CN108624673A

CN108624673A - 一种孕妇子痫前期的诊断试剂盒及诊断方法

Info

Publication number: CN108624673A
Application number: CN201810123259.3A
Authority: CN
Inventors: 刘云峰; 田慧艳; 闫蒙; 张立国; 于明娟; 王梅; 邓梓欣; 刘明贤
Original assignee: Hebei Xinkaiyuan Kam And Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Hebei Xinkaiyuan Kam And Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-02-07
Filing date: 2018-02-07
Publication date: 2018-10-09

Abstract

本发明公开了一种孕妇子痫前期的诊断试剂盒及诊断方法，其中，所述试剂盒检测Foxp3的基因多态性位点，包括Foxp3‑6054扩增组和Foxp3‑3279扩增组，其中Foxp3‑6054扩增组包括扩增如序列表SEQ ID NO：1所示Foxp3‑6054片段的特异性引物，Foxp3‑3279扩增组包括扩增如序列表SEQ ID NO：2所示Foxp3‑3279片段的特异性引物。本发明采用多重PCR的方法对Foxp3的基因多态性重要位点Foxp3‑6054位点和Foxp3‑3279位点进行快速扩增检测，检测过程快速，操作简单，扩增体系稳定，扩增产物特异性高，可以快速同时对超过一个的Foxp3基因位点进行扩增检测。

Description

一种孕妇子痫前期的诊断试剂盒及诊断方法

技术领域

本发明涉及一种孕妇子痫前期的诊断试剂盒及诊断方法，属于医疗器械领域。

背景技术

子痫前期是妊娠晚期孕妇特有的多系统紊乱综合征，是世界范围内导致孕产妇和围产儿患病及死亡的重要原因之一。子痫前期的发病机制尚不十分清楚，目前认为其发病机制主要包括遗传缺陷、胎盘微环境的损伤及免疫异常等。三种机制在不同患者中单独或联合作用，导致胎盘功能异常。其中，免疫和遗传学因素越来越引起人们的重视。研究证实，母胎免疫耐受的形成对正常妊娠的维持起重要作用，一旦免疫耐受机制失衡，将导致病理性妊娠如流产、子痫前期等发生，其中CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞在母体对胎儿的耐受方面起着重要作用。

叉头状螺旋转录因子3(forkhead box protein 3，Foxp3)可特异表达于胸腺和外周淋巴组织中天然CD4⁺CD25⁺Treg细胞亚群上，是CD4⁺CD25⁺Treg细胞发育调控机制中的重要开关。Foxp3基因多态性可导致CD4⁺CD25⁺Treg功能改变，并与多种自身免疫性疾病、炎症及肿瘤的发生发展相关，而在子痫前期的发生中，Foxp3基因多态性影响母胎免疫功能及母体胎盘免疫微环境，因此通过对Foxp3基因多态性的检测，可以较为准确的判断被测者子痫前期的易感性，便于在怀孕早期或未孕之前对疾病易感性做出预判，可以最大程度地减少妊娠晚期的紊乱综合症的发生。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得一种孕妇子痫前期的诊断试剂盒及诊断方法。

为实现上述发明目的之一，本发明采用的孕妇子痫前期的诊断试剂盒技术方案如下：

所述试剂盒检测Foxp3基因多态性位点，包括Foxp3-6054扩增组和Foxp3-3279扩增组，其中Foxp3-6054扩增组包括扩增如序列表SEQ ID NO：1所示Foxp3-6054片段的特异性引物，Foxp3-3279扩增组包括扩增如序列表SEQ ID NO：2所示Foxp3-3279片段的特异性引物。

Foxp3基因已被证实与孕妇子痫前期有密切关联，根据对人类Foxp3的基因重要位点进行设计，扩增Foxp3-6054的模板序列在如序列表SEQ ID NO：1所示的范围内，扩增Foxp3-3279的模板序列在如序列表SEQ ID NO：2所示的范围内。特异性扩增Foxp3-6054是上下游引物的基因序列如序列表SEQ ID NO：3和序列表SEQ ID NO：4所示，上游(正向)引物如序列表SEQ ID NO：3所示，下游(反向)引物如序列表SEQ ID NO：4所示。特异性扩增Foxp3-3279是上下游引物的基因序列如序列表SEQ ID NO：5和序列表SEQ ID NO：6所示，上游(正向)引物如序列表SEQ ID NO：5所示，下游(反向)引物如序列表SEQ ID NO：6所示。

本发明中的诊断试剂盒针对孕妇子痫前期的重要协同位点进行同时扩增检测，两个位点的测序结果联合形成检测结果，相比于以往的单基因扩增结果来说，对于临床学的使用价值更大，且更为准确。

同一体系中对两段目的基因同时进行扩增，不仅更加高效准确，并且大大减少了扩增试剂的使用、缩小了扩增体系的体积，高效扩增的同时，满足了绿色节约的需要，降低了扩增成本，为基因测序的广泛普及提供了新思路。

优选的，待扩增的模板DNA为提取自人血样本的人全血模板DNA。

根据现有的样本处理方式，人血样本或口腔拭子居多，这二者一般均采用蛋白酶消化的方式进行DNA提取，提取后的DNA样本用途广泛。本试剂盒一般采用的是消化提取后的DNA模板，由于扩增条件的要求较高，不建议使用市售的全血样品扩增缓冲液直接进行扩增。提取DNA模板的方法或设备可以参考现有技术，在此不做限制。

优选的，Foxp3-6054扩增组和Foxp3-3279扩增组均包括特异性引物、DNA聚合酶、dNTPs和扩增缓冲液。

为了保证试剂盒的扩增效果，扩增试剂盒中还包括DMSO和牛血清蛋白(BSA)，使用时需自备灭菌超纯水。

更优选的，DNA聚合酶为热启动Taq酶。

热启动Taq酶相比于一般的DNA聚合酶使反应体系更加灵敏，可以根据不同温度对不同的片段进行延伸，有效的避免了PCR的非特异性扩增，使本发明中的两重PCR的结果更好，同时也为两重以上的多重PCR提供了一个酶系的优选方案。

本发明的另一个发明目的在于提供一种采用上述快速扩增试剂盒的扩增方法，所述扩增方法采用同一体系中温度梯度扩增多个片段的扩增方法，所述扩增方法在同一体系中扩增Foxp3-6054模板和Foxp3-3279模板，使两段DNA模板变性后在不同温度下退火，其中Foxp3-6054模板先退火，退火完成后Foxp3-3279模板再退火，退火完成后在同一温度下同时延伸。

优选的，扩增条件具体为：初始变性94℃保持5min，94℃变性30s，61℃退火2min，再降温至50℃，退火2min，72℃延伸1min，30个循环。

本扩增方法中的扩增体系具体为25μL体系，其中包括：

模板DNA 150ng；

1×PCR buffer；

Cheetah Taq热启动酶1U；

dNTPs各200μM；

5％DMSO；

Foxp3-6054正向和反向引物各0.4μmol；

Foxp3-3279正向和反向引物各0.4μmol；

1％BSA 0.05μL；以及

灭菌的超纯水补足25μL。

本发明的扩增方法中为了保证扩增结果，在扩增体系中加入了DMSO和BSA，但这两者是可以在一定条件下调整用量或不添加的，添加剂的使用仅为本发明的一种优选的实施方案，不应由于本扩增体系中的DMSO和BSA的存在和用量对本发明的保护范围进行限制。

由于特异性引物的发现及扩增体系的建立，本发明还公开了一孕妇子痫前期诊断试剂盒在孕妇子痫前期诊断中的应用，所述试剂盒用于同时在同一体系中扩增Foxp3基因的Foxp3-6054位点和Foxp3-3279位点。本试剂盒中的扩增的Foxp3-6054基因片段和Foxp3-3279基因片段可以作为基因筛查、疾病易感性、用药指导等多方面的进一步鉴定和诊断依据，对于该基因的研究和临床发展具有重要的意义。

扩增后扩增产物的鉴定和测序等下游实验步骤可参照现有技术进行，在此不做赘述。

与现有技术相比，本发明采用多重PCR的方法对Foxp3的基因多态性重要位点Foxp3-6054位点和Foxp3-3279位点进行快速扩增检测，检测过程快速，操作简单，扩增体系稳定，扩增产物特异性高，可以快速同时对超过一个的Foxp3基因位点进行扩增检测。检测结果不仅可以对单个基因与疾病易感性之间建立联系，并且可以在多个联合基因与疾病易感性之间建立联系，本试剂盒中的检测位点对于子痫前期具有重要的指向作用，本试剂盒的检测不限于妊娠期间，可以在孕前或婚前早期检测，避免了妊娠期间的潜在危险，检测结果可用于多种科研及临床医疗，具有良好的推广价值。

附图说明

图1是本发明提供的扩增产物凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的一种孕妇子痫前期的诊断试剂盒及诊断方法作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。

本发明的试剂盒中包括Foxp3的Foxp3-6054扩增组和Foxp3-3279扩增组，其中Foxp3-6054扩增组和Foxp3-3279扩增组的区别仅在于扩增引物和测序引物的不同。Foxp3-6054扩增组包括：Foxp3-6054扩增引物、DNA聚合酶、扩增缓冲液、dNTPs和Mg²⁺。Foxp3-3279扩增组包括：Foxp3-3279扩增引物、DNA聚合酶、扩增缓冲液、dNTPs和Mg²⁺。Foxp3-6054扩增组和Foxp3-3279扩增组中相同的试剂可以混用，对上述两个位点进行单独扩增检测或同时扩增检测。本发明采用美国MJ Research公司的PTC-255PCR扩增仪进行特异性快速扩增，扩增体系为25μL体系。

本实施例采用经过人血样品DNA提取后进行实验。

一、DNA提取

提取DNA可采用现有技术或市售试剂盒进行，本实施例中的提取步骤如下：

1)取400μL全血于2mL离心管中，加入410μL STE溶液、90μL 10％异丙醇(SDS)溶液及10μL蛋白酶K于离心管中，轻轻摇晃2min混合均勾，置于65℃水浴锅中消化过夜；

2)在充分消化的血样中加入300μL饱和NaCl溶液后，轻轻颠倒混匀；

3)加入400μL氯仿轻摇混勾，20℃，12000rpm离心20min；

4)将上清液移至新的1.5mL离心管中，加入等体积的预冷(-20℃)的异丙醇混合均匀，4℃，12000rpm离心15min，弃掉上清液；

5)加入预冷(-20℃)的75％乙醇溶液与离心管中洗涤沉淀，4℃，12000rpm离心15min，弃掉上清液；

6)重复步骤5)；

7)室温条件下将沉淀晾干，加入100μL Mili-Q水溶解沉淀；

8)取1μL DNA样本，采用1％琼脂糖凝胶电泳对样本的质量进行检测，并釆用紫外可见分光光度计测定样本纯度及浓度；

用Mili-Q水将DNA样本均稀释至10ng/μL备用。

二、引物设计

Foxp3-6054扩增组的目的基因片段如序列表SEQ ID NO：1所示，Foxp3-605.04的rs号为5902434，序列长588bp，第388位为Foxp3-6054的SNP位点，N表示为A/T错配，具体序列如下，序列中下划线处为特异性引物结合位置：

ATGGAGGAGACAGAGATAGGGGAGATGGTCAGAGGCCAGGAGAGATGCGGGGAAAGAGAGTCTGAGTGTAGCGACAGACAGATGGCGGGAGAAAGAGAGGCAGAGAAACATGTAAAAGAGCAAGACAGGGTGAGCAGAGAGACAGAGAAGGATGAGAGGCATCAAGAGCTAAGAGACAAAGAGATGAGAGAGATGCAGTTGAAATTTTCAGTTGCACCTGGACAGCATTTCAAGTTGTTCAAAGCTCTGAAATCCATAAAGACTGGCAGCTGACATATTTTAAAAATCCTATCCATCTACGTATCAATTGATGAATTCATTTATTTTTGCCCCTGCCCATGCATTAAGTACTTCACCTTTAAGTCTTCTGCCATTTATTCTATTATT

N

TTTTTAAAGACCTTACCTGGCTGGAATCACGGTAGCTGGGTACATCCCACTGTACCAGAGGGCCCCTGACCCCCCCGCCGTGCCTACCTCCCTGCCATCTCCTCCAATGGGGCCCACATCTGGTAGGGGAGAGCAGGGACACTCACCTTGGTGAAGTGGACTGACAGAAAAGGATCAGCCTGGCTTGTGGGAAACTGTCA

Foxp3-3279扩增组的目的基因片段如序列表SEQ ID NO：2所示，Foxp3-3279的rs号为376158，序列长401bp，第201位为Foxp3-3279的SNP位点，K表示为G/T错配，具体序列如下，序列中下划线处为特异性引物结合位置：

catgattcaattacctccccctgggtccctcccacaacatgtggggattatgagagctacaattcaagatgagatttgggtggggttacagaaaaccatatcCcagcctctactaataactacaccttaagccatggaggaaataagaaataccactgatgcagtttacagctgaagaaatcatgcatagaccacactac

K

gtatgcattcaggattacagtgaaagtgccctacccagtcaacaccatgggtacattttcaggaaaaagtcctcccctaaaaaaggaagttcaaaaaattggaacaagtgactattatattagatgcacatatatcaatgcaaggatacaagaaacatgaaaaagcaaggaaatatgacacctcccaaataatacaatGC

根据上述基因序列，采用Primer Primer 5软件设计扩增引物和退火引物，引物序列具体如下：

三、多重PCR扩增

本实施例中的两个目的片段的扩增在同一个扩增体系中进行，扩增过程分为两个阶段，根据解链的温度不同，对两段DNA进行同一体系内的扩增。

扩增体系采用的试剂如下：

10×PCR buffer(500mM KCl，100mM Tris-HCl，24℃时pH8.3，15mM MgCl₂)；

Cheetah Taq热启动酶(Biotium公司)；

100mM母液的核苷酸(dNTP)，其中分别含有25mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP；

二甲亚砜(DMSO)、牛血清蛋白(BSA)、引物和模板DNA。

本实施例中的扩增体系为25μL体系，冰浴加样，体系中样品包括：

模板DNA 150ng；

1×PCR buffer；

Cheetah Taq热启动酶1U；

dNTPs各200μM；

5％DMSO；

正向和反向引物各0.4μmol；

1％BSA 0.05μL；

灭菌的超纯水补足25μL。

以Foxp3-6054和Foxp3-3279的目标序列为模板，加入Foxp3-6054和Foxp3-3279的特异性上下游引物，并加入酶系及底物，冰浴构建扩增体系；

以构建好扩增体系后，将扩增体系至于PCR扩增仪中进行快速扩增，扩增条件如下：

初始变性(预变性)，94℃保持5min，94℃变性30s，61℃退火2min，再降温至50℃，退火2min，72℃延伸1min，30个循环。

四、扩增结果验证

扩增结束后，将扩增产物妥善保存，并与单独扩增的Foxp3-6054、Foxp3-3279目标序列进行琼脂糖凝胶电泳，检测扩增结果。单独扩增的Foxp3-6054、Foxp3-3279目标序列与采用如序列表SEQ ID NO：3～6所示的引物，常规扩增体系和扩增条件进行扩增。

在3％琼脂糖凝胶电泳，低电场下，电泳结果如图1所示。图中M表示DNA Marker，条带1为本实施例中的扩增产物，条带2为Foxp3-6054的扩增产物，条带3为Foxp3-3279的扩增产物。

五、扩增结果测序

将本实施例中的扩增结果送检测序，测序结果与预期的序列完全相同，说明扩增体系准确有效。

以300例正常妊娠组及300例子痫前期组为例进行快速扩增，扩增后测序结果如下表1所示：

表1Foxp3基因测序结果

由扩增结果可知，Foxp3-6054的位点中在子痫前期患者中基因型TT频率显著性低于正常妊娠组，Foxp3-3279的位点中各基因型在子痫前期患者和正常妊娠组中无显著差异。由此，待测者Foxp3-6054位点中TT频率的下降可能具有罹患子痫前期的危险性，Foxp3-6054位点可能参与了子痫前期的发生。Foxp3-3279位点的基因多态性不是独立危险因素。

但是根据对300例正常妊娠组及300例子痫前期组的Foxp3-6054位点和Foxp3-3279位点进行综合统计，统计结果如下表2所示：

表2Foxp3基因联合统计结果

由表2可知，Foxp3-6054AA/-3279CC和Foxp3-6054TT/-3279CC联合基因型在子痫前期与正常孕妇间存在显著性差异，提示Foxp3多位点的联合作用可能在子痫前期发生中发挥一定的作用，两个位点的联合基因型可能为子痫前期的易感基因型。

但Foxp3基因的分布存在地域性、种族和民族差异，并且基于检测样本数量的限制，本发明中的检测结果仅作为对本试剂盒的解释说明，并不能够作为子痫前期疾病的诊断标准。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 新开源锦和河北生物科技有限公司

<120> 一种孕妇子痫前期的诊断试剂盒及诊断方法

<130> 2018

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 588

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> gene

<222> (1)..(588)

<223> Foxp3-6054位点基因序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (388)..(388)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 1

atggaggaga cagagatagg ggagatggtc agaggccagg agagatgcgg ggaaagagag 60

tctgagtgta gcgacagaca gatggcggga gaaagagagg cagagaaaca tgtaaaagag 120

caagacaggg tgagcagaga gacagagaag gatgagaggc atcaagagct aagagacaaa 180

gagatgagag agatgcagtt gaaattttca gttgcacctg gacagcattt caagttgttc 240

aaagctctga aatccataaa gactggcagc tgacatattt taaaaatcct atccatctac 300

gtatcaattg atgaattcat ttatttttgc ccctgcccat gcattaagta cttcaccttt 360

aagtcttctg ccatttattc tattattntt tttaaagacc ttacctggct ggaatcacgg 420

tagctgggta catcccactg taccagaggg cccctgaccc ccccgccgtg cctacctccc 480

tgccatctcc tccaatgggg cccacatctg gtaggggaga gcagggacac tcaccttggt 540

gaagtggact gacagaaaag gatcagcctg gcttgtggga aactgtca 588

<210> 2

<211> 401

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> gene

<222> (1)..(401)

<223> Foxp3-3279位点基因序列

<400> 2

catgattcaa ttacctcccc ctgggtccct cccacaacat gtggggatta tgagagctac 60

aattcaagat gagatttggg tggggttaca gaaaaccata tcccagcctc tactaataac 120

tacaccttaa gccatggagg aaataagaaa taccactgat gcagtttaca gctgaagaaa 180

tcatgcatag accacactac kgtatgcatt caggattaca gtgaaagtgc cctacccagt 240

caacaccatg ggtacatttt caggaaaaag tcctccccta aaaaaggaag ttcaaaaaat 300

tggaacaagt gactattata ttagatgcac atatatcaat gcaaggatac aagaaacatg 360

aaaaagcaag gaaatatgac acctcccaaa taatacaatg c 401

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> Foxp3-6054基因正向引物序列

<400> 3

gacagacaga tggcgggaga a 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> Foxp3-6054基因反向引物序列

<400> 4

atggcaggga ggtaggcac 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(18)

<223> Foxp3-3279基因正向引物

<400> 5

accatatccc agcctcta 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> Foxp3-3279基因反向引物

<400> 6

agggcacttt cactgtaatc 20

Claims

1.一种孕妇子痫前期的诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测Foxp3的基因多态性位点，包括Foxp3-6054扩增组和Foxp3-3279扩增组，其中Foxp3-6054扩增组包括扩增如序列表SEQ ID NO：1所示Foxp3-6054片段的特异性引物，Foxp3-3279扩增组包括扩增如序列表SEQ ID NO：2所示Foxp3-3279片段的特异性引物。

2.根据权利要求1所述的孕妇子痫前期的诊断试剂盒，其特征在于，Foxp3-6054的特异性引物的基因序列如序列表SEQ ID NO：3和序列表SEQ ID NO：4所示。

3.根据权利要求1所述的孕妇子痫前期的诊断试剂盒，其特征在于，Foxp3-3279的特异性引物的基因序列如序列表SEQ ID NO：5和序列表SEQ ID NO：6所示。

4.根据权利要求1所述的孕妇子痫前期的诊断试剂盒，其特征在于：Foxp3-6054扩增组和Foxp3-3279扩增组均包括特异性引物、DNA聚合酶、dNTPs和扩增缓冲液。

5.根据权利要求1所述的孕妇子痫前期的诊断试剂盒，其特征在于：Foxp3-6054扩增组和Foxp3-3279扩增组还包括DMSO和/或牛血清蛋白。

6.根据权利要求4所述的孕妇子痫前期的诊断试剂盒，其特征在于：DNA聚合酶为热启动Taq酶。

7.一种采用根据权利要求1～6任一项所述的孕妇子痫前期的诊断试剂盒的诊断方法，其特征在于：所述扩增方法在同一体系中扩增Foxp3-6054模板和Foxp3-3279模板，使两段DNA模板变性后在不同温度下退火，其中Foxp3-6054模板先退火，退火完成后Foxp3-3279模板再退火，退火完成后在同一温度下同时延伸。

8.根据权利要求7所述的孕妇子痫前期的诊断方法，其特征在于，扩增条件具体为：初始变性94℃保持5min，94℃变性30s，61℃退火2min，再降温至50℃，退火2min，72℃延伸1min，30个循环。

9.根据权利要求7所述的孕妇子痫前期的诊断方法，其特征在于，本扩增方法中的扩增体系具体为25μL体系，其中包括：

模板DNA 150ng；

1×PCR buffer；

Cheetah Taq热启动酶1U；

dNTPs各200μM；

Foxp3-6054正向和反向引物各0.4μmol；以及

Foxp3-3279正向和反向引物各0.4μmol。

10.一种孕妇子痫前期诊断试剂盒在孕妇子痫前期诊断中的应用，其特征在于：所述试剂盒用于同时扩增Foxp3基因的Foxp3-6054位点和Foxp3-3279位点。