CN101768589A

CN101768589A - Ipex综合征主效基因foxp3突变基因及其检测方法和试剂盒

Info

Publication number: CN101768589A
Application number: CN201010042067A
Authority: CN
Inventors: 王靖雪; 倪兵; 吴玉章; 贾正才; 田易
Original assignee: Third Military Medical University TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU
Priority date: 2010-01-15
Filing date: 2010-01-15
Publication date: 2010-07-07

Abstract

本发明公开了IPEX综合征主效基因FOXP3突变基因，其第一段内含子区第68869～68872个碱基AAT和第70207个碱基T缺失；该突变基因为临床约30％的IPEX综合征患者的发病机制提供了新的理论依据，有助于临床上开展疑似IPEX综合征患者的筛查工作以及携带该突变基因的父母的筛查工作，便于生育指导和优生优育；同时，该突变基因为IPEX综合征的药物治疗提供了新的靶点，为IPEX综合征的新药研发提供了理论依据；本发明还提供了该FOXP3突变基因的检测方法和检测试剂盒，操作简便、快速，成本低。

Description

IPEX综合征主效基因FOXP3突变基因及其检测方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及一种突变基因，特别涉及IPEX综合征主效基因FOXP3突变基因，还涉及该突变基因的检测方法和检测试剂盒。

背景技术

IPEX综合征(免疫功能失调、多发性内分泌病、肠病及X染色体连锁综合征)是一种危及生命的严重自身免疫性疾病，常导致患者在婴幼儿早期死亡，其发病有明显的家族史。临床症状以严重肠病、I型糖尿病、甲状腺炎、皮肤疾病等为主要特征，病人常死于严重腹泻或严重感染，多发于男性。目前没有特异有效的治疗方式。关于IPEX综合征的研究目前备受关注，但仍然处于收集病例追踪发病机制这一比较初级的阶段。Powell等在1982年首先报道此病，此后数十年间，逐渐有更多的病例被报道。2001年首先在有类似疾病表现的scurfy小鼠中发现FOXP3蛋白的FKH功能域突变是引起IPEX综合征的主要原因，随后在IPEX综合征患者中发现FOXP3基因存在非多态性的突变，突变位点位于FKH功能域内或FKH功能域外或编码框外如第一段内含子中与mRNA剪切相关的调节序列。虽然目前有30％的临床典型IPEX综合征没有找到FOXP3基因的突变(这部分病例因此被称为IPEX样综合征)，并且在IPEX综合征患者中也发现存在其他基因如IL-2受体α链(CD25)的突变，但绝大多数学者仍然倾向于认为FOXP3蛋白功能障碍导致的调节性T细胞功能障碍是IPEX综合征的重要病因。

FOXP3基因(GeneID：50943)位于Xp11.23-q13.3，其编码的FOXP3蛋白属于叉头状/侧翼螺旋(forkhead/winged-helix)转录因子家族，是调节性T细胞发育中的重要转录因子。已知FOXP3蛋白含有多个功能域：FKH功能域、亮氨酸拉链(Leucine zipper)结构域、C2H2锌指结构域和N末端功能域，其中，FKH功能域是该转录因子家族的特征性功能域，通过与靶DNA的特定序列结合，可以抑制基因转录，主要是抑制编码细胞因子的基因转录，从而抑制T细胞过度活化；亮氨酸拉链结构域和C2H2锌指结构域可能是FOXP3蛋白形成同源二聚体或与FOXP1蛋白形成异源二聚体的部位；N末端功能域可能与RoRγt发生相互作用，参与调控Th17细胞的发育。虽然尚需要更进一步的研究来揭示FOXP3蛋白的各种功能域，但可以明确的是FOXP3基因编码框的突变可能会导致FOXP3蛋白的功能改变，从而导致IPEX综合征。

虽然有70％的IPEX综合征病例都发现有FOXP3基因编码框的突变，但临床症状的严重程度与突变基因的类型不具有相关性，即有些具有相同突变的病例，其临床症状却不尽相同，病情的严重程度和预后也不相同，高度提示FOXP3蛋白的功能受损程度可能并不仅仅来源于功能域的受损或是基因编码框的突变。另外，在FOXP3基因编码框没有发生突变的30％病例中发现有FOXP3基因表达的急剧降低，且最近文献报道，仅仅降低了FOXP3基因表达而不是诱导基因突变，在小鼠中就诱发了Scurfy小鼠的类似症状(Wan YY，Nature，2007)，高度提示FOXP3蛋白表达急剧降低可能是IPEX综合征的致病原因。引起FOXP3蛋白表达变化的因素很多，从目前报道来看，有FOXP3基因某些调控序列改变引致，例如第一段内含子中单核苷酸多态性位点(SNP)rs3761548AA的存在可能会降低E47/c-myc与FOXP3基因的结合，导致FOXP3基因转录缺陷，这可能是银屑病的一个易感因素；也有表观遗传控制的因素参与，例如白介素-27(IL-27)和干扰素-γ(IFN-γ)会促进Th1细胞极化，该过程导致STAT1磷酸化，磷酸化的STAT1可以与CD4+T细胞中的近端启动子结合，促进FOXP3蛋白表达。但这些关于FOXP3基因表达调控的机制还需要进一步的基础和临床研究来完善。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种IPEX综合征主效基因FOXP3突变基因；目的之二在于提供一种所述IPEX综合征主效基因FOXP3突变基因的检测试剂盒；目的之三在于提供一种所述IPEX综合征主效基因FOXP3突变基因的检测方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、IPEX综合征主效基因FOXP3突变基因，其第一段内含子区第68869～68872个碱基AAT和第70207个碱基T缺失。

2、所述IPEX综合征主效基因FOXP3突变基因的检测试剂盒，包括用于扩增FOXP3突变基因中包含突变位点在内的部分序列的PCR引物。

进一步，所述PCR引物序列为：

上游引物：5′-cccatccacacatagagcttcag-3′；

下游引物：5′-gagtgaatagtcagtccattatccca-3′；

进一步，还包括下述PCR试剂：高保真DNA聚合酶和PCR缓冲液；

进一步，所述高保真DNA聚合酶为PrimeSTAR^TMDNA聚合酶，所述PCR缓冲液为PrimeSTAR^TM缓冲液；

进一步，还包括下述克隆试剂中的一种或多种：

a.用于将PCR产物由平滑末端转变为三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸粘性末端的DNA聚合酶和PCR缓冲液；

b.克隆用T载体；

c.细菌；

进一步，所述DNA聚合酶为Ex Taq^TM DNA聚合酶，所述PCR缓冲液为Ex Taq^TM缓冲液；所述T载体为pMD 19-T载体；所述细菌为大肠杆菌XL-1blue。

3、所述IPEX综合征主效基因FOXP3突变基因的检测方法，包括以下步骤：

a.采集待测个体的血液标本，提取基因组DNA；

b.以步骤a所得基因组DNA为模板，PCR扩增FOXP3突变基因中包含突变位点在内的部分序列，得PCR产物；

c.将步骤b所得PCR产物纯化后克隆入T载体，再转化细菌，用含有抗生素的抗性平板筛选阳性克隆，经增菌培养后，提取阳性克隆质粒进行测序，将测得序列与GeneID：50943的FOXP3基因序列进行比对，确定是否存在IPEX综合征主效基因FOXP3突变基因。

进一步，步骤b所述PCR扩增方法为：98℃变性10秒钟，68℃退火2分45秒，共30个循环。

本发明的有益效果在于：本发明根据一个临床双胞胎IPEX综合征病例，结合文献报道，证实了FOXP3蛋白表达降低在IPEX综合征的发生中具有一定的实际意义，并获得了能够引起FOXP3蛋白表达降低进而引发IPEX综合征的FOXP3突变基因，从而为临床约30％的IPEX综合征患者的发病机制提供了新的理论依据，有助于临床上开展疑似IPEX综合征患者的筛查工作，以及携带该突变基因的父母的筛查工作，便于生育指导和优生优育；同时，该突变基因为IPEX综合征的药物治疗提供了新的靶点，为IPEX综合征的新药研发提供了理论依据，可根据该基因的突变位点研发相应的药物来达到治疗目的，如寻找不受该突变基因位点影响的一些转录因子，通过调控这些转录因子的表达来增加IPEX综合征患者的FOXP3基因表达，以达到有效治疗IPEX综合征的目的；本发明还提供了该FOXP3突变基因的检测方法和检测试剂盒，操作简便、快速，成本低廉。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1显示了患有IPEX综合征的双胞胎哥哥的FOXP3突变基因的第一段内含子区突变位点附近的核苷酸序列；

图2显示了健康的双胞胎弟弟的FOXP3突变基因的第一段内含子区突变位点附近的部分核苷酸序列。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

一、IPEX综合征主效基因FOXP3突变基因

1、研究对象

约10周龄的双胞胎兄弟：哥哥因不明原因持续发热9天(37.5～38.5℃)伴严重腹泻入院，其腹泻呈现严重的水样泻，体格检查发现明显的肝脾肿大和口周皮肤发红和皲裂，以及脚趾和手指的皮肤脱屑，实验室检查发现IgE、IgM和IgA明显增高，以及C反应蛋白水平增高，补体C3降低，甲状腺功能低下[三碘甲状腺素(T3)和甲状腺素(T4)降低，促甲状腺激素(TSH)水平增高]，甲状腺球蛋白抗体和抗甲状腺微粒体抗体(TMAb)呈阳性，抗dsDNA抗体呈阳性，CD4+/CD8+T细胞比例增高，血糖正常。因为难以区别其严重腹泻症状是由于严重肠道感染还是严重的食物过敏，遂进行广谱抗生素治疗和禁食，广谱抗生素治疗期间伴发了尿路感染和肠道真菌感染，遂停用广谱抗生素，腹泻症状在禁食及广谱抗生素治疗后有部分缓解，但随着进食之后腹泻又再加重，该患者入院2个月后死于肠穿孔，其临床症状呈现典型的IPEX综合征表现；相反，弟弟与其双胞胎哥哥具有完全相同的生活环境和抚养方式，但无任何相似不良症状，目前健康存活；其母亲家族中有男婴在生命早期(1个月内)不明原因死亡的先例。

2、定量聚合酶链式反应(qPCR)检测FOXP3mRNA转录

根据GeneID：50943的FOXP3基因编码序列，设计并合成如下PCR引物：上游引物：5′-aaggaaaggaggatggacg-3′(SEQ ID No.1)；下游引物：5′-caggcaagaca-gtggaaacc-3′(SEQ ID No.2)。分别采集双胞胎兄弟外周血，分离外周血单个核细胞(PBMC)，用Trizol试剂提取细胞总RNA。用PrimeScript^TM逆转录酶(Takara公司)将细胞总RNA中的mRNA逆转录为qPCR专用cDNA，再用上述引物在SYBR Premix Ex Taq^TM DNA聚合酶(Takara公司)作用下进行qPCR，同时设置正常对照(正常同月龄婴儿)，双delta法比较FOXP3mRNA转录差异。逆转录方法为：5×PrimeScript^TM缓冲液2μl，5×PrimeScript^TM逆转录酶0.5μl，50μM的Oligo dT引物0.5μl，100μM的随机引物0.5μl，细胞总RNA 500ng，用无核糖核酸酶(Rnase)的蒸馏水稀释至总体积为10μl；37℃反应15分钟，再85℃反应5秒钟。qPCR方法为：2×SYBR Premix Ex Taq^TMII PCR反应液(含有SYBRPremix Ex Taq^TM DNA聚合酶)12.5μl，逆转录反应液2μl，10μM的上、下游引物各1μl，用灭菌蒸馏水稀释至总体积为25μl；95℃预变性30秒钟；然后95℃变性5秒钟、57.5℃退火30秒钟、72℃延伸20秒钟，共40个循环。

结果：双胞胎兄弟的FOXP3mRNA转录较正常同月龄婴儿低，弟弟为正常同月龄婴儿的9％，哥哥仅有弟弟的11％、为正常同月龄婴儿的1％，表明双胞胎兄弟的FOXP3蛋白表达降低。

2、聚合酶链式反应(PCR)-克隆测序法检测FOXP3突变基因

根据GeneID：50943的FOXP3基因全长序列，设计并合成如下PCR引物：

分别采集双胞胎兄弟外周血，用酚/氯仿法提取基因组DNA。分别采用上述引物，在PrimeSTAR^TM DNA聚合酶(Takara公司)作用下PCR扩增(东胜龙PCR仪，北京东胜创新生物科技有限公司)FOXP3基因片段hFP3D1～hFP3D6(hFP3D1～hFP3D6合起来即为FOXP3基因全长)；PCR方法为：5×PrimeSTAR^TM缓冲液(含有5mM的Mg²⁺)10μl、2.5mM的dNTPs 4μl[dNTPs为三磷酸碱基脱氧核苷酸混合物，由三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP)、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGTP)、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(dCTP)和三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP)各2.5mM组成]、10μM的上、下游引物各1μl、基因组DNA 60ng、2.5U/μl的PrimeSTAR^TM DNA聚合酶0.5μl、用灭菌蒸馏水稀释至总体积为25μl；98℃变性10秒钟，68～70℃退火2分25秒～3分钟(根据扩增片段不同而做相应改变)，共30个循环。将PCR产物进行质量分数为1％的琼脂糖凝胶电泳，采用胶回收试剂盒(Omeaga公司)回收纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作。PrimeSTAR^TM DNA聚合酶为兼具高保真性和高扩增效率的DNA聚合酶，但用其扩增所得的PCR产物为平滑末端，需要将PCR产物两端各添加一个dATP(即末端加“A”)，使平滑末端转变为粘性末端，才能够成功克隆入T载体。PCR产物末端加“A”方法为：10×Ex Taq^TM缓冲液5μl，2.5mM的dATP 4μl，25mM的MgCl₂ 4μl，纯化后的PCR产物30μl，Ex Taq^TM DNA聚合酶(Takara公司)0.25μl，用灭菌蒸馏水稀释至总体积为50μl；72℃延伸30分钟。末端加“A”的PCR产物用PCR产物回收试剂盒(Takara公司)回收纯化，按照试剂盒说明书操作。将纯化后的末端加“A”的PCR产物克隆入pMD 19-T载体(Takara公司)，再转化大肠杆菌XL-1blue感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，挑取阳性克隆单菌落，过夜培养，提取质粒，测序，将测得序列与Genbank登录的正常FOXP3基因序列进行比对，找出突变位点。

结果：双胞胎兄弟的FOXP3基因编码框均没有发生突变，但在第一段内含子区兄弟俩发生不同突变：哥哥第68869～68872个碱基AAT和第70207个碱基T缺失(如图1所示)，弟弟第68869～68872个碱基AAT和第70205～70207个碱基TTT缺失(如图2所示)，由于第一段内含子区是剪切体结合位置，这一区域的突变可能引发FOXP3mRNA剪切错误，经检测发现哥哥PBMC内FOXP3

mRNA的剪切错误约为40％，而弟弟仅为20％，这是导致兄弟俩FOXP3蛋白表达降低，并且哥哥FOXP3蛋白表达进一步降低的重要原因，也是哥哥罹患IPEX综合征的原因；此外，弟弟还在第70675碱基处出现SNP rs5952521[A/C]，这可能增强了弟弟的FOXP3蛋白表达，使其免于罹患IPEX综合征。鉴于双胞胎兄弟有很相似的遗传背景和相同的生活环境，但是包含FOXP3基因的X染色体可能恰好分别遗传自母亲两条不同的染色体，因此，FOXP3基因本身的突变很可能直接引起两兄弟不同的表型。

综合上述研究结果，兄弟俩的FOXP3基因编码框没有发生突变即FOXP3蛋白的功能域没有发生突变，但FOXP3mRNA转录较正常同月龄婴儿急剧降低，高度提示FOXP3蛋白表达急剧降低会导致IPEX综合征的发生，这与文献报道的其他病例和动物模型研究结果一致。同时，根据上述研究结果，FOXP3基因发生如下突变：第一段内含子区第68869～68872个碱基AAT和第70207个碱基T缺失，能够引起FOXP3蛋白表达急剧降低进而引发IPEX综合征。

二、IPEX综合征主效基因FOXP3突变基因的检测试剂盒

由以下试剂组成：

①用于扩增FOXP3突变基因中包含突变位点在内的部分序列的PCR引物：

上游引物：5′-cccatccacacatagagcttcag-3′(SEQ ID No.3)；

下游引物：5′-gagtgaatagtcagtccattatccca-3′(SEQ ID No.4)；

②2.5U/μl的PrimeSTAR^TM DNA聚合酶和5×PrimeSTAR^TM缓冲液(含有5mM的Mg²⁺)；

③Ex Taq^TM DNA聚合酶和10×Ex Taq^TM缓冲液；

④pMD 19-T载体；

⑤大肠杆菌XL-1blue。

二、IPEX综合征主效基因FOXP3突变基因的检测方法

包括以下步骤：

a.采集待测个体的外周血，提取基因组DNA；

b.以步骤a所得基因组DNA为模板，PCR扩增FOXP3突变基因包含突变位点在内的部分序列，得PCR产物；PCR扩增方法为：5×PrimeSTAR^TM缓冲液(含有5mM的Mg²⁺)10μl、2.5mM的dNTPs 4μl、10μM的上、下游引物各1μl、基因组DNA 60ng、2.5U/μl的PrimeSTAR^TM DNA聚合酶0.5μl、用灭菌蒸馏水稀释至总体积为25μl；98℃变性10秒钟，68℃退火2分45秒，共30个循环；

c.将步骤b所得PCR产物纯化后进行末端加“A”：10×Ex Taq^TM缓冲液5μl，2.5mM的dATP 4μl，25mM的MgCl₂ 4μl，纯化后的PCR产物30μl，Ex Taq^TM DNA聚合酶0.25μl，用灭菌蒸馏水稀释至总体积为50μl；72℃延伸30分钟；末端加“A”的PCR产物经纯化后克隆入pMD 19-T载体，再转化大肠杆菌XL-1blue感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，挑取阳性克隆单菌落，过夜培养，提取质粒，测序，将测得序列与GeneID：50943的FOXP3基因序列进行比对，确定是否存在本发明所述的FOXP3突变基因。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>IPEX综合征主效基因FOXP3突变基因及其检测方法和试剂盒

<160>14

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增FOXP3基因的上游引物

<400>1

aaggaaagga ggatggacg 19

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增FOXP3基因的下游引物

<400>2

caggcaagac agtggaaacc 20

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增FOXP3基因片段hFP3D1的上游引物

<400>3

cccatccaca catagagctt cag 23

<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增FOXP3基因片段hFP3D1的下游引物

<400>4

gagtgaatag tcagtccatt atccca 26

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增FOXP3基因片段hFP3D2的上游引物

<400>5

tgggataatg gactgactat tcactc 26

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增FOXP3基因片段hFP3D2的下游引物

<400>6

agggagatga gtgtgagaat ccag 24

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增FOXP3基因片段hFP3D3的上游引物

<400>7

ctggattctc acactcatct ccct 24

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增FOXP3基因片段hFP3D3的下游引物

<400>8

catacctggt gcatgaaatg tgg 23

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增FOXP3基因片段hFP3D4的上游引物

<400>9

ccacatttca tgcaccaggt atg 23

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增FOXP3基因片段hFP3D4的下游引物

<400>10

aggacctgaa tgtgaggtta ggttc 25

<210>11

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增FOXP3基因片段hFP3D5的上游引物

<400>11

ggaacctaac ctcacattca ggtcc 25

<210>12

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增FOXP3基因片段hFP3D5的下游引物

<400>12

cagcatgagg ggtcacattt gag 23

<210>13

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增FOXP3基因片段hFP3D6的上游引物

<400>13

ctcaaatgtg acccctcatg ct 22

<210>14

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增FOXP3基因片段hFP3D6的下游引物

<400>14

cgtgagatac acaggtgaat tctaacag 28

Claims

1.IPEX综合征主效基因FOXP3突变基因，其特征在于：第一段内含子区第68869～68872个碱基AAT和第70207个碱基T缺失。

2.权利要求1所述IPEX综合征主效基因FOXP3突变基因的检测试剂盒，其特征在于：包括用于扩增FOXP3突变基因中包含突变位点在内的部分序列的PCR引物。

3.根据权利要求2所述IPEX综合征主效基因FOXP3突变基因的检测试剂盒，其特征在于：所述PCR引物序列为：

上游引物：5′-cccatccacacatagagcttcag-3′；

下游引物：5′-gagtgaatagtcagtccattatccca-3′。

4.根据权利要求2所述IPEX综合征主效基因FOXP3突变基因的检测试剂盒，其特征在于：还包括下述PCR试剂：高保真DNA聚合酶和PCR缓冲液。

5.根据权利要求4所述IPEX综合征主效基因FOXP3突变基因的检测试剂盒，其特征在于：所述高保真DNA聚合酶为PrimeSTAR^TM DNA聚合酶，所述PCR缓冲液为PrimeSTAR^TM缓冲液。

6.根据权利要求2所述IPEX综合征主效基因FOXP3突变基因的检测试剂盒，其特征在于：还包括下述克隆试剂中的一种或多种：

b.克隆用T载体；

c.细菌。

7.根据权利要求6所述IPEX综合征主效基因FOXP3突变基因的检测试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶为Ex Taq^TM DNA聚合酶，所述PCR缓冲液为Ex Taq^TM缓冲液；所述T载体为pMD 19-T载体；所述细菌为大肠杆菌XL-1blue。

8.权利要求1所述IPEX综合征主效基因FOXP3突变基因的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

a.采集待测个体的血液标本，提取基因组DNA；

9.根据权利要求8所述IPEX综合征主效基因FOXP3突变基因的检测方法，其特征在于：步骤b所述PCR扩增方法为：98℃变性10秒钟，68℃退火2分45秒，共30个循环。