CN108624704A - 一种荧光定量pcr探针技术联合检测沙眼衣原体、淋球菌、生殖道支原体的方法和试剂盒 - Google Patents
一种荧光定量pcr探针技术联合检测沙眼衣原体、淋球菌、生殖道支原体的方法和试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108624704A CN108624704A CN201810654566.4A CN201810654566A CN108624704A CN 108624704 A CN108624704 A CN 108624704A CN 201810654566 A CN201810654566 A CN 201810654566A CN 108624704 A CN108624704 A CN 108624704A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fluorophor
- gonococcus
- probes
- chlamydia trachomatis
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
Abstract
本公开提供了一种引物探针组，该引物探针组用于荧光定量PCR联合检测沙眼衣原体和淋球菌以及生殖道支原体，该引物探针组包括：CT引物对、CT探针、MG引物对、MG探针、NG引物对和NG探针。另一方面，本公开还提供了一种荧光定量PCR联合检测沙眼衣原体和淋球菌以及生殖道支原体的方法。再一方面，本公开还提供了一种荧光定量PCR联合检测沙眼衣原体和淋球菌以及生殖道支原体的试剂盒。通过上述技术方案，本公开能够以更高的灵敏度且更好的特异性，实现对沙眼衣原体、淋球菌和生殖器支原体的联合检测。
Description
技术领域
本公开涉及医药生物技术领域，具体地，涉及一种用于荧光定量PCR联合检测沙眼衣原体和淋球菌以及生殖道支原体的探针引物组、一种荧光定量PCR联合检测沙眼衣原体和淋球菌以及生殖道支原体的方法以及一种荧光定量PCR联合检测沙眼衣原体和淋球菌以及生殖道支原体的试剂盒。
背景技术
世界卫生组织估计全球每年约有3.4亿新增性传播感染病例，其中沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，CT)和淋球菌(Neisseria gonorrhoeae，NG)以及生殖道支原体(Mycoplasma genitourinary，MG)是最常见的三种病原体，导致了包括宫颈炎、盆腔炎、淋病、急性尿道综合症等多种不同症状的性病，并由此进一步导致不孕、胚胎夭折、低体质量胎儿和死胎等严重后果。因此开展沙眼衣原体、淋球菌和生殖器支原体的病原检测及鉴定对于临床性病的早期发现、早期治疗、降低疾病风险和控制传染性疾病具有重要的意义。
已经有多份文献公开了沙眼衣原体、淋球菌和生殖器支原体的联合检测。例如：CN101935686A公开了一种淋球菌、人型支原体、生殖器支原体、沙眼衣原体、解脲支原体的检测方法和试剂盒，其中使用了多重PCR凝胶电泳分离方法；CN102277429A公开了一种淋球菌、沙眼衣原体及解脲脲原体的试剂盒，其中使用了芯片法；CN102888464A公开了在单个PCR反应容器中五重检测淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人型支原体和生殖器支原体检测试剂盒，其中使用了荧光探针PCR法。
但是，实验结果显示，已有的沙眼衣原体、淋球菌和生殖器支原体的联合检测方法存在灵敏度低和特异性差的缺陷。
发明内容
本公开的目的是克服已有的沙眼衣原体、淋球菌和生殖器支原体的联合检测方法存在灵敏度低和特异性差的缺陷，提供一种灵敏度高且特异性好的联合检测沙眼衣原体、淋球菌和生殖器支原体的方法。
为了实现上述目的，一方面，本公开提供了一种引物探针组，该引物探针组用于荧光定量PCR联合检测沙眼衣原体和淋球菌以及生殖道支原体，其特征在于，该引物探针组包括：CT引物对、CT探针、MG引物对、MG探针、NG引物对和NG探针；其中，所述CT引物对包括SEQID NO.1所示的正向CT引物和SEQ ID NO.2所示的反向CT引物；所述CT探针如SEQ ID NO.3所示且标记有第一荧光基团；所述MG引物对包括SEQ ID NO.4所示的正向MG引物和SEQ IDNO.5所示的反向MG引物；所述MG探针如SEQ ID NO.6所示且标记有第二荧光基团；所述NG引物对包括SEQ ID NO.7所示的正向MG引物和SEQ ID NO.8所示的反向MG引物；所述MG探针如SEQ ID NO.9所示且标记有第三荧光基团；所述第一荧光基团、所述第二荧光基团和所述第三荧光基团彼此相同或不同。
另一方面，本公开还提供了一种荧光定量PCR联合检测沙眼衣原体和淋球菌以及生殖道支原体的方法，所述方法包括如下步骤：(1)提取待测样本的总DNA；(2)以所述总DNA为模板，并使用如上所述的引物探针组，进行荧光定量PCR反应；(3)收集不同检测通道的荧光信号，得到检测结果；a)若所述第一荧光基团对应的荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有沙眼衣原体；b)若所述第二荧光基团对应的荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有生殖道支原体；c)若所述第三荧光基团对应的荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有淋球菌。
再一方面，本公开还提供了一种荧光定量PCR联合检测沙眼衣原体和淋球菌以及生殖道支原体的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的引物探针组。
通过上述技术方案，本公开能够以更高的灵敏度且更好的特异性，实现对沙眼衣原体、淋球菌和生殖器支原体的联合检测。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开提供了一种引物探针组，该引物探针组用于荧光定量PCR联合检测沙眼衣原体和淋球菌以及生殖道支原体，该引物探针组包括：CT引物对、CT探针、MG引物对、MG探针、NG引物对和NG探针；其中，所述CT引物对包括SEQ ID NO.1所示的正向CT引物和SEQ IDNO.2所示的反向CT引物；所述CT探针如SEQ ID NO.3所示且标记有第一荧光基团；所述MG引物对包括SEQ ID NO.4所示的正向MG引物和SEQ ID NO.5所示的反向MG引物；所述MG探针如SEQ ID NO.6所示且标记有第二荧光基团；所述NG引物对包括SEQ ID NO.7所示的正向MG引物和SEQ ID NO.8所示的反向MG引物；所述MG探针如SEQ ID NO.9所示且标记有第三荧光基团；所述第一荧光基团、所述第二荧光基团和所述第三荧光基团彼此相同或不同。
其中，所述第一荧光基团、所述第二荧光基团和所述第三荧光基团可以相同，在这种情况下，可以进行沙眼衣原体和淋球菌以及生殖道支原体的累加检测，即给出的检测结果是沙眼衣原体和淋球菌以及生殖道支原体中的任意一者，而不进行沙眼衣原体和淋球菌以及生殖道支原体之间的区分。
其中，所述第一荧光基团、所述第二荧光基团和所述第三荧光基团可以彼此不同。在这种情况下，可以进行沙眼衣原体和淋球菌以及生殖道支原体的分别检测，即给出的检测结果进行了沙眼衣原体和淋球菌以及生殖道支原体之间的区分。
其中，所述第一荧光基团、所述第二荧光基团和所述第三荧光基团的具体选择可以在本领域常规使用的实时定量PCR荧光基团中任意地选择，所述实时定量PCR荧光基团包括但不限于FAM荧光基团、ROX荧光基团、HEX荧光基团、CY3基团及CY5基团。优选地，所述第一荧光基团、所述第二荧光基团和所述第三荧光基团依次为FAM荧光基团、ROX荧光基团和HEX荧光基团。
其中，优选地，该引物探针组还包括内参引物对和内参探针。内参引物对和内参探针可以有助于对不同样本浓度进行均一化。使得不同样本之间的定量结果具有可比性，因此具有了伴随诊断、用药指导及治疗评价等功能；即通过医治前后试验结果比较和前后两次内参结果比较，推断治疗效果、药物疗效等。
其中，更优选地，所述内参引物对包括SEQ ID NO.10所示的正向内参引物和SEQID NO.11所示的反向内参引物；所述内参探针如SEQ ID NO.12所示且标记有第四荧光基团；所述第一荧光基团、所述第一荧光基团和所述第三荧光基团中的任意一者与所述第四荧光基团均不同；特别优选地，所述第四荧光基团为CY5荧光基团。
其中，进一步优选地，该引物探针组由所述CT引物对、所述CT探针、所述MG引物对、所述MG探针、所述NG引物对、所述NG探针、所述内参引物对和所述内参探针组成；再进一步优选地，该引物探针组由等量混合的所述CT引物对、所述CT探针、所述MG引物对、所述MG探针、所述NG引物对、所述NG探针、所述内参引物对和所述内参探针组成。在该优选情况下，该引物探针组中的所述CT引物对、所述CT探针、所述MG引物对、所述MG探针、所述NG引物对、所述NG探针、所述内参引物对和所述内参探针之间互相干扰极小且能够取得更灵敏可信的检测结果。
详细地，本申请中SEQ ID NO.1-12的序列信息如下表1所示：
表1
另一方面，本公开还提供了一种荧光定量PCR联合检测沙眼衣原体和淋球菌以及生殖道支原体的方法，所述方法包括如下步骤：(1)提取待测样本的总DNA；(2)以所述总DNA为模板，并使用如前所述的引物探针组，进行荧光定量PCR反应；(3)收集不同检测通道的荧光信号，得到检测结果；a)若所述第一荧光基团对应的荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有沙眼衣原体；b)若所述第二荧光基团对应的荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有生殖道支原体；c)若所述第三荧光基团对应的荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有淋球菌。
其中，优选地，荧光定量PCR反应的条件包括：变性温度为95～98℃，退火温度为60～65℃。特别优选地，变性温度为95℃，退火温度为60℃。
其中，优选地，荧光定量PCR反应的条件还包括：每种引物的终浓度为50～250nmol/mL，每种探针的终浓度为50～200nmol/mL。特别优选地，每种引物的终浓度为100nmol/mL，每种探针的终浓度为150nmol/mL。
本公开的检测的方法的直接目的不是获得诊断结果和健康状况，而只是对已经脱离人体或动物体的样品进行检测，所获得的仅仅是作为中间结果的信息。
再一方面，本公开提供了一种荧光定量PCR联合检测沙眼衣原体和淋球菌以及生殖道支原体的试剂盒，所述试剂盒包括如前所述的引物探针组。
可选地，所述试剂盒还包括PCR反应体系缓冲液、DNA聚合酶、dNTP和水中的至少一种。
进一步优选地，所述试剂盒中还包括阳性对照、阴性对照和内参标准品中的至少一种。所述阳性对照分别含有灭活的沙眼衣原体和淋球菌以及生殖道支原体，所述阴性对照不含有沙眼衣原体和淋球菌以及生殖道支原体。
以下，通过实施例进一步详细说明本发明。
制备实施例
合成如表2所示的引物和探针，其中探针的荧光标记基团在合成时已经引入：
表2
测试实施例1
含有沙眼衣原体和淋球菌以及生殖道支原体的待测样本来源于购买ATCC，其中沙眼衣原体的含量为108CFU/mL，淋球菌的含量为108CFU/mL，生殖道支原体的含量为108CFU/mL。使用上海市医脉赛生物科技有限公司磁珠法DNA提取试剂盒，提取该待测样本总DNA，待测样本总DNA是从0.2mL的样本中提取的。
使用该待测样本总DNA，按照表3的引物探针组合进行实时定量PCR测试，实时定量PCR的条件包括：变性温度为95℃，退火温度为60℃，每种引物的终浓度为100nmol/mL，每种探针的终浓度为150nmol/mL。实时定量PCR的PCR反应体系缓冲液、DNA聚合酶、dNTP和水均为购自Life Technologies生物公司的市售品。每个测试使用0.1μL的该待测样本总DNA。
表3中的引物和探针的数字表示其序列顺序号：
表3
测试1-35的结果如表4所示。
表4
根据表4的结果可见，针对相同的样本，本申请的引物探针组具有更小的Ct值，因此灵敏度更高。
测试实施例2
含有沙眼衣原体和淋球菌以及生殖道支原体的待测样本来源于ATCC，其中沙眼衣原体的含量为108CFU/mL，淋球菌的含量为108CFU/mL，生殖道支原体的含量为108CCU/mL。使用上海市医脉赛生物科技有限公司磁珠法DNA提取试剂盒，提取该待测样本总DNA，待测样本总DNA是从0.2mL的样本中提取的。并且，将该待测样本总DNA按梯度比例进行稀释。
使用该待测样本总DNA，按照表3的引物探针组合1-3进行实时定量PCR测试，实时定量PCR的条件包括：变性温度为95℃，退火温度为60℃，每种引物的终浓度为100nmol/mL，每种探针的终浓度为150nmol/mL。实时定量PCR的PCR反应体系缓冲液、DNA聚合酶、dNTP和水均为购自Life Technologies生物公司的市售品。每个测试使用1μL的该待测样本总DNA或该待测样本总DNA按梯度比例稀释液。
测试方案和结果如表5所示。
表5
根据表5的结果可见，针对高稀释倍数的样本，本申请的引物探针组具有更小的Ct值，因此灵敏度更高，而引物探针组合2和3则因Ct值过大而无法进行检测。
测试实施例3
含有人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒2型、大肠杆菌、B族链球菌、白色念珠菌、沙眼衣原体和淋球菌以及生殖道支原体的待测样本购买于ATCC和中国食品药品检定研究院，其中大肠杆菌含量为108CFU/mL，B族链球菌含量为108CFU/mL，白色念珠菌含量为108CFU/mL，沙眼衣原体的含量为108CFU/mL，淋球菌的含量为108CFU/mL，人巨细胞病毒含量为108CFU/mL，单纯疱疹病毒2型含量为108CFU/mL，生殖道支原体的含量为108CFU/mL。使用上海市医脉赛生物科技有限公司磁珠法DNA提取试剂盒，提取该待测样本总DNA，待测样本总DNA是从0.2mL的样本中提取的。
使用该待测样本总DNA，按照表3的引物探针组合1-3进行实时定量PCR测试，实时定量PCR的条件包括：变性温度为95℃，退火温度为60℃，每种引物的终浓度为100nmol/mL，每种探针的终浓度为150nmol/mL。实时定量PCR的PCR反应体系缓冲液、DNA聚合酶、dNTP和水均为购自Life Technologies生物公司的市售品。
测试方案和结果如表6所示。
表6
根据表6的结果可见，针对含有干扰的样本，本申请的引物探针组的Ct值变化幅度较小而可以忽略，因此准确度更高，而引物探针组合2和3则因Ct值变化幅度过大而显示出较差的准确度。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 上海孚清生物科技有限公司
<120> 一种荧光定量PCR探针技术联合检测沙眼衣原体、淋球菌、生殖道支原体的方法和试剂盒
<130> 10512FQSW
<160> 62
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)
<400> 1
gccgctttga gttctgcttc ct 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)
<400> 2
gctgatagcg tcacaccaag tg 22
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)
<400> 3
ctgaaccaag ccttatgatc gacggaattc 30
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 生殖道支原体(Mycoplasma genitourinary)
<400> 5
agcaagctag cagtcaccaa 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 生殖道支原体(Mycoplasma genitourinary)
<400> 5
ccaccaccca gtaccacatg 20
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 生殖道支原体(Mycoplasma genitourinary)
<400> 6
ccacattgtc gtgatgggta acagc 25
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)
<400> 7
ggcgaacagg ctttggaa 18
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)
<400> 8
ggctacggaa tcgacgacta 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)
<400> 9
atctgcgaca cgctcgtccg ttc 23
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgtgtgctgg cccatcact 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acttgtgggc cagggcatt 19
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccaccagtgc aggctgccta tcagaa 26
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)
<400> 13
tgtccatatc tttgatacga t 21
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)
<400> 14
ctctgatatt tgaagactct aca 23
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)
<400> 15
ccaagccgag tctacagtta taggtca 27
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 生殖道支原体(Mycoplasma genitourinary)
<400> 16
aggcagtaat gtcaatcaca 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 生殖道支原体(Mycoplasma genitourinary)
<400> 17
ggctttatca ttggcaaacg 20
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 生殖道支原体(Mycoplasma genitourinary)
<400> 18
ccattcgcat ccaacttcac ctct 24
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)
<400> 19
accgtaacgt ctctaagtc 19
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)
<400> 20
gcaagatttc cgatttggc 19
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)
<400> 21
cagacatcac gcaccgaagc at 22
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)
<400> 22
tccggagcga gttacgaaga 20
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)
<400> 23
aatcaatgcc cggattggt 19
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)
<400> 24
ctgaaccaag ccttatgatc gacggaattc 30
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 生殖道支原体(Mycoplasma genitourinary)
<400> 25
agttgatgaa accttaaccc cttgg 25
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 生殖道支原体(Mycoplasma genitourinary)
<400> 26
ccgttgaggg gttttccatt tttgc 25
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 生殖道支原体(Mycoplasma genitourinary)
<400> 27
ccacattgtc gtgatgggta acagc 25
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)
<400> 28
gctacgcata cccgcgttgc 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)
<400> 29
cgaagacctt cgagcagaca 20
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)
<400> 30
atctgcgaca cgctcgtccg ttc 23
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)
<400> 31
ctgaaccaag ccttatgatc gacggaattc 30
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)
<400> 32
gctgaaccaa gccttatgat cgacggaatt 30
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> 沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)
<400> 33
tgaaccaagc cttatgatcg acggaattcc 30
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> 沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)
<400> 34
aaaaccacag caaagagact cccgtagacc 30
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> 沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)
<400> 35
taaaccacag caaagagact cccgtagacc 30
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> 沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)
<400> 36
aaaccacagc aaagagactc ccgtagacct 30
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)
<400> 37
aaccacagca aagagactcc cgtagacctc 30
<210> 38
<211> 29
<212> DNA
<213> 沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)
<400> 38
gctgaaccaa gccttatgat cgacggaat 29
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 生殖道支原体(Mycoplasma genitourinary)
<400> 39
ccacattgtc gtgatgggta acagc 25
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 生殖道支原体(Mycoplasma genitourinary)
<400> 40
gcacattgtc gtgatgggta acagc 25
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 生殖道支原体(Mycoplasma genitourinary)
<400> 41
accacattgt cgtgatgggt aacag 25
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 生殖道支原体(Mycoplasma genitourinary)
<400> 42
gttgtaataa gctaaaccct acc 23
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 生殖道支原体(Mycoplasma genitourinary)
<400> 43
ttgtaataag ctaaacccta ccc 23
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> 生殖道支原体(Mycoplasma genitourinary)
<400> 44
tgtaataagc taaaccctac cca 23
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> 生殖道支原体(Mycoplasma genitourinary)
<400> 45
gccacattgt cgtgatgggt aacag 25
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> 生殖道支原体(Mycoplasma genitourinary)
<400> 46
accacattgt cgtgatgggt aaca 24
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> 淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)
<400> 47
atctgcgaca cgctcgtccg ttc 23
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> 淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)
<400> 48
tctgcgacac gctcgtccgt tct 23
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)
<400> 49
aatctgcgac acgctcgtcc gtt 23
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> 淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)
<400> 50
cgacgcattc catccacc 18
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> 淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)
<400> 51
gacgcattcc atccaccc 18
<210> 52
<211> 18
<212> DNA
<213> 淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)
<400> 52
tacgcattcc atccacca 18
<210> 53
<211> 23
<212> DNA
<213> 淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)
<400> 53
gatctgcgac acgctcgtcc gtt 23
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)
<400> 54
aatctgcgac acgctcgtcc gt 22
<210> 55
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
ccaccagtgc aggctgccta tcagaa 26
<210> 56
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
caccagtgca ggctgcctat cagaac 26
<210> 57
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
caccagtgca ggctgcctat cagaag 26
<210> 58
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
cagtgcaggc tgcct 15
<210> 59
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
gcagtgcagg ctgcct 16
<210> 60
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
ccagtgcagg ctgcct 16
<210> 61
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
gaccagtgca ggctgcctat cagaag 26
<210> 62
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
gcagtgcagg ctgcc 15
Claims (10)
1.一种引物探针组，该引物探针组用于荧光定量PCR联合检测沙眼衣原体和淋球菌以及生殖道支原体，其特征在于，该引物探针组包括：CT引物对、CT探针、MG引物对、MG探针、NG引物对和NG探针；
其中，所述CT引物对包括SEQ ID NO.1所示的正向CT引物和SEQ ID NO.2所示的反向CT引物；所述CT探针如SEQ ID NO.3所示且标记有第一荧光基团；
所述MG引物对包括SEQ ID NO.4所示的正向MG引物和SEQ ID NO.5所示的反向MG引物；所述MG探针如SEQ ID NO.6所示且标记有第二荧光基团；
所述NG引物对包括SEQ ID NO.7所示的正向MG引物和SEQ ID NO.8所示的反向MG引物；所述MG探针如SEQ ID NO.9所示且标记有第三荧光基团；
所述第一荧光基团、所述第二荧光基团和所述第三荧光基团彼此相同或不同。
2.根据权利要求1所述的引物探针组，其中，所述第一荧光基团、所述第二荧光基团和所述第三荧光基团彼此不同；优选地，所述第一荧光基团、所述第二荧光基团和所述第三荧光基团依次为FAM荧光基团、ROX荧光基团和HEX荧光基团。
3.根据权利要求1或2所述的引物探针组，其中，该引物探针组还包括内参引物对和内参探针；所述内参引物对包括SEQ ID NO.10所示的正向内参引物和SEQ ID NO.11所示的反向内参引物；所述内参探针如SEQ ID NO.12所示且标记有第四荧光基团；所述第一荧光基团、所述第二荧光基团和所述第三荧光基团中的任意一者与所述第四荧光基团均不同；优选地，所述第四荧光基团为CY5荧光基团。
4.根据权利要求3所述的引物探针组，其中，该引物探针组由所述CT引物对、所述CT探针、所述MG引物对、所述MG探针、所述NG引物对、所述NG探针、所述内参引物对和所述内参探针组成；优选地，该引物探针组由等量混合的所述CT引物对、所述CT探针、所述MG引物对、所述MG探针、所述NG引物对、所述NG探针、所述内参引物对和所述内参探针组成。
5.一种荧光定量PCR联合检测沙眼衣原体和淋球菌以及生殖道支原体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总DNA；
(2)以所述总DNA为模板，并使用权利要求1-4中任意一项所述的引物探针组，进行荧光定量PCR反应；
(3)收集不同检测通道的荧光信号，得到检测结果；
a)若所述第一荧光基团对应的荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有沙眼衣原体；
b)若所述第二荧光基团对应的荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有生殖道支原体；
c)若所述第三荧光基团对应的荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有淋球菌。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，荧光定量PCR反应的条件包括：变性温度为95～98℃，退火温度为60～65℃。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，荧光定量PCR反应的条件还包括：每种引物的终浓度为50～250nmol/mL，每种探针的终浓度为50～200nmol/mL。
8.一种荧光定量PCR联合检测沙眼衣原体和淋球菌以及生殖道支原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-4中任意一项所述的引物探针组。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应体系缓冲液、DNA聚合酶、dNTP和水中的至少一种。
10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，述试剂盒中还包括阳性对照、阴性对照和内参标准品中的至少一种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810654566.4A CN108624704B (zh) | 2018-06-22 | 2018-06-22 | 一种荧光定量pcr探针技术联合检测沙眼衣原体、淋球菌、生殖道支原体的方法和试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810654566.4A CN108624704B (zh) | 2018-06-22 | 2018-06-22 | 一种荧光定量pcr探针技术联合检测沙眼衣原体、淋球菌、生殖道支原体的方法和试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108624704A true CN108624704A (zh) | 2018-10-09 |
| CN108624704B CN108624704B (zh) | 2021-08-10 |
Family
ID=63692144
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810654566.4A Active CN108624704B (zh) | 2018-06-22 | 2018-06-22 | 一种荧光定量pcr探针技术联合检测沙眼衣原体、淋球菌、生殖道支原体的方法和试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108624704B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114457174A (zh) * | 2022-01-28 | 2022-05-10 | 上海翔琼生物技术有限公司 | 一种检测尿道病原体感染的多重荧光定量探针法pcr试剂盒 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1248295A (zh) * | 1996-11-04 | 2000-03-22 | 感染诊断(I.D.I)公司 | 用于病原体及相关抗生素抗性基因检测以进行诊断的种、属特异性和通用的探针及引物 |
| US20140309136A1 (en) * | 2006-05-29 | 2014-10-16 | Bio-Rad Innovations | Real-time multiplex detection of three bacterial species responsible for sexually transmitted diseases |
| WO2017218938A1 (en) * | 2016-06-16 | 2017-12-21 | Life Technologies Corporation | Novel compositions, methods and kits for microorganism detection |
-
2018
- 2018-06-22 CN CN201810654566.4A patent/CN108624704B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1248295A (zh) * | 1996-11-04 | 2000-03-22 | 感染诊断(I.D.I)公司 | 用于病原体及相关抗生素抗性基因检测以进行诊断的种、属特异性和通用的探针及引物 |
| US20140309136A1 (en) * | 2006-05-29 | 2014-10-16 | Bio-Rad Innovations | Real-time multiplex detection of three bacterial species responsible for sexually transmitted diseases |
| WO2017218938A1 (en) * | 2016-06-16 | 2017-12-21 | Life Technologies Corporation | Novel compositions, methods and kits for microorganism detection |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 张欠欠等: "荧光定量ＰＣＲ检测淋球菌、沙眼衣原体和解脲脲原体结果分析", 《中国人兽共患病学报》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114457174A (zh) * | 2022-01-28 | 2022-05-10 | 上海翔琼生物技术有限公司 | 一种检测尿道病原体感染的多重荧光定量探针法pcr试剂盒 |
| CN114457174B (zh) * | 2022-01-28 | 2023-07-07 | 上海翔琼生物技术有限公司 | 一种检测尿道病原体感染的多重荧光定量探针法pcr试剂盒 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108624704B (zh) | 2021-08-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Takaishi et al. | Imbalance in intestinal microflora constitution could be involved in the pathogenesis of inflammatory bowel disease | |
| Simpson et al. | Application of denaturant gradient gel electrophoresis for the analysis of the porcine gastrointestinal microbiota | |
| Selim et al. | Seroprevalence and molecular characterization of Brucella species in naturally infected cattle and sheep | |
| Cassmann et al. | Alterations of the ileal and colonic mucosal microbiota in canine chronic enteropathies | |
| Machado et al. | Diagnosis of bacterial vaginosis by a new multiplex peptide nucleic acid fluorescence in situ hybridization method | |
| CN107586862B (zh) | 肠道菌群在儿童反复呼吸道感染诊断中的应用 | |
| CN110373485A (zh) | 一种解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌三联检试剂盒 | |
| CN108474037A (zh) | 普氏栖粪杆菌亲缘组i和/或亲缘组ii成员的定量方法及其作为生物标志物的用途 | |
| CN102816847A (zh) | 用于检测布鲁氏菌的lamp引物及含有该引物的试剂盒 | |
| CN102888464B (zh) | 五重荧光pcr快速超敏检测试剂盒及其应用 | |
| CN114774563A (zh) | 一种犬种布鲁氏菌病的检测试剂及应用 | |
| Çetinkaya et al. | The high prevalence of Encephalitozoon intestinalis in patients receiving chemotherapy and children with growth retardation and the validity of real-time PCR in its diagnosis | |
| CN108624704A (zh) | 一种荧光定量pcr探针技术联合检测沙眼衣原体、淋球菌、生殖道支原体的方法和试剂盒 | |
| Chowdhury et al. | Infestation of endometrium by mycobacterium tuberculosis bacilli-cause of reproductive failure | |
| CN107460255A (zh) | 一种检测猪丁型冠状病毒的rt‑lamp引物组、试剂盒及应用 | |
| CN106755462A (zh) | 一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测引物组合物、检测盒及其应用 | |
| Muzny et al. | Association between BVAB1 and high Nugent scores among women with bacterial vaginosis | |
| Nak-On et al. | Multi-detection for paramphistomes using novel manually designed PAR-LAMP primers and its application in a lateral flow dipstick (LAMP-LFD) system | |
| Taylor et al. | Development of a TaqMan PCR assay for the detection of Trypanosoma evansi, the agent of surra | |
| US20100196894A1 (en) | Procedure for the detection of paratuberculosis | |
| Li et al. | Endometrial and vaginal microbiome in donkeys with and without clinical endometritis | |
| Thellin et al. | Four-color multiplex real-time PCR assay prototype targeting azithromycin resistance mutations in Mycoplasma genitalium | |
| CN116121413A (zh) | B群链球菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针 | |
| CN113755618A (zh) | 一种高灵敏度检测动物布鲁氏菌病的方法 | |
| Marrazzo | Molecular characterization of microbes in the female upper genital tract: a valiant quest to “redefine” pelvic inflammatory disease |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |