CN108611424B - 鲤科鱼类线粒体基因组全序列扩增引物及扩增方法 - Google Patents

鲤科鱼类线粒体基因组全序列扩增引物及扩增方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鲤科鱼类全基因组序列的扩增引物，包括3组分别用于扩增粒体基因组3个长片段序列的外引物和内引物，以及1对测序引物。利用该扩增引物可获得鲤科鱼类的线粒体全基因组序列，为鲤科鱼类的保护遗传学、进化遗传学及物种的分子鉴定提供物质基础。本发明还公开了一种鲤科鱼类线粒体全基因组的扩增方法，该方法简便、高效、快捷，且省时、省力更省钱。

Description

鲤科鱼类线粒体基因组全序列扩增引物及扩增方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及鲤科鱼类线粒体基因组全序列扩增引物及扩增方法。
背景技术
线粒体DNA(mtDNA)是线粒体内的遗传物质，是细胞内相对独立的基因组。与核DNA相比，mtDNA具有分子较小、结构简单、呈母系遗传，并且具有较高的突变率，突变固定后形成的DNA多态性位点可以反映出群体遗传特征、种群分化和种属关系等。鱼类mtDNA同其他脊椎动物的mtRNA一样，呈共价闭合环状，是细胞核外具自主复制、转录和翻译能力的遗传因子。鱼类mtDNA主要包括37个编码基因(13个疏水蛋白基因、2个rRNA基因、22个tRNA编码基因)、1个负责复制和转录起始的控制区(D-loop)和1个轻链复制起始区。由于mtDNA的上述特点，以mtDNA作为分子标记，探讨鱼类的群体遗传结构与系统演化，已成为鱼类分子群体遗传学和系统学研究中的热点。
鲤科(Cyprinidae)是世界现生鱼类中最大的一个科，约有210属2010种。它们广泛分布在欧亚大陆、东印度群岛、非洲和北美。鲤科鱼类物种丰度最大的地区是东亚，在中国就有122属600多种，因此鲤科鱼类是研究进化生物学的绝好材料。由于巨大的物种数量，要为鲤科鱼类建立一个完整的系统发育系统是非常困难的。鲤科鱼类的分类从1817年Cuvier建立以来就不断地得到修订和重排，众多学者根据形态、骨骼特征将鲤科鱼类分为不同的亚科。
传统的依据形态特征推论系统发生关系事实上有一定的局限性，其中一个明显弊端就是很难排除可能受到趋同适应的干扰。近年来，基于线粒体基因组序列的分子系统学逐渐成为鲤科鱼类系统发育研究中的一个热点和发展趋势。例如，赖瑞芳等利用线粒体基因组全序列对4种鲂属鱼类进行了系统发育分析。目前，已有约500种鲤科鱼类公布了线粒体全基因组序列，但仍有1500多种鲤科鱼类线粒体基因组序列未知。因此，获得更多种类的鲤科鱼类线粒体基因组全序列已经成为研究鲤科鱼类系统发育学研究的迫切需求。
目前，鱼类线粒体基因组全序列的获取方法主要有两种。第一种是根据已公布的亲缘关系较近的物种的线粒体全基因组序列设计并筛选特异性引物对特定的物种线粒体基因组进行扩增，例如中国专利名称为一种大黄鱼线粒体全基因组序列的扩增引物及其应用(申请号CN102776183A)应用16对特异性引物对大黄鱼的线粒体全基因组序列进行了扩增，该方法的优势是引物特异性高，缺点是只能针对单一目标物种；而当需要获得多种鱼类线粒体全基因组序列时，则需要分别根据其亲缘关系较近物种设计引物，费时、费力。第二种是基于高通量测序技术获得线粒体全序列，采用该方法的前提是获得纯化的鱼类线粒体，该步骤难度大，对样品、试剂和操作要求高，成功的概率较低；而且高通量测序费用高昂，不适合用于多个物种的线粒体基因组序列测定；此外，由于高通量测序技术的原理是将DNA打断后加接头再进行拼接，经常出现所获取的序列不能拼接成完整的环状mtDNA。
综合以上现状，开发一种能够简便、高效、快捷地扩增鲤科鱼类的粒体全基因组序列的方法，省时、省力更省钱。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种通用、高效的扩增鱼类线粒体全基因组的扩增引物，利用该扩增引物可获得鲤科鱼类的线粒体全基因组序列，为鲤科鱼类的保护遗传学、进化遗传学及物种的分子鉴定提供物质基础。
本发明的目的之二是提供一种鲤科鱼类线粒体全基因组的扩增方法，该方法简便、高效、快捷，且省时、省力更省钱。
本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种鲤科鱼类全基因组序列的扩增引物，包括一对用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组三个长片段1序列的外引物和内引物，一对用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组三个长片段2序列的外引物和内引物，一对用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组三个长片段3序列的外引物和内引物，以及一对测序引物，具体如下：
(1)用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段1序列的外引物包括：
正向引物为Li1-F1，其序列如SEQ ID NO：1所示；
反向引物为Li1-R1，其序列如SEQ ID NO：2所示；
(2)用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段1序列的内引物包括：
正向引物为Li1-F2，其序列如SEQ ID NO：3所示；
反向引物为Li1-R2，其序列如SEQ ID NO：4所示；
(3)用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段2序列的外引物包括：
正向引物为Li2-F1，其序列如SEQ ID NO：5所示；
反向引物为Li2-R1，其序列如SEQ ID NO：6所示；
(4)用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段2序列的内引物包括：
正向引物为Li2-F2，其序列如SEQ ID NO：7所示；
反向引物为Li2-R2，其序列如SEQ ID NO：8所示；
(5)用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段3序列的外引物包括：
正向引物为Li3-F1，其序列如SEQ ID NO：9所示；
反向引物为Li3-R1，其序列如SEQ ID NO：10所示；
(6)用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段3序列的内引物包括：
正向引物为Li3-F2，其序列如SEQ ID NO：11所示；
反向引物为Li3-R2，其序列如SEQ ID NO：12所示；
(7)鲤科鱼类线粒体基因组片段序列测序引物包括：
正向引物为Li-ceF，其序列如SEQ ID NO：13所示；
反向引物为Li-ceR，其序列如SEQ ID NO：14所示。
其中序列中的r为简并碱基，代表a和g的混合碱基位点；序列中的y为简并碱基，代表c和t的混合碱基位点；序列中的k为简并碱基，代表g和t的混合碱基位点；序列中的n为简并碱基，代表a、c、g和t的混合碱基位点；序列中的b为简并碱基，代表c、g和t的混合碱基位点。
本发明通过从GenBank中搜索鲤科鱼类共134属鱼类的线粒体全基因组序列，进行同源性比较，寻找保守序列，根据巢式PCR引物设计原则，设计第一轮PCR简并引物和第二轮PCR简并引物(巢式引物)。并设计一对不与线粒体基因组特异性结合的测序引物，分别锚定巢式引物的5’末端。
具体地，本发明的鲤科鱼类全基因组序列的扩增引物，包括上述6对嵌套引物和1对测序引物，该6对嵌套引物分别为鲤科鱼类线粒体基因组片段1序列扩增外引物、鲤科鱼类线粒体基因组片段1序列扩增内引物、鲤科鱼类线粒体基因组片段2序列扩增外引物、鲤科鱼类线粒体基因组片段2序列扩增内引物、鲤科鱼类线粒体基因组片段3序列扩增外引物和鲤科鱼类线粒体基因组片段3序列扩增内引物。
具体地，本发明的鲤科鱼类全基因组序列的扩增引物，包括6对嵌套引物和1对测序引物，引物序列分别如下所示：
(1)鲤科鱼类线粒体基因组片段1序列扩增外引物
正向引物为Li1-F1:5’-chacnytngcngaaachaayc-3’
反向引物为Li1-R1:5’-acrtcdacraartgtcartatca-3’
(2)鲤科鱼类线粒体基因组片段1序列扩增内引物
正向引物为Li1-F2:
5’-agtcgtcgttcccagtcgtctggcttyaaygthgartatgchgg-3’，
反向引物为Li1-R1:
5’-ttgagcacagtcccactagcctcgnayratrtcdcgycatc-3’
(3)鲤科鱼类线粒体基因组片段2序列扩增外引物
正向引物为Li2-F1:5’-cthytaagcctntayytrcaagaa-3’
反向引物为Li2-R1:5’-ctycrryntycgghttacaarrc-3’
(4)鲤科鱼类线粒体基因组片段2序列扩增内引物
正向引物为Li2-F2:
5’-agtcgtcgttcccagtcgtcttaatggcccaycaagcaca-3’,
反向引物为Li2-R2:
5’-ttgagcacagtcccactagctcdacdggyatdccbccrattc-3’
(5)鲤科鱼类线粒体基因组片段3序列扩增外引物
正向引物为Li3-F1:5’-gryttgaaraaccaycgttgt-3’
反向引物为Li3-R1:5’-gygggtgrtrntgttgbgcyat-3’
(6)鲤科鱼类线粒体基因组片段3序列扩增内引物
正向引物为Li3-F2:
5’-agtcgtcgttcccagtcgtctcthccvtgaggvcaaatrtc-3’,
反向引物为Li3-R2:
5’-ttgagcacagtcccactagcaagcachnagagttttgakctc-3’
(7)鲤科鱼类线粒体基因组片段序列测序引物
正向引物为Li-ceF:5’-agtcgtcgttcccagtcgtct-3’
反向引物为Li-ceR:5’-ttgagcacagtcccactagc-3’。
其中序列中的r为简并碱基，代表a和g的混合碱基位点；序列中的y为简并碱基，代表c和t的混合碱基位点；序列中的k为简并碱基，代表g和t的混合碱基位点；序列中的n为简并碱基，代表a、c、g和t的混合碱基位点；序列中的b为简并碱基，代表c、g和t的混合碱基位点。
本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：一种鲤科鱼类线粒体全基因组的扩增方法，包括以下步骤：
(1)选取鲤科鱼类，提取其全基因组DNA，以全基因组DNA为模板，用外引物进行第一轮PCR扩增，获得长度较长的PCR产物；
(2)然后以第一轮PCR产物为模板，用内引物进行第二轮PCR扩增，获得长度较短的目标基因片段；
(3)对第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目标片段，利用鲤科鱼类线粒体基因组片段序列测序引物进行序列测定。
进一步的，该扩增方法采用巢氏PCR技术，首先以全基因组DNA为模板，用第一轮PCR引物(分别为Li1-F1与Li1-R1；Li2-F1与Li2-R1；Li3-F1与Li3-R1)获得长度较长的PCR产物，主要目的为富集目标基因片段；然后以第1轮PCR产物为模板，用5’末端含有测序引物的第2轮引物(分别为Li1-F2与Li1-R2；Li2-F2与Li2-R2；Li3-F2与Li3-R2)进行PCR扩增，获得长度较短的目标基因片段。对第2轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目标片段可以直接利用本发明中的测序引物(Li-ceF与Li-ceR)进行序列测定。
在该鲤科鱼类线粒体全基因组的扩增方法中：
步骤(1)中外引物为用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段1序列外引物、用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段2序列外引物和用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段3序列外引物；步骤(2)中所述的内引物为用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段1序列内引物、用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段2序列内引物和用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段3序列内引物。
步骤(1)中第一轮PCR扩增时反应体系的总体积为25μL，其中10×Trans Taqbuffer I 2.5μL，浓度为2.5mM的dNTPs 2.0μL，浓度为10μM的正反引物各1.0μL，长片段扩增Taq酶0.5μL，DNA模板1μL，ddH2O 17.0μL。
步骤(1)中第一轮PCR扩增反应条件为：94℃预变性1min；94℃变性30s，45～55℃退火30s，72℃延伸7min，30个循环；最后72℃延伸10min。
步骤(2)中第二轮PCR扩增时反应体系的总体积为50μL，其中10×Trans Taqbuffer II 5.0μL，浓度为2.5mM的dNTPs 4.0μL，浓度为10μM正反游引物各2.0μL，长片段扩增Taq酶1.0μL，DNA模板1μL，ddH2O 35.0μL。
步骤(2)中第二轮PCR扩增反应条件为：94℃预变性45s；94℃变性30s，50～60℃退火30s，72℃延伸6min，35个循环；最后72℃延伸10min。
步骤(2)以第一轮PCR产物稀释50倍后作为第二轮引物进行PCR扩增的模板。
本发明具有以下优点：本发明开发了一种能够通用、简便、高效、快捷地扩增鲤科鱼类的粒体全基因组引物序列及扩增方法，省时、省力更省钱。
附图说明
图1是实施例1-2中采用本发明所述的鱼类线粒体基因组全序列扩增引物对珠江流域的12个亚科的12种鲤科鱼类进行PCR扩增，获得正确的目的片段的电泳图，其中A-K分别指：海南似鱎、赤眼鳟、鲫、南方鳅鮀、南方白甲鱼、马口鱼、黄尾鲴、鲢、银鮈、鲮、彩石鳑鮍和细鳞裂腹鱼；①②③分别指粒体基因组片段1、2和3；
图2是实施例2中海南似鱎的测序结果图；
图3是实施例2中赤眼鳟的测序结果图；
图4是实施例2中鲫的测序结果图；
图5是实施例2中南方鳅鮀的测序结果图；
图6是实施例2中南方白甲鱼的测序结果图；
图7是实施例2中马口鱼的测序结果图；
图8是实施例2中黄尾鲴的测序结果图；
图9是实施例2中鲢的测序结果图；
图10是实施例2中银鮈的测序结果图；
图11是实施例2中鲮的测序结果图；
图12是实施例2中彩石鳑鮍的测序结果图；
图13是实施例2中细鳞裂腹鱼的测序结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。
实施例1
鲤科鱼类线粒体全基因组序列的扩增引物的设计方法
一、引物设计模板的筛选
登陆NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站，搜索已具有线粒体基因组全序列的鲤科鱼类，搜索获得382种鲤科鱼类，隶属于134属，每属选择1个物种，下载得到134个物种的线粒体基因组全序列，作为引物设计的模板。
二、根据模板序列设计引物
采用MegAlign软件将筛选得到的134个物种的线粒体基因组全序列进行序列比对，寻找相对保守的区域，可以将线粒体基因组全序列分为3个长度为5000-7000bp的有重叠的长片段(片段1、片段2和片段3)，然后利用PrimerPremiers 5.0软件设计用于扩增这3个长片段的巢氏PCR引物。两轮PCR引物均为简并引物，其中第二轮引物的5’末端有一段特异序列，该特异序列用作通用测序引物对第二轮所扩增的片段核酸序列进行直接测序。
鲤科鱼类线粒体全基因组序列的巢氏PCR扩增引物为3套6对，测序通用引物1对。
所设计的巢氏PCR扩增引物的扩增产物应覆盖整个线粒体全基因组，每对引物的扩增产物长度在5000-7000bp，且扩增相邻个片段获得的序列重叠在100bp以上。
引物序列如表1所示：
表1：鲤科鱼类线粒体基因组全序列扩增引物
Figure BDA0001635177160000071
Figure BDA0001635177160000081
采用本发明所述的鱼类线粒体基因组全序列扩增引物对珠江流域的12个亚科的12种鲤科鱼类进行PCR扩增，均能获得正确的目的片段(图1)，从而快速获得其线粒体基因组的全序列。从而为我国鲤科鱼类的种类鉴定、系统分析和种质资源评估提供一个有力的工具。
所涉及的12种鲤科鱼类分别属于12个亚科的物种，它们为：鲌亚科似鱎属的海南似鱎(Toxabramis houdermeri)；雅罗鱼亚科赤眼鳟属的赤眼鳟(SpualiobarbusCurriculus)；鲤亚科鲫属的鲫(Carassius auratus)，鳅鮀亚科鳅鮀属的南方鳅鮀(Gobiobotia meridionalis)，鲃亚科，白甲鱼属的南方白甲鱼(Onychostoma gerlachi)，(鱼丹)亚科马口鱼属马口鱼(Opsariichthys bidens),鲴亚科鲴属的黄尾鲴(Xenocyprisdavidi)，鲢亚科鲢属的鲢(Hypophthalmichthys molitrix)，鮈亚科银鮈属的银鮈(Squalidus argentatus)，野鲮亚科鲮属的鲮(Cirrhinus molitorella)，鳑鲏亚科鳑鲏属的彩石鳑鮍(Rhodeus lighti)，裂腹鱼亚科裂腹鱼属的细鳞裂腹鱼(Schizothoraxchongi)。
实施例2
本实施例提供的鲤科鱼类线粒体全基因组的扩增方法，包括以下步骤：
(1)12种鲤科鱼类全基因组DNA的提取
1.1采集野生海南似鱎、赤眼鳟、鲫、南方鳅鮀、南方白甲鱼、马口鱼、黄尾鲴、鲢、银鮈、鲮、彩石鳑鮍、细鳞裂腹鱼各1尾，取鱼体背部肌肉速冻于液氮，然后转移至-80度冰箱待提取基因组DNA。
1.2采用TIANamp Genomic DNA Kit提取肌肉基因组DNA，用核酸蛋白测定仪对DNA样品的浓度和纯度进行测定，并取3μL DNA于1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，检测合格后，分装并保存于-20℃。
2.线粒体全长序列扩增
2.1引物设计和PCR扩增
扩增线粒体全长序列的扩增引物见实施例1。
PCR反应的模板DNA浓度为100ng，第一轮反应体系总体积为25μL，其中10×TransTaq buffer I 2.5μL，dNTPs 2.0μL(2.5mM)，正反引物各1.0μL(10μM)，长片段扩增Taq酶0.5μL，DNA模板1μL，ddH2O 17.0μL。
PCR反应条件为：94℃预变性1min；94℃变性30s，45～55℃退火30s，72℃延伸7min，30个循环；最后72℃延伸10min。
第一轮PCR产物稀释50倍后作为第二轮PCR模板。
第二轮PCR体系总体积为50μL，其中10×Trans Taq buffer II 5.0μL，dNTPs4.0μL(2.5mM)，正反引物各2.0μL(10μM)，长片段扩增Taq酶1.0μL，DNA模板1μL，ddH2O 35.0μL。
PCR反应条件为：94℃预变性45s；94℃变性30s，50～60℃退火30s，72℃延伸6min，35个循环；最后72℃延伸10min。
可扩增鲤科鱼类的线粒体基因组PCR反应体系和目标片段长度如下表2：
表2鲤科鱼类线粒体基因组扩增PCR反应条件和目标片段长度
Figure BDA0001635177160000091
*巢氏PCR中第二轮反应的模板均为第一轮PCR产物的50倍稀释液。
2.2克隆和测序
第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(如图1所示)，采用TIANgel MidiPurification Kit切胶回收目标片段，将纯化后的PCR产物送测序公司进行双向测序，测序引物为本发明中的通用测序引物。
2.3序列拼接和结构分析
将测序结果采用DNAman软件进行序列拼接，获得12种鱼线粒体全基因组序列，然后与鱼类粒体全基因组序列进行比对分析，并采用相关软件进行结构分析。
2.3.1海南似鱎(Toxabramis houdermeri)线粒体全长16,618bp，重链碱基所占比例为：30.79％A,16.61％G,27.29％C，25.31％T。由13个蛋白编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和一个D-loop区所构成，如图2示。
赤眼鳟(Spualiobarbus Curriculus)线粒体全长16,622bp，重链碱基所占比例为：31.15％A,16.38％G,28.10％C,24.49％T。由13个蛋白编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和一个D-loop区所构成，如图3所示。
鲫(Carassius auratus)线粒全长16,584bp，重链碱基所占比例为：31.54％A,16.05％G,26.61％C,25.79％T。由13个蛋白编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和一个D-loop区所构成，如图4所示。
南方鳅鮀(Gobiobotia meridionalis)，线粒体全长16,612bp，重链碱基所占比例为：28.72％A,18.44％G,26.73％C,26.11％T。由13个蛋白编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和一个D-loop区所构成，如图5所示。
南方白甲鱼(Onychostoma gerlachi)线粒体全长16,609bp，重链碱基所占比例为：31.41％A,16.10％G,28.38％C,24.11％T。由13个蛋白编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和一个D-loop区所构成，如图6所示。
马口鱼(Opsariichthys bidens)线粒体全长16,624bp，重链碱基所占比例为：27.18％A,19.02％G,27.21％C,26.59％T。由13个蛋白编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和一个D-loop区所构成，如图7所示。
黄尾鲴(Xenocypris davidi)线粒体全长16,625bp，重链碱基所占比例为：31.05％A,16.23％G,27.24％C,25.48％T。由13个蛋白编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和一个D-loop区所构成，如图8所示。
鲢(Hypophthalmichthys molitrix)线粒体全长16,608bp，重链碱基所占比例为：31.65％A,15.85％G,26.89％C,25.61％T。由13个蛋白编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和一个D-loop区所构成，如图9所示。
银鮈(Squalidus argentatus)线粒体全长16,622bp，重链碱基所占比例为：30.17％A,16.76％G,27.32％C,25.76％T。由13个蛋白编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和一个D-loop区所构成，如图10所示。
鲮(Cirrhinus molitorella)线粒体全长16,623bp，重链碱基所占比例为：32.52％A,15.32％G,27.45％C,24.70％T。由13个蛋白编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和一个D-loop区所构成，如图11所示。
彩石鳑鮍(Rhodeus lighti)线粒体全长16,655bp，重链碱基所占比例为：28.80％A,17.45％G,26.56％C,27.19％T。由13个蛋白编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和一个D-loop区所构成，如图12所示。
细鳞裂腹鱼(Schizothorax chongi)线粒体全长16,597bp，重链碱基所占比例为：29.59％A,17.65％G,27.44％C,25.32％T。由13个蛋白编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和一个D-loop区所构成，如图13所示。
本发明不局限于上述特定的实施方案范围内，上述实施方案仅仅是为了能够对本发明的使用过程进行详细地说明，而且有相等功能的生产方法和技术细节也属于本发明内容的一部分。事实上，本领域技术人员根据前文的描述，就能够根据各自需要找到不同的调整方案，这些调整都应在本文所附的权利要求书的范围内。
序列表
<110> 中国水产科学研究院南海水产研究所
<120> 鲤科鱼类线粒体基因组全序列扩增引物及扩增方法
<150> 2018100072012
<151> 2018-01-04
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
chacnytngc ngaaachaay c 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acrtcdacra artgtcarta tca 23
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agtcgtcgtt cccagtcgtc tggcttyaay gthgartatg chgg 44
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttgagcacag tcccactagc ctcgnayrat rtcdcgycat c 41
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cthytaagcc tntayytrca agaa 24
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctycrrynty cgghttacaa rrc 23
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agtcgtcgtt cccagtcgtc ttaatggccc aycaagcaca 40
<210> 8
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttgagcacag tcccactagc tcdacdggya tdccbccrat tc 42
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gryttgaara accaycgttg t 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gygggtgrtr ntgttgbgcy at 22
<210> 11
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agtcgtcgtt cccagtcgtc tcthccvtga ggvcaaatrt c 41
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttgagcacag tcccactagc aagcachnag agttttgakc tc 42
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agtcgtcgtt cccagtcgtc t 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ttgagcacag tcccactagc 20

Claims (7)

1.一种鲤科鱼类全基因组序列的扩增引物，其特征是：包括用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组三个长片段中片段1的外引物和内引物各一对，用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组三个长片段中片段2的外引物和内引物各一对，用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组三个长片段中片段3的外引物和内引物各一对，以及一对测序引物，具体如下：
(1)用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段1的外引物包括：
正向引物为Li1-F1，其序列如SEQ ID NO：1所示；
反向引物为Li1-R1，其序列如SEQ ID NO：2所示；
(2)用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段1的内引物包括：
正向引物为Li1-F2，其序列如SEQ ID NO：3所示；
反向引物为Li1-R2，其序列如SEQ ID NO：4所示；
(3)用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段2的外引物包括：
正向引物为Li2-F1，其序列如SEQ ID NO：5所示；
反向引物为Li2-R1，其序列如SEQ ID NO：6所示；
(4)用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段2的内引物包括：
正向引物为Li2-F2，其序列如SEQ ID NO：7所示；
反向引物为Li2-R2，其序列如SEQ ID NO：8所示；
(5)用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段3的外引物包括：
正向引物为Li3-F1，其序列如SEQ ID NO：9所示；
反向引物为Li3-R1，其序列如SEQ ID NO：10所示；
(6)用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段3的内引物包括：
正向引物为Li3-F2，其序列如SEQ ID NO：11所示；
反向引物为Li3-R2，其序列如SEQ ID NO：12所示；
(7)鲤科鱼类线粒体基因组片段测序引物包括：
正向引物为Li-ceF，其序列如SEQ ID NO：13所示；
反向引物为Li-ceR，其序列如SEQ ID NO：14所示；
其中序列中的r为简并碱基，代表a和g的混合碱基位点；序列中的y为简并碱基，代表c和t的混合碱基位点；序列中的k为简并碱基，代表g和t的混合碱基位点；序列中的n为简并碱基，代表a、c、g和t的混合碱基位点；序列中的b为简并碱基，代表c、g和t的混合碱基位点。
2.一种鲤科鱼类线粒体全基因组的扩增方法，其特征是包括以下步骤：
(1)选取鲤科鱼类，提取其全基因组DNA，以全基因组DNA为模板，用外引物进行第一轮PCR扩增，获得长度较长的PCR产物；
(2)然后以第一轮PCR产物为模板，用内引物进行第二轮PCR扩增，获得长度较短的目标基因片段；
(3)对第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目标片段，利用鲤科鱼类线粒体基因组片段序列测序引物进行序列测定；
步骤(1)中所述外引物为权利要求1中的用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段1的外引物、用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段2的外引物和用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段3的外引物；步骤(2)中所述的内引物为权利要求1中的用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段1的内引物、用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段2的内引物和用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段3的内引物。
3.根据权利要求2所述的鲤科鱼类线粒体全基因组的扩增方法，其特征是：步骤(1)中第一轮PCR扩增时反应体系的总体积为25μL，其中10×Trans Taq buffer I 2.5μL，浓度为2.5mM的dNTPs 2.0μL，浓度为10μM的正反引物各1.0μL，长片段扩增Taq酶0.5μL，DNA模板1μL，ddH 2 O 17.0μL。
4.根据权利要求2所述的鲤科鱼类线粒体全基因组的扩增方法，其特征是：步骤(1)中第一轮PCR扩增反应条件为：94℃预变性1min；94℃变性30s，45～55℃退火30s，72℃延伸7min，30个循环；最后72℃延伸10min。
5.根据权利要求2所述的鲤科鱼类线粒体全基因组的扩增方法，其特征是：步骤(2)中第二轮PCR扩增时反应体系的总体积为50μL，其中10×Trans Taq buffer II 5.0μL，浓度为2.5mM的dNTPs 4.0μL，浓度为10μM正反游引物各2.0μL，长片段扩增Taq酶1.0μL，DNA模板1μL，ddH 2O 35.0μL。
6.根据权利要求2所述的鲤科鱼类线粒体全基因组的扩增方法，其特征是：步骤(2)中第二轮PCR扩增反应条件为：94℃预变性45s；94℃变性30s，50～60℃退火30s，72℃延伸6min，35个循环；最后72℃延伸10min。
7.根据权利要求2所述的鲤科鱼类线粒体全基因组的扩增方法，其特征是：步骤(2)以第一轮PCR产物稀释50倍后作为第二轮引物进行PCR扩增的模板。
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