蒸馏水。
所述的冷冻干燥工艺包括如下步骤：将益生菌载体在离心转速为8000rpm，离心时间为20min条件下离心得到益生菌固形物，将冷冻干燥用复合保护剂与益生菌固形物中混合均匀，放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥,按照每半小时降温10℃的降温速度降至至-20℃，真空度维持在40pa持续4小时，按照每半小时5℃的升温速度升温至30℃，控制真空度为60pa继续干燥10小时，即冷冻干燥完成。其中所述的益生菌载体为包含益生菌的发酵液或者包含益生菌的细胞悬液。
实施例4本发明益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂及其冷冻干燥工艺
一种益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂，其由如下重量百分含量的组分组成：鼠李糖脂5％，丙二醛1.8％，谷氨酸1.4％，酪氨酸1.0％，7-癸烯-4-内酯2.5％，磷酸氢二钠1.2％、磷酸二氢钠1.2％，维生素C 0.4％，余量为蒸馏水。
所述的冷冻干燥工艺包括如下步骤：将益生菌载体在离心转速为9000rpm，离心时间为15min条件下离心得到益生菌固形物，将冷冻干燥用复合保护剂与益生菌固形物中混合均匀，放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥,按照每半小时降温10℃的降温速度降至至-40℃，真空度维持在30pa持续6小时，按照每半小时5℃的升温速度升温至30℃，控制真空度为50pa继续干燥10小时，即冷冻干燥完成。其中所述的益生菌载体为包含益生菌的发酵液或者包含益生菌的细胞悬液。
实施例5本发明益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂及其冷冻干燥工艺
一种益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂，其由如下重量百分含量的组分组成：鼠李糖脂5.5％，丙二醛1.5％，谷氨酸1.6％，酪氨酸0.8％，7-癸烯-4-内酯4.0％，磷酸氢二钠0.8％、磷酸二氢钠1.5％，维生素C 0.3％，余量为蒸馏水。
所述的冷冻干燥工艺包括如下步骤：将益生菌载体在离心转速为10000rpm，离心时间为10min条件下离心得到益生菌固形物，将冷冻干燥用复合保护剂与益生菌固形物中混合均匀，放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥,按照每半小时降温10℃的降温速度降至至-60℃，真空度维持在20pa持续8小时，按照每半小时5℃的升温速度升温至30℃，控制真空度为40pa继续干燥10小时，即冷冻干燥完成。其中所述的益生菌载体为包含益生菌的发酵液或者包含益生菌的细胞悬液。
对比实施例1按照201310285984.8实施例6所述的工艺进行冷冻干燥工艺。
对比实施例2
益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂由如下重量百分含量的组分组成：鼠李糖脂5％，丙二醛1.8％，谷氨酸1.4％，酪氨酸1.0％，7-癸烯-4-内酯2％，磷酸氢二钠1.2％、磷酸二氢钠1.2％，维生素C 0.4％，余量为蒸馏水。其余同实施例4。
对比实施例3
益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂由如下重量百分含量的组分组成：鼠李糖脂5％，丙二醛1.8％，谷氨酸1.4％，酪氨酸1.0％，7-癸烯-4-内酯5％，磷酸氢二钠1.2％、磷酸二氢钠1.2％，维生素C 0.4％，余量为蒸馏水。其余同实施例4。
对比实施例4
未添加冷冻干燥用复合保护剂，直接按照实施例4所述的工艺进行冷冻干燥。
实施例6本发明益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂对益生菌细胞的保护作用研究
按照本发明所述的工艺分别处理样品1、样品2和样品3，分别测定冷冻前后的益生菌数量变化，其中样品1为拉曼乳杆菌的发酵液，样品2为短双歧杆菌的发酵液，样品3为长双歧杆菌和干酪乳杆菌的细胞悬液。菌落计数按照GB 4789.35-2010食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验所述的方法进行，计算其存活率，存活率为冷冻干燥后的细菌总数与冷冻干燥前的细菌总数的比值。其测定结果如下所示。
表1本发明复合保护剂对冷冻干燥工艺前后益生菌的保护作用
| 样品1存活率(％) | 样品2存活率(％) | 样品3存活率(％) | |
| 实施例1 | 88.5 | 81.4 | 86.8 |
| 实施例2 | 84.7 | 86.9 | 79.8 |
| 实施例3 | 81.5 | 86.4 | 76.9 |
| 实施例4 | 91.5 | 92.6 | 95.8 |
| 实施例5 | 88.9 | 90.1 | 92.4 |
| 对比实施例1 | 45.9 | 52.3 | 55.2 |
| 对比实施例2 | 68.6 | 72.4 | 74.6 |
| 对比实施例3 | 76.5 | 71.4 | 65.8 |
| 对比实施例4 | 24.5 | 21.9 | 25.3 |
由上表可以看出，本发明复合保护剂对冷冻干燥工艺前后益生菌具有十分显著的保护作用，冷冻干燥工艺中细胞的存活率均在80％以上，与未添加任何保护剂的工艺相比具有极显著性差异，与现有技术中其他冷冻工艺相比具有显著性差异。其中实施例4所述的复合保护剂的保护效果最佳。对比实施例2和对比实施例3调整了其中鼠李糖脂与7-癸烯-4-内酯的重量比，其效果相对于对比文件4存活率明显下降，这表明鼠李糖脂与7-癸烯-4-内酯在本发明低温保护剂中具有显著的协同效果，鼠李糖脂与7-癸烯-4-内酯的最佳重量比为2:1。
Claims (8)
1.一种益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂，其由如下重量百分含量的组分组成：鼠李糖脂3.5-5.5％，丙二醛1.5％-2.2％，谷氨酸1.0-1.6％，酪氨酸0.8-1.2％，7-癸烯-4-内酯2.0-4.0％，磷酸氢二钠0.8-1.5％、磷酸二氢钠0.8-1.5％，维生素C 0.3-0.5％，余量为蒸馏水。
2.根据权利要求1所述的益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂，其特征在于，所述的益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂中鼠李糖脂与7-癸烯-4-内酯的重量比为2:1。
3.根据权利要求1所述的益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂，其特征在于，所述的益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂由如下重量百分含量的组分组成：鼠李糖脂5％，丙二醛1.8％，谷氨酸1.4％，酪氨酸1.0％，7-癸烯-4-内酯2.5％，磷酸氢二钠1.2％、磷酸二氢钠1.2％，维生素C 0.4％余量为蒸馏水。
4.权利要求1-3任一所述的复合保护剂在益生菌冷冻干燥工艺中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在益生菌制剂冷冻干燥前，将益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂与益生菌固形物按照1:20-60的比例混合。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在益生菌制剂冷冻干燥前，将益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂与益生菌固形物按照1:40的比例混合。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的冷冻干燥工艺菌体包括如下步骤：将益生菌载体在离心转速为8000-10000rpm，离心时间为10-20min条件下离心得到益生菌固形物，将冷冻干燥用复合保护剂与益生菌固形物中混合均匀，放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥,按照每半小时降温10℃的降温速度降至至-20℃--60℃，真空度维持在20-40pa持续4-8小时，按照每半小时5℃的升温速度升温至30℃，控制真空度为40-60pa继续干燥10小时，即冷冻干燥完成。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的益生菌载体为包含益生菌的发酵液或者包含益生菌的细胞悬液。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
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Denomination of invention: A composite protective agent for low-temperature freeze-drying of probiotics and its application Effective date of registration: 20230905 Granted publication date: 20201120 Pledgee: CITIC Bank Co.,Ltd. Guangzhou Branch Pledgor: GUANGZHOU FUNUO NUTRITION TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2023980055309 |