CN108603225A - Pcr试剂的稳定化及测定 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及PCR或RT‑PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下的稳定化。具体而言,提供了用于使PCR或RT‑PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下基本稳定储存的制剂、组合物、制品、试剂盒和方法。
Description
交叉引用
本申请要求2015年12月8日提交的美国临时申请号62/264,758的权益,该临时申请通过引用以其全文并入本文。
背景技术
需要以下改进的制剂和方法,其使得PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下稳定一段时间,该时间足以储存和运输PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分以供研究、诊断和治疗目的。
发明内容
在一些实施方案中,本文描述了用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下基本稳定储存的制剂,其包含:(i)羟基酸;和(ii)硼酸盐组合物,其中PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分在环境温度下储存后保持稳定至少三个月的时间。在一些实施方案中,所述羟基酸选自式(I)化合物:(I),其中R1选自H、未取代或取代的烷基和未取代或取代的芳基。在一些实施方案中,所述羟基酸选自乳酸、苹果酸、丙二酸、酒石酸、柠檬酸及其组合。在一些实施方案中,所述羟基酸是乳酸。在一些实施方案中,所述羟基酸不是苹果酸、丙二酸、酒石酸或柠檬酸。在一些实施方案中,所述羟基酸不是苹果酸。在一些实施方案中,所述羟基酸不是丙二酸。在一些实施方案中,所述羟基酸不是酒石酸。在一些实施方案中,所述羟基酸不是柠檬酸。在一些实施方案中,所述硼酸盐组合物选自硼酸、硼酸盐、四硼酸钠、硼砂及其组合。在一些实施方案中,所述硼酸盐组合物选自硼酸、四硼酸钠及其组合。在一些实施方案中,所述制剂包含乳酸和硼酸。在一些实施方案中,所述制剂包含乳酸、硼酸和四硼酸钠。在一些实施方案中,所述制剂选自表2的制剂。
在一些实施方案中,本文描述了用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下基本稳定储存的制剂,其包含:(i)非还原糖;和(ii)缓冲液,其中PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分在环境温度下储存后保持稳定至少三个月。在一些实施方案中,所述非还原糖选自蔗糖和海藻糖。在一些实施方案中,所述非还原糖是蔗糖。在一些实施方案中,所述缓冲液选自Tris-HCl、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、磺基水杨酸、磺基间苯二甲酸、草酸、硼酸盐、CAPS(3-(环己基氨基)-1-丙磺酸)、CAPSO(3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸)、EPPS(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸)、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)、MES(2-(N-吗啉基)乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)、MOPSO(3-吗啉基-2-羟基丙磺酸)、PIPES(1,4-哌嗪二乙磺酸)、TAPS(N-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸)、TAPSO(2-羟基-3-[三(羟甲基)甲基氨基]-1-丙磺酸)、TES(N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)、bicine(N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸)、tricine(N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸)、tris(三(羟甲基)氨基甲烷)以及bis-tris(2-[二(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇)。在一些实施方案中,所述制剂包含Tris-HCl。在一些实施方案中,所述制剂包含蔗糖和Tris-HCl。在一些实施方案中,所述制剂选自表3的制剂12或13。
在一些实施方案中,本文描述了用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下基本稳定储存的制剂,其包含:(i)氨基磺酸或硫酸铵;和(ii)非还原糖、酰胺或聚乙二醇中的至少一种,其中PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分在环境温度下储存后保持稳定至少三个月的时间。在一些实施方案中,所述制剂包含式(II)的氨基磺酸:其中R1和R2独立地选自H、未取代或取代的烷基和未取代或取代的芳基。在一些实施方案中,所述氨基磺酸是牛磺酸。在一些实施方案中,所述制剂包含硫酸铵。在一些实施方案中,所述制剂包含选自蔗糖和海藻糖的非还原糖。在一些实施方案中,所述非还原糖是蔗糖。在一些实施方案中,所述制剂包含式(III)的酰胺:其中R1、R2和R3独立地选自H、未取代或取代的烷基和未取代或取代的芳基。在一些实施方案中,所述制剂包含选自N,N-二甲基丙酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、丁酰胺和二甲基甲酰胺的酰胺。在一些实施方案中,所述酰胺是N,N-二甲基丙酰胺。在一些实施方案中,所述酰胺是N,N-二甲基乙酰胺。在一些实施方案中,所述酰胺是二甲基异丁酰胺。在一些实施方案中,所述酰胺是甲基丙酰胺。在一些实施方案中,所述制剂包含聚乙二醇。在一些实施方案中,所述聚乙二醇是PEG 8000。在一些实施方案中,所述聚乙二醇是PEG400。在一些实施方案中,所述制剂选自表3的制剂14-21。
在一些实施方案中,本文描述了混合物,其包含:(a)用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下基本稳定储存的制剂,该制剂包含:羟基酸和硼酸盐组合物;以及(b)PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分;其中所述PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下储存后保持稳定至少三个月的时间。在一些实施方案中,所述羟基酸是式(I)化合物:(I),其中R1选自H、未取代或取代的烷基或者未取代或取代的芳基。在一些实施方案中,所述羟基酸选自乳酸、苹果酸、丙二酸、酒石酸、柠檬酸及其组合。在一些实施方案中,所述羟基酸是乳酸。在一些实施方案中,所述硼酸盐组合物选自硼酸、硼酸盐、四硼酸钠、硼砂及其组合。在一些实施方案中,所述硼酸盐组合物选自硼酸、四硼酸钠及其组合。在一些实施方案中,所述制剂包含乳酸和硼酸。在一些实施方案中,所述制剂包含乳酸、硼酸和四硼酸钠。在一些实施方案中,PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分包含对照核酸。在一些实施方案中,PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分包含披甲RNA。在一些实施方案中,所述披甲RNA是用MS2噬菌体的外壳蛋白包被的HIV RNA的单链,从而允许保护RNA链。在一些实施方案中,PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分包含内部对照模板。在一些实施方案中,所述聚乙二醇是PEG 400。在一些实施方案中,所述制剂选自表2的制剂。
在一些实施方案中,本文描述了混合物,其包含:(a)用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下基本稳定储存的制剂,该制剂包含:非还原糖和缓冲液;以及(b)PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分,其中所述PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下储存后保持稳定至少三个月。在一些实施方案中,所述非还原糖选自蔗糖和海藻糖。在一些实施方案中,所述非还原糖是蔗糖。在一些实施方案中,所述缓冲液选自Tris-HCl、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、磺基水杨酸、磺基间苯二甲酸、草酸、硼酸盐、CAPS(3-(环己基氨基)-1-丙磺酸)、CAPSO(3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸)、EPPS(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸)、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)、MES(2-(N-吗啉基)乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)、MOPSO(3-吗啉基-2-羟基丙磺酸)、PIPES(1,4-哌嗪二乙磺酸)、TAPS(N-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸)、TAPSO(2-羟基-3-[三(羟甲基)甲基氨基]-1-丙磺酸)、TES(N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)、bicine(N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸)、tricine(N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸)、tris(三(羟甲基)氨基甲烷)以及bis-tris(2-[二(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇)。在一些实施方案中,所述制剂包含蔗糖和Tris-HCl。在一些实施方案中,PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分包含聚合酶。在一些实施方案中,PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分包含Taq聚合酶。在一些实施方案中,PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分包含PCR或RT-PCR主混合物。在一些实施方案中,该PCR或RT-PCR主混合物包含酶、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、缓冲液、盐、适体、引物、探针和其他添加剂。在一些实施方案中,该PCR或RT-PCR主混合物包含聚合酶、dNTP、引物和探针。在一些实施方案中,该PCR或RT-PCR主混合物包含逆转录酶、Taq聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、引物、探针、缓冲液、盐、去污剂、甘油、DMSO和一种或多种另外的酶。在一些实施方案中,该Taq聚合酶具有逆转录酶活性。在一些实施方案中,该PCR或RT-PCR主混合物包含UNG。在一些实施方案中,PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分包含内部对照模板核酸。在一些实施方案中,所述聚乙二醇是PEG400。在一些实施方案中,所述制剂选自表3的制剂12或13。
在一些实施方案中,本文描述了混合物,其包含:(a)用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下基本稳定储存的制剂,该制剂包含:i)氨基磺酸或硫酸铵,和ii)非还原糖、酰胺或聚乙二醇中的至少一种;以及(b)PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分;其中该PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下储存后保持稳定至少三个月的时间。在一些实施方案中,所述制剂包含式(II)的氨基磺酸:其中R1和R2独立地选自H、未取代或取代的烷基和未取代或取代的芳基。在一些实施方案中,所述氨基磺酸是牛磺酸。在一些实施方案中,所述制剂包含硫酸铵。在一些实施方案中,所述制剂包含选自蔗糖和海藻糖的非还原糖。在一些实施方案中,所述非还原糖是蔗糖。在一些实施方案中,所述制剂包含式(III)的酰胺:其中R1、R2和R3独立地选自H、未取代或取代的烷基和未取代或取代的芳基。在一些实施方案中,所述制剂包含选自N,N-二甲基丙酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、丁酰胺和二甲基甲酰胺的酰胺。在一些实施方案中,所述酰胺是N,N-二甲基丙酰胺。在一些实施方案中,所述酰胺是N,N-二甲基乙酰胺。在一些实施方案中,所述制剂包含二甲基异丁酰胺。在一些实施方案中,所述制剂包含甲基丙酰胺。在一些实施方案中,所述制剂包含聚乙二醇。在一些实施方案中,该聚乙二醇是PEG 8000或PEG 400。在一些实施方案中,PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分包含聚合酶。在一些实施方案中,PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分包含Taq聚合酶。在一些实施方案中,PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分包含PCR或RT-PCR主混合物。在一些实施方案中,该PCR或RT-PCR主混合物包含酶、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、缓冲液、盐、适体、引物、探针和其他添加剂。在一些实施方案中,该PCR或RT-PCR主混合物包含聚合酶、dNTP、引物和探针。在一些实施方案中,该PCR或RT-PCR主混合物包含逆转录酶、Taq聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、引物、探针、缓冲液、盐、去污剂、甘油、DMSO和一种或多种另外的酶。在一些实施方案中,该Taq聚合酶具有逆转录酶活性。在一些实施方案中,该PCR或RT-PCR主混合物包含UNG。在一些实施方案中,PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分包含内部对照模板核酸。在一些实施方案中,所述聚乙二醇是PEG 400。在一些实施方案中,所述制剂选自表3的制剂14-21。
在一些实施方案中,本文描述了混合物,其包含:(a)用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下基本稳定储存的制剂,该制剂包含:乳酸;以及(b)PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分;其中该PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分在环境温度下储存后保持稳定至少三个月的时间。在一些实施方案中,乳酸以5%至20%的浓度存在于所述制剂中。在一些实施方案中,乳酸以7%至15%的浓度存在于所述制剂中。在一些实施方案中,所述制剂进一步包含硼酸、四硼酸钠或其组合。在一些实施方案中,PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分包含对照核酸。在一些实施方案中,PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分包含披甲RNA。
在一些实施方案中,本文描述了组合物,其包含与本文提供的用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分基本稳定储存的制剂相混合的基本稳定储存的PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分。
在一些实施方案中,本文描述了包含用于使本文提供的PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分基本稳定储存的制剂的制品。
在一些实施方案中,本文描述了包含本文提供的制品和包装插页的试剂盒。
在一些实施方案中,本文描述了用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下基本稳定储存的方法,其包括:将PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分的样品与本文提供的用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分基本稳定储存的制剂相混合,其中PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分在环境温度下储存后保持稳定至少三个月的时间。在一些实施方案中,至少80%的PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分在环境温度下保持稳定至少三个月的时间。在一些实施方案中,PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分是RT-PCR主混合物、RT-PCR内部对照模板核酸或其组合。
在一些实施方案中,本文描述了用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下基本稳定储存的方法,其包括:将PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分与选自下组的制剂相混合:(a)包含羟基酸和硼酸盐组合物的制剂;(b)包含非还原糖和缓冲液的制剂;以及(c)包含以下成分的制剂:i)氨基磺酸或硫酸铵,和ii)非还原糖、酰胺或聚乙二醇中的至少一种;其中PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分在环境温度下储存后保持稳定至少三个月的时间。在一些实施方案中,至少80%的PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分在环境温度下保持稳定至少三个月的时间。在一些实施方案中,PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分是RT-PCR主混合物、RT-PCR内部对照模板核酸或其组合。
援引并入
本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用而并入本文,其程度如同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。
附图说明
在所附权利要求书中具体阐述了本发明的新颖特征。通过参考以下对利用了本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图,将会获得对本发明的特征和优点的更好理解,在附图中:
图1A-D图示了披甲RNA(aRNA;Roche)的稳定化。如实验方案(实施例1)中所述,将aRNA稀释并与水(4C对照和无制剂对照(NFC))或与制剂01混合。“4C对照”样品在4℃下储存。样品“NFC”(无制剂对照)和含有制剂01的样品均在45℃(图1A和图1C)或37℃(图1B和图1D)下储存指定的时间。在所述时间,取出10μl样品并如实验方案(实施例1)中所述进行处理。经处理的RNA模板在HIV实时RT-PCR测定中使用。图1A和图1B显示了每个样品的平均循环阈值(Ct)。图1C和图1D显示了从实时RT-PCR收集的相同样品的平均相对荧光单位(RFU)。数据显示,含有制剂01的样品与NFC相比具有较低的Ct值和改善的荧光,表明从这些样品产生的RNA的量增加。
图2A-B图示了披甲RNA(aRNA;Roche)的稳定化。如实验方案(实施例1)中所述,将aRNA稀释并与水(4C对照和NFC)或与制剂02混合。“4C对照”样品在4℃下储存。样品“NFC”(无制剂对照)和含有制剂02的样品均在45℃(图2A)或37℃(图2B)下储存指定的时间。在所述时间,取出10μl样品并如实验方案(实施例1)中所述进行处理。经处理的RNA模板在HIV实时RT-PCR测定中使用。图2A和图2B显示了从实时RT-PCR收集的每个样品的平均循环阈值(Ct)。数据显示,含有制剂02的样品与NFC相比具有较低的Ct值,表明从这些样品产生的RNA的量增加。
图3A-B图示了披甲RNA(aRNA;Roche)的稳定化。如实验方案(实施例1)中所述,将aRNA稀释并与水(4C对照和NFC)或与所列出的制剂混合。“4C对照”样品在4℃下储存。样品“NFC”(无制剂对照)和含有制剂的样品均在45℃下储存指定的时间。在所述时间,取出10μl样品并如实验方案(实施例1)中所述进行处理。经处理的RNA模板在HIV实时RT-PCR测定中使用。图中显示了从实时RT-PCR收集的每个样品的平均循环阈值(Ct)。数据显示,含有制剂01、02和04的样品与NFC相比具有较低的Ct值,表明从这些样品产生的RNA的量增加。在这些实验中测试的所有其他制剂均显示出等于或高于NFC的Ct值的Ct值,表明RNA产率或稳定性未得到改善。图3A图示在45℃下储存19天;图3B图示在45℃下储存26天。
图4A-C图示了完整的RT-PCR主混合物(Roche)的稳定化。如实验方案(实施例2)中所述,将1.5x浓缩的RT-PCR主混合物与水(4C对照或NFC)或与指定制剂混合。“4C对照”样品在4℃下储存。样品“NFC”(无制剂对照)与含有制剂的样品在50℃下储存14天。此时,如实验方案(实施例2)中所述,取出样品并将其与剩余的必需组分合并以进行HIV实时RT-PCR测定。图中显示从实时RT-PCR收集的每个样品的平均循环阈值(Ct)。图4A显示了针对制剂12和13所获得的结果。图4B显示了针对制剂14-17所获得的结果。图4C显示了针对制剂18-21所获得的结果。数据显示,与NFC相比,含有所示制剂的样品对于两种RT-PCR靶标(HIV和QSRNA)具有较低的Ct值。
具体实施方式
本发明涉及用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下基本稳定储存的制剂、组合物、制品、试剂盒和方法。
本文提供了用于使一种或多种用于聚合酶链反应(PCR)测定法的试剂稳定化的制剂、方法和组合物。PCR试剂可以单独储存或组合储存,以便在诸如核酸扩增和测序的方法中使用。所述制剂、方法和组合物可使PCR试剂在室温下长期储存。此外,在一些实施方案中,所述制剂、方法和组合物可使液体形式的PCR试剂稳定储存。
在一些实施方案中,本文公开的制剂可使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分长期储存。在一些实施方案中,PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分包含聚合酶。在一些实施方案中,PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分包含Taq聚合酶。在一些实施方案中,PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分包含PCR或RT-PCR主混合物。在一些实施方案中,该PCR或RT-PCR主混合物包含酶、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、缓冲液、盐、适体、引物、探针和其他添加剂。在一些实施方案中,该PCR或RT-PCR主混合物包含聚合酶、dNTP、引物和探针。在一些实施方案中,PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分包含内部对照模板核酸。
内部对照模板核酸可以是RNA或DNA。在一些实施方案中,内部对照模板用作PCR和RT-PCR测定法的定量标准。在一些实施方案中,该内部对照模板是披甲RNA(Pasloske等人,J.Clin.Microbiol.1998;36(12):3590-3594;美国专利号5,677,124;Roche)。在一些实施方案中,该披甲RNA主要由用MS2噬菌体的外壳蛋白包被的HIV RNA的单链组成,从而允许保护RNA链。
在一些实施方案中,所述PCR或RT-PCR测定法是用于检测和量化传染原的测定法。在一些实施方案中,该传染原是病毒。在一些实施方案中,该传染原是HIV。
定义
除非上下文中另有明确规定,否则如本说明书及随附的权利要求书中所用的,单数形式“一个”、“一种”和“该”包括其复数提法。因此,例如,提及“该方法”包括本领域技术人员在阅读此公开内容等之后将会明白的一种或多种方法和/或本文描述的这种类型的步骤。
如本文所用的“约”在提及可测值如量、时距等时,意在包括指定值的±20%或±10%或±5%或甚至±1%的偏差,因为此类偏差对于所公开的组合物或实施所公开的方法是合适的。
除非另有定义,否则本文中所采用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员所普遍理解的相同的含义。
如本文中所使用的术语“环境温度”是指平常的室内室温。在一些实施方案中,环境温度为15℃到32℃。在一些实施方案中,环境温度为20℃到27℃。
“烷基”基团是指脂肪族烃基团。该烷基部分包括“饱和烷基”基团,这意味着其不含任何烯烃或炔烃部分。该烷基部分也包括“不饱和烷基”部分,这意味着其含有至少一个烯烃或炔烃部分。“烯烃”部分是指具有至少一个碳碳双键的基团,而“炔烃”部分是指具有至少一个碳碳三键的基团。无论是饱和的还是不饱和的,该烷基部分均包括支链、直链或环状部分。根据结构,烷基基团包括单价基团或双价基团(即亚烷基),并且如果是“低级烷基”则具有1到6个碳原子。如本文所用的,C1-Cx包括C1-C2、C1-C3、……C1-Cx。该“烷基”部分任选地具有1到10个碳原子(本文中无论何时出现,诸如“1到10”的数值范围均指给定范围内的每个整数;例如,“1到10个碳原子”意味着该烷基基团选自具有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等直至且包含10个碳原子的部分,尽管本定义也涵盖未指定数值范围的术语“烷基”的出现)。本文描述的化合物的烷基基团可被指定为“C1-C4烷基”或类似的指定。仅举例而言,“C1-C4烷基”表示在烷基链中具有一个到四个碳原子,即,该烷基链选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。因此,C1-C4烷基包括C1-C2烷基和C1-C3烷基。烷基基团为任选取代的或未取代的。典型的烷基基团包括但绝不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。
“酰胺”是具有式-C(O)NHR或NHC(O)R的化学部分,其中R选自烷基、环烷基、芳基、杂芳基(通过环碳键合)和杂脂环(通过环碳键合)。用来制备这类酰胺的程序和具体基团是本领域技术人员已知的,并且可以容易地在参考来源中找到,例如Greene和Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,第3版,John Wiley&Sons,New York,NY,1999,其通过引用以其全文并入本文。
单独使用的或作为如“芳基烷基”、“芳基烷氧基”或“芳氧基烷基”中的较大部分的一部分使用的术语“芳基”是指单环的、双环的或三环的碳环体系,其包括稠环,其中该体系中的至少一个环是芳族的。术语“芳基”可与术语“芳环”互换使用。在一个实施方案中,芳基包括具有6-12个碳原子的基团。在另一个实施方案中,芳基包括具有6-10个碳原子的基团。芳基基团的实例包括苯基、萘基、蒽基、菲基、并四苯基、1,2,3,4-四氢化萘基、1H-茚基、2,3-二氢-1H-茚基等。一种具体的芳基为苯基。在另一个实施方案中,芳基包括茚满基、萘基、四氢化萘基等,其中该基团或连接点在芳环上。
术语“任选取代的”或“取代的”意指所提及的基团可被一个或多个另外的基团所取代,该另外的基团单独地且独立地选自烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环、羟基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、烷基亚砜、芳基亚砜、烷基砜、芳基砜、氰基、卤代、酰基、硝基、卤代烷基、氟烷基、氨基(包括单取代和双取代的氨基基团)及其受保护的衍生物。举例而言,可选的取代基可以是LsRs,其中每个Ls独立地选自键、-O-、-C(=O)-、-S-、-S(=O)-、-S(=O)2-、-NH-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、S(=O)2NH-、-NHS(=O)2、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-(取代或未取代的C1-C6烷基)或-(取代或未取代的C2-C6烯基);并且每个Rs独立地选自H、取代或未取代的C1-C4烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、杂芳基或杂烷基。
标准化学术语的定义可在工具书中找到,包括Carey和Sundberg“ADVANCEDORGANIC CHEMISTRY 4TH ED.”卷A(2000)和卷B(2001),Plenum Press,New York。除非另有说明,否则采用本领域技术范围内的质谱法、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。除非提供了具体的定义,否则与本文所述分析化学、合成有机化学以及药物和制药化学相关使用的命名法及其实验室程序和技术是本领域已知的。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养及转化(例如,电穿孔、脂质转染)。反应和纯化技术可例如使用制造商规格的试剂盒进行,或者如本领域通常实现的那样进行或如本文所述进行。前述技术和程序通常可以通过本领域熟知的常规方法进行,以及如本说明书中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所描述的那样进行。
如本文所用的,单独出现且没有数字标记的取代基“R”是指选自烷基、环烷基、芳基、杂芳基(通过环碳键合)和非芳族杂环(通过环碳键合)的取代基。
如本文所用的,在结合PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分使用时,术语“稳定化”、“稳定”和“稳定的”是指材料维持、增强PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分的活性或以其他方式抑制其活性下降或丧失的能力,通常随时间推移来测量(即,在稳定剂的存在下,PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分保持其活性的时间比没有该稳定剂的情况下更长)。通过根据本领域已知的方法进行PCR或RT-PCR测定来测量PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分的活性。“PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分的稳定化”也指材料在次优的温度或pH条件下维持活性的能力。作为另一个实例,“稳定PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分”是指与不存在“稳定性”化合物或材料时的活性相比,材料在次优条件下增强活性的能力。
术语“聚合酶”是指从核糖核苷三磷酸或脱氧核糖核苷三磷酸合成核酸链(例如,RNA或DNA)的酶。
如本文所用的,“核酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA),以及其修饰的和/或功能化的形式。类似地,如本文所用的术语“核苷酸”包括核糖核酸和脱氧核糖核酸的单个单元以及核苷和核苷酸类似物,以及修饰的核苷酸,如标记的核苷酸。此外,“核苷酸”包括非天然存在的类似物结构,例如其中糖、磷酸和/或碱基单元不存在或被其他化学结构替代的那些类似物结构。因此,术语“核苷酸”包括单个肽核酸(PNA)(Nielsen等人,Bioconjug.Chem.1994;5(1):3-7)和锁定核酸(LNA)(Braasch和Corey,Chem.Biol.2001;8(1):1-7)单元以及其他类似单元。
如本文所用的,术语“QS”是指在RT-PCR反应中用作定量标准物的RNA。
如本文所用的,术语“aRNA”和“QS aRNA”是指在RT-PCR反应中用作定量标准物的披甲RNA(Roche)。
如本文所述,术语“多肽”是指氨基酸的任何聚合链。术语“肽”和“蛋白质”可与术语多肽互换使用,也指氨基酸的聚合链。术语“多肽”包括天然或人工蛋白质、蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物。多肽可以是单体的或聚合的。除非与上下文相矛盾,否则术语“多肽”包括其片段和变体(包括变体的片段)。
配制试剂
pH缓冲液
根据某些实施方案,本文描述的用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分基本稳定储存的制剂和组合物包含一种或多种pH缓冲液。在一些实施方案中,该pH缓冲液是因其对抗溶液的pH变化的能力而为本领域所知的大量化合物中的任意化合物,诸如在存在pH缓冲液的水溶液中。用于包含在稳定储存组合物中的一种或多种具体pH缓冲液的选择可基于本公开内容以及根据本领域的常规实践来进行,并且可能受到多种因素的影响,包括期望保持的pH、待稳定的样品的性质、待采用的溶剂条件、待使用的制剂的其他组分,以及其他条件。例如,一般而言,pH缓冲液以在质子解离常数(pKa)的约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0个pH单位以内的pH使用,质子解离常数为缓冲液的一个特征。
pH缓冲液的非限制性实例包括Tris-HCl、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、磺基水杨酸、磺基间苯二甲酸、草酸、硼酸盐、CAPS(3-(环己基氨基)-1-丙磺酸)、CAPSO(3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸)、EPPS(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸)、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)、MES(2-(N-吗啉基)乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)、MOPSO(3-吗啉基-2-羟基丙磺酸)、PIPES(1,4-哌嗪二乙磺酸)、TAPS(N-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸)、TAPSO(2-羟基-3-[三(羟甲基)甲基氨基]-1-丙磺酸)、TES(N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)、bicine(N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸)、tricine(N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸)、tris(三(羟甲基)氨基甲烷)以及bis-tris(2-[二(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇)。本文所涉及的某些实施方案,包括表1中列出的那些实施方案,特征为具有约4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0的pH的制剂。在一些实施方案中,所述制剂具有约7至9的pH。
有机酸
在一些实施方案中,在当前描述的用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分基本稳定储存的制剂和组合物中包含有机酸。有机酸包括例如羟基酸、羧酸和氨基磺酸。
在一些实施方案中,所述有机酸是羟基酸。在一些实施方案中,该羟基酸是式(I)化合物:其中R1选自H、未取代或取代的烷基或者未取代或取代的芳基。在一些实施方案中,该羟基酸选自乳酸、苹果酸、丙二酸、酒石酸、柠檬酸及其组合。在一些实施方案中,该羟基酸是乳酸。在一些实施方案中,该羟基酸以5%至20%的浓度存在于所述制剂中。在一些实施方案中,该羟基酸以7%至15%的浓度存在于所述制剂中。
在一些实施方案中,所述有机酸是氨基磺酸。在一些实施方案中,该氨基磺酸是式(II)化合物:其中R1和R2独立地选自H、未取代或取代的烷基和未取代或取代的芳基。在一些实施方案中,该氨基磺酸是牛磺酸。牛磺酸是一种未掺入到蛋白质中的氨基酸。在一些实施方案中,该有机酸是乳酸、牛磺酸或二者。
在一些实施方案中,所述有机酸是羧酸。在一些实施方案中,该羧酸是羟基四氢嘧啶。
在一些实施方案中,所述有机酸是氨基酸。氨基酸包括天然氨基酸丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸及其衍生物。氨基酸衍生物的实例是甜菜碱。在一些实施方案中,所述有机酸是甜菜碱。
酰胺
在某些实施方案中,本文描述的用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下基本稳定储存的制剂可包含酰胺。在一些实施方案中,该酰胺是式(III)化合物:其中R1、R2和R3独立地选自H、未取代或取代的烷基和未取代或取代的芳基。在一些实施方案中,该酰胺选自N,N-二甲基丙酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、丁酰胺和二甲基甲酰胺。在一些实施方案中,该酰胺是N,N-二甲基丙酰胺。在一些实施方案中,该酰胺是N,N-二甲基乙酰胺。
聚醚
在某些实施方案中,本文描述的用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下基本稳定储存的制剂可包含聚醚。聚醚是含有一个以上醚官能团的聚合物。聚醚包括例如聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)、聚氧乙烯(POE)、聚丙二醇(PPG)、聚四亚甲基二醇(PTMG)、聚四亚甲基醚二醇(PTMEG)和低聚甲醛。芳香族聚醚包括例如聚苯醚(PPE)和聚(对苯醚)(PPO)。在一些实施方案中,该聚醚是聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)或聚氧乙烯(POE)。在一些实施方案中,该聚醚是聚乙二醇(PEG)。聚乙二醇(PEG)的分子量可为300g/mol至10,000,000g/mol。在一些实施方案中,该聚醚是PEG 8000。在一些实施方案中,该聚醚是PEG 400。
螯合剂
根据某些实施方案,在当前描述的用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分基本稳定储存的制剂和组合物中包含螯合试剂或螯合剂。这类螯合剂因其与金属阳离子络合并阻碍金属阳离子的反应性的能力而为本领域技术人员所知。示例性的螯合剂包括二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、反式-1,2-二氨基环己烷-N,N,N',N'-四乙酸(CDTA)、1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、N-(2-羟乙基)亚乙基二胺-N,N',N'-三乙酸、葡萄糖酸钠和次氨基三乙酸(NTA)。在一些实施方案中,该螯合剂是EDTA。在一些实施方案中,该螯合剂以约0.01-0.1mM、约0.1-1.0mM、约1.0-50mM或约10-40mM,或约25mM的浓度存在。
非还原糖
在一些实施方案中,用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下基本稳定储存的制剂和组合物包含至少一种非还原糖。如本文所用的,“非还原糖”是指缺乏醛官能团的碳水化合物分子。示例性非还原糖包括蔗糖和海藻糖。在一些实施方案中,该非还原糖是蔗糖。在一些实施方案中,该非还原糖是海藻糖。在一些实施方案中,该非还原糖以约1.0-50mM的浓度存在。在一些实施方案中,该非还原糖以约10.0-30mM的浓度存在。在一些实施方案中,该非还原糖以约25mM的浓度存在。在一些实施方案中,该非还原糖以约25-100mM、约100-500mM、约200-700mM、约300-800mM、约400-900mM或约500-1000mM的浓度存在。在一些实施方案中,该非还原糖以约400-600mM的浓度存在。在一些实施方案中,该非还原糖以约1%至约50%(重量/体积)的浓度存在。
去污剂或表面活性剂
在某些实施方案中,用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下基本稳定储存的制剂含有去污剂或表面活性剂。在某些实施方案中,该去污剂或表面活性剂选自TRITON X-1004-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇、NONIDET P-40聚乙二醇单(辛基苯基)醚、BRIJ家族的任何去污剂、TWEEN家族的任何表面活性剂、十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、脱氧胆酸盐、辛基-吡喃葡萄糖苷、甜菜碱等。某些设想的实施方案,包括那些可能涉及特定类型的生物样品的实施方案,明确地排除了当存在螯合剂时存在变性去污剂,特别是足以使蛋白质、多肽或核酸分子变性的某种类型和浓度的去污剂,而某些其他设想的实施方案则没有这种限制,但应注意,许多去污剂和表面活性剂对许多但不是所有类型的生物样品来说是非变性的。
在其他实施方案中,所述去污剂或表面活性剂可以是TOMAMINE去污剂。TOMAMINE去污剂的实例包括双-(2-羟乙基)异癸氧基丙胺、聚(5)氧乙烯异癸氧基丙胺、双-(2-羟乙基)异十三烷氧基丙胺、聚(5)氧乙烯异十三烷氧基丙胺、双-(2-羟乙基)直链烷氧基丙胺、双(2-羟乙基)大豆胺、聚(15)氧乙烯大豆胺、双(2-羟乙基)十八烷胺、聚(5)氧乙烯十八烷胺、聚(8)氧乙烯十八烷胺、聚(10)氧乙烯十八烷胺、聚(15)氧乙烯十八烷胺、双(2-羟乙基)十八烷氧基丙胺、双-(2-羟乙基)牛脂胺、聚(5)氧乙烯牛脂胺、聚(15)氧乙烯牛脂胺、聚(3)氧乙烯1,3-二氨基丙烷、双(2-羟乙基)椰油胺、双-(2-羟乙基)异癸氧基丙胺、聚(5)氧乙烯异癸氧基丙胺、双-(2-羟乙基)异十三烷氧基丙胺、聚(5)氧乙烯异十三烷氧基丙胺、双-(2-羟乙基)直链烷氧基丙胺、双(2-羟乙基)大豆胺、聚(15)氧乙烯大豆胺、双(2-羟乙基)十八烷胺、聚(5)氧乙烯十八烷胺、聚(8)氧乙烯十八烷胺、聚(10)氧乙烯十八烷胺、聚(15)氧乙烯十八烷胺、双(2-羟乙基)十八烷氧基丙胺、双-(2-羟乙基)牛脂胺、聚(5)氧乙烯牛脂胺、聚(15)氧乙烯牛脂胺、聚(3)氧乙烯1,3-二氨基丙烷和双(2-羟乙基)椰油胺。
硼酸盐组合物
在一些实施方案中,所述硼酸盐组合物包含选自硼酸、硼酸盐、四硼酸钠、硼砂及其组合的化合物。在一些实施方案中,该硼酸盐组合物包含选自硼酸、四硼酸钠及其组合的化合物。在一些实施方案中,该硼酸盐组合物包含硼酸。在一些实施方案中,该硼酸盐组合物包含硼酸和四硼酸钠。在一些实施方案中,该硼酸盐组合物以2mM至300mM的浓度存在。在一些实施方案中,该硼酸盐组合物以5mM至50mM的浓度存在。
用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下稳定的示例性制剂
在一些实施方案中,本文描述了用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下基本稳定储存的制剂,其包含:(i)羟基酸;和(ii)硼酸盐组合物,其中PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分在环境温度下储存后保持稳定至少三个月的时间。在一些实施方案中,所述羟基酸选自式(I)化合物:(I),其中R1选自H、未取代或取代的烷基和未取代或取代的芳基。在一些实施方案中,所述羟基酸选自乳酸、苹果酸、丙二酸、酒石酸、柠檬酸及其组合。在一些实施方案中,所述羟基酸是乳酸。在一些实施方案中,所述硼酸盐组合物选自硼酸、硼酸盐、四硼酸钠、硼砂及其组合。在一些实施方案中,所述硼酸盐组合物选自硼酸、四硼酸钠及其组合。在一些实施方案中,所述制剂包含乳酸和硼酸。在一些实施方案中,所述制剂包含乳酸、硼酸和四硼酸钠。
在一些实施方案中,本文描述了用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下基本稳定储存的制剂,其包含:(i)非还原糖;和(ii)缓冲液,其中PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分在环境温度下储存后保持稳定至少三个月。在一些实施方案中,所述非还原糖选自蔗糖和海藻糖。在一些实施方案中,所述非还原糖是蔗糖。在一些实施方案中,所述缓冲液选自Tris-HCl、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、磺基水杨酸、磺基间苯二甲酸、草酸、硼酸盐、CAPS(3-(环己基氨基)-1-丙磺酸)、CAPSO(3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸)、EPPS(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸)、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)、MES(2-(N-吗啉基)乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)、MOPSO(3-吗啉基-2-羟基丙磺酸)、PIPES(1,4-哌嗪二乙磺酸)、TAPS(N-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸)、TAPSO(2-羟基-3-[三(羟甲基)甲基氨基]-1-丙磺酸)、TES(N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)、bicine(N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸)、tricine(N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸)、tris(三(羟甲基)氨基甲烷)以及bis-tris(2-[二(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇)。在一些实施方案中,所述制剂包含Tris-HCl。在一些实施方案中,所述制剂包含蔗糖和Tris-HCl。
在一些实施方案中,本文描述了用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下基本稳定储存的制剂,其包含:(i)氨基磺酸或硫酸铵;和(ii)非还原糖、酰胺或聚乙二醇中的至少一种,其中PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分在环境温度下储存后保持稳定至少三个月的时间。在一些实施方案中,所述制剂包含选自式(II)化合物的氨基磺酸:其中R1和R2独立地选自H、未取代或取代的烷基和未取代或取代的芳基。在一些实施方案中,该氨基磺酸是牛磺酸。在一些实施方案中,n可以是1至6的数字。在一些实施方案中,n可以是任何其他数字。在一些实施方案中,所述制剂包含硫酸铵。在一些实施方案中,所述制剂包含选自蔗糖和海藻糖的非还原糖。在一些实施方案中,该非还原糖是蔗糖。在一些实施方案中,所述制剂包含选自式(III)化合物的酰胺:其中R1、R2和R3独立地选自H、未取代或取代的烷基和未取代或取代的芳基。在一些实施方案中,所述制剂包含选自N,N-二甲基丙酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、丁酰胺和二甲基甲酰胺的酰胺。在一些实施方案中,该酰胺是N,N-二甲基丙酰胺。在一些实施方案中,该酰胺是N,N-二甲基乙酰胺。在一些实施方案中,该酰胺是二甲基异丁酰胺。在一些实施方案中,该酰胺是甲基丙酰胺。在一些实施方案中,所述制剂包含聚乙二醇。在一些实施方案中,该聚乙二醇是PEG 8000。在一些实施方案中,该聚乙二醇是PEG 400。
在一些实施方案中,本文描述了用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下基本稳定储存的制剂,其包含:(i)氨基磺酸;和(ii)氨基酸,其中PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分在环境温度下储存后保持稳定至少三个月的时间。在一些实施方案中,所述制剂包含选自式(II)化合物的氨基磺酸:其中R1和R2独立地选自H、未取代或取代的烷基和未取代或取代的芳基。在一些实施方案中,该氨基磺酸是牛磺酸。在一些实施方案中,所述制剂包含选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸和甜菜碱的氨基酸。在一些实施方案中,该氨基酸是甜菜碱。在一些实施方案中,所述制剂包含牛磺酸和甜菜碱。
在一些实施方案中,本文描述了用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下基本稳定储存的制剂,其包含:(i)羧酸;和(ii)缓冲液,其中PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分在环境温度下储存后保持稳定至少三个月的时间。在一些实施方案中,所述羧酸是羟基四氢嘧啶。在一些实施方案中,所述缓冲液选自Tris-HCl、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、磺基水杨酸、磺基间苯二甲酸、草酸、硼酸盐、CAPS(3-(环己基氨基)-1-丙磺酸)、CAPSO(3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸)、EPPS(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸)、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)、MES(2-(N-吗啉基)乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)、MOPSO(3-吗啉基-2-羟基丙磺酸)、PIPES(1,4-哌嗪二乙磺酸)、TAPS(N-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸)、TAPSO(2-羟基-3-[三(羟甲基)甲基氨基]-1-丙磺酸)、TES(N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)、bicine(N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸)、tricine(N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸)、tris(三(羟甲基)氨基甲烷)以及bis-tris(2-[二(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇)。在一些实施方案中,所述制剂包含Tris-HCl。在一些实施方案中,所述制剂包含羟基四氢嘧啶和Tris-HCl。
在一些实施方案中,用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分基本稳定储存的制剂包含离子。在一些实施方案中,该离子是钠离子或氯离子,或其组合。
在一些实施方案中,用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分基本稳定储存的制剂包含螯合剂。在一些实施方案中,该螯合剂是EDTA。
在一些实施方案中,所述制剂包含牛磺酸变体。在一些实施方案中,该牛磺酸变体是TES(N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)。
在一些实施方案中,用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分基本稳定储存的制剂包含去污剂。在一些实施方案中,该去污剂是吐温20或吐温80。
用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下基本稳定储存的示例性制剂示于表1中。
表1:用于稳定PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分的示例性制剂
用于在环境温度下稳定PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分的制剂的制备方法
本文所述的用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下基本稳定储存的制剂的制备方法采用本领域技术人员熟知的技术,并且通常使用可商购的试剂。在一些实施方案中,将该制剂制备为配制试剂的浓缩储备溶液,例如2X、5X、10X、20X等,以便与PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分以适当的比例混合,从而形成所需浓度。
在环境温度下稳定储存的PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分的组合物
在一些实施方案中,提供了在环境温度下稳定储存的PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分的组合物。在一些实施方案中,将PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种稳定储存的组分与本文提供的制剂相混合。
制品
在某些实施方案中,提供了制品,其包含本文提供的容纳在合适的容器或器皿中的制剂。这些制品可用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分基本稳定的储存。在一些实施方案中,所述制剂选自表1中列出的那些。在一些实施方案中,这些制品用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分基本稳定的储存。在一些实施方案中,这些制品在本文所述的试剂盒和方法中使用。
试剂盒
在本发明的某些方面,提供了试剂盒,该试剂盒包含任意一种含有本发明制剂的制品以及包装插页。在一些实施方案中,该试剂盒的组件装在容器中,诸如带隔室的塑料包围结构中。在一些实施方案中,该容器具有可严密密封的盖子,使得该试剂盒的内容物在使用前可消毒并密封储存。
使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下基本稳定储存的方法
在本发明的另一个方面,提供了使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下基本稳定储存的方法。
在某些实施方案中,所述方法包括将PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分与本文所述的用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分基本稳定储存的制剂相混合,其中PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分在储存后保持稳定至少三个月的时间。在一些实施方案中,至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%、至少50%的PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分在环境温度下保持稳定至少三个月的时间。在一些实施方案中,至少80%的PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分在环境温度下保持稳定至少三个月的时间。
在一些实施方案中,至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%、至少50%的PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分在环境温度下保持稳定至少一个月、至少两个月、至少三个月、至少四个月、至少五个月、至少六个月、至少七个月、至少八个月、至少九个月、至少十个月、至少11个月、至少12个月、至少15个月、至少18个月、至少21个月、至少24个月的时间。在一些实施方案中,至少80%的PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分在环境温度下保持稳定至少一个月、至少两个月、至少三个月、至少四个月、至少五个月、至少六个月、至少七个月、至少八个月、至少九个月、至少十个月、至少11个月、至少12个月、至少15个月、至少18月、至少21个月、至少24个月的时间。
在一些实施方案中,PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分包含PCR主混合物或RT-PCR主混合物。在一些实施方案中,PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分包含RT-PCR内部对照模板核酸。在一些实施方案中,PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分包含披甲RNA。在一些实施方案中,PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分包含聚合酶。在一些实施方案中,PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分包含DNA聚合酶。在一些实施方案中,PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分包含披甲RNA和聚合酶。
在某些实施方案中,所述制剂是表1中所述的制剂之一。
如本文所述的方法可使用本文公开的制品和试剂盒。
以下实施例以说明而非限制的方式给出。
实施例1
在环境温度以上aRNA稳定至少一个月
该实施例描述了用于稳定定量标准(QS)-披甲RNA(aRNA)的本发明制剂和组合物。
将75μl体积的aRNA储备溶液(Roche,与HIV-1 QS具有相似的组成,HIV-1 QS是包含Tris-HCl、EDTA、披甲HIV-1 RNA和叠氮化钠的试剂盒#03542998 190的一部分)与75μl稳定剂合并,并在指定温度下温育。
在指定时间点,通过热破裂或使用MagNA Pure compact总核酸分离试剂盒处理aRNA样品。
对于热破裂,将2μl aRNA样品加入到18μl洗脱缓冲液(Roche,与EB具有相似的组成,EB是包含Tris和对羟基苯甲酸甲酯的试剂盒#03542998 190的一部分)中。然后将其加热至70℃保持5分钟,并立即置于冰上。在35μl终体积的RT-PCR反应中使用4μl体积的该混合物作为模板,该反应具有以下其他组分:12.5μl含有约1500个拷贝的HIV靶RNA的洗脱缓冲液、7μl Mn2+溶液(Roche,与CAP/CMT Mn2+具有相似的组成,CAP/CMT Mn2+是包含乙酸锰、叠氮化钠、乙酸的试剂盒#03542998 190的一部分)、1μl BSA溶液(在洗脱缓冲液中为50mg/ml)和10.5μl RT-PCR主混合物溶液(Roche,与HIV-1 MMX具有相似的组成,HIV-1 MMX是试剂盒#03542998 190的一部分,但使用修饰的聚合酶,且包含tricine、乙酸钾、氢氧化钾、甘油、二甲亚砜、叠氮化钠、dATP、dCTP、dGTP、dUTP、尿嘧啶N-糖基化酶、适体、引物混合物、探针混合物,pH 8.1)。
对于MagNA Pure处理,将10μl aRNA样品加入到含有约5000个拷贝的HIV RNA的190μl人血浆中,并按照制造商的说明使用总核酸分离试剂盒进行处理。洗脱体积为100μl。在35μl终体积的RT-PCR反应中使用16.5μl体积的洗脱液作为模板,该反应具有以下其他组分:7μl Mn2+溶液、1μl BSA溶液和10.5μl RT-PCR主混合物溶液。
RT-PCR反应在BioRad CFX96上进行,具有以下循环条件:55℃持续30秒,60℃持续30秒,65℃持续30秒,95℃持续3秒和55℃持续15秒进行5个循环,然后进行平板读取,以及91℃持续5秒和58℃持续15秒进行38个循环,然后进行平板读取。
示例性制剂示于以下表2中。图1A-D中的数据显示,含有制剂01的样品与NFC相比具有较低的Ct值和改善的荧光,表明从这些样品产生的RNA的量增加。图2A-B显示,含有制剂02的样品与NFC相比具有较低的Ct值,表明从这些样品产生的RNA的量增加。图3A-B显示,含有制剂01、02和04的样品与NFC相比具有较低的Ct值,表明从这些样品产生的RNA的量增加。在这些实验中测试的所有其他制剂均显示出等于或高于NFC的Ct值的Ct值,表明RNA产率或稳定性未得到改善(图3A-B)。
表2:示例性储存制剂
名称 | 组分1 | 组分2 | 组分3 |
01 | 10%乳酸 | 50mM硼酸 | 10mM四硼酸钠 |
02 | 7.5%乳酸 | 324mM硼酸 | |
03 | 50mM硼酸 | 10mM四硼酸钠 | |
04 | 10%乳酸 | ||
05 | 10%苹果酸 | 100mM硼酸 | |
06 | 2%苹果酸 | 20mM硼酸 | |
07 | 10%丙二酸 | 100mM硼酸 | |
08 | 2%丙二酸 | 20mM硼酸 | |
09 | 10%酒石酸 | 100mM硼酸 | |
10 | 2%酒石酸 | 20mM硼酸 | |
11 | 2%柠檬酸 | 20mM硼酸 |
实施例2
RT-PCR主混合物的稳定化
该实施例描述了用于在升高的温度下稳定RT-PCR主混合物(Roche,与HIV-1 MMX具有相似的组成,HIV-1 MMX是试剂盒#03542998 190的一部分)至少14天时间的本发明制剂和组合物。
将84μl体积的稳定剂与84μl 1.5x RT-PCR主混合物合并,并在指定温度下储存。在每个时间点,将14μl RT-PCR主混合物-稳定剂混合物加入到35μl终体积的RT-PCR反应中,该反应具有以下其他组分:3.5μl Mn2+溶液、1μl BSA溶液和16.5μl含有约1×104个拷贝的纯化QS RNA靶标和100个拷贝的纯化HIV RNA靶标的洗脱缓冲液。RT-PCR反应在BioRadCFX96上进行,具有以下循环条件:55℃持续30秒,60℃持续30秒,65℃持续30秒,95℃持续3秒和55℃持续15秒进行5个循环,然后进行平板读取,以及91℃持续5秒和58℃持续15秒进行38个循环,然后进行平板读取。
示例性制剂示于以下表3中。图4A-C中的数据显示,与NFC相比,含有所示制剂的样品对于两种RT-PCR靶标(HIV和QS)均具有较低的Ct值。
表3:示例性储存制剂
名称 | 组分1 | 组分2 |
12 | 50%蔗糖 | 50mM Tris-HCl pH 8.0 |
13 | 900mM蔗糖 | 50mM牛磺酸pH 8.8 |
14 | 5%(v/v)二甲基丙酰胺 | 50mM牛磺酸pH 8.8 |
15 | 5%(v/v)二甲基乙酰胺 | 50mM牛磺酸pH 8.8 |
16 | 10%(w/v)PEG 8000 | 50mM牛磺酸pH 8.8 |
17 | 10%(w/v)PEG 400 | 50mM牛磺酸pH 8.8 |
18 | 5%(v/v)二甲基甲酰胺 | 100mM牛磺酸pH 8.8 |
19 | 5%(v/v)丁酰胺 | 100mM牛磺酸pH 8.8 |
20 | 5%(v/v)二甲基异丁酰胺 | 100mM牛磺酸pH 8.8 |
21 | 5%(v/v)甲基丙酰胺 | 100mM牛磺酸pH 8.8 |
除非上下文另有要求,否则在本说明书和权利要求书通篇中,词语“包含”及其变化形式(其可与“包括”、“含有”或“特征在于”互换使用)是包含性或开放式语言,并且不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。短语“由……组成”排除权利要求中未指明的任何要素、步骤或成分。短语“基本由……组成”将权利要求的范围限制于指明的物质或步骤以及那些实质上不影响所请求保护的发明的基本特性及新特性的物质或步骤。本公开内容涵盖对应于这些短语中每一个的范围的本发明组合物及方法的实施方案。因此,包含所列举的要素或步骤的组合物或方法涵盖其中组合物或方法基本由这些要素或步骤组成或者由这些要素或步骤组成的具体实施方案。
本说明书通篇提及的“一个实施方案”或“实施方案”或“方面”意指与该实施方案相关联地描述的具体特征、结构或特性包含在本发明的至少一个实施方案中。因此,短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”在本说明书全文各处的出现并不一定都指的是同一个实施方案。此外,这些具体特征、结构或特性可以在一个或多个实施方案中以任何合适的方式组合。
以上描述的各种实施方案可进行组合以提供进一步的实施方案。可根据以上详述的说明对实施方案作出这些和其它改变。总之,在所附的权利要求中,所采用的术语不应解释为将权利要求限制于说明书和权利要求书中公开的具体实施方案,而应解释为包括这些权利要求所请求保护的所有可能的实施方案以及等同方案的全部范围。因此,权利要求不受公开内容的限制。
尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案,但对于本领域技术人员显而易见的是这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将会想到多种变化、改变和替代。应当理解,本文中所述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。目的在于以下述权利要求限定本发明的范围,并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
Claims (28)
1.一种混合物,其包含:
(a)用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下基本稳定储存的制剂,该制剂包含:
(i)羟基酸,和
(ii)硼酸盐组合物;以及
(b)PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分;
其中所述PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下储存后保持稳定至少三个月的时间。
2.根据权利要求1所述的混合物,其中所述羟基酸是式(I)化合物:
其中R1选自H、未取代或取代的烷基或者未取代或取代的芳基。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的混合物,其中所述羟基酸选自乳酸、苹果酸、丙二酸、酒石酸、柠檬酸及其组合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的混合物,其中所述羟基酸是乳酸。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的混合物,其中所述硼酸盐组合物包含选自硼酸、硼酸盐、四硼酸钠、硼砂及其组合的化合物。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的混合物,其中所述制剂包含(i)乳酸和硼酸;或(ii)乳酸、硼酸和四硼酸钠。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的混合物,其中PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分包含对照核酸。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的混合物,其中PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分包含披甲RNA。
9.一种混合物,其包含:
(a)用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下基本稳定储存的制剂,该制剂包含:
(i)非还原糖,和
(ii)缓冲液;以及
(b)PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分;
其中所述PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下储存后保持稳定至少三个月。
10.根据权利要求9所述的混合物,其中所述非还原糖选自蔗糖和海藻糖。
11.根据权利要求9-10中任一项所述的混合物,其中所述缓冲液选自Tris-HCl、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、磺基水杨酸、磺基间苯二甲酸、草酸、硼酸盐、CAPS(3-(环己基氨基)-1-丙磺酸)、CAPSO(3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸)、EPPS(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸)、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)、MES(2-(N-吗啉基)乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)、MOPSO(3-吗啉基-2-羟基丙磺酸)、PIPES(1,4-哌嗪二乙磺酸)、TAPS(N-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸)、TAPSO(2-羟基-3-[三(羟甲基)甲基氨基]-1-丙磺酸)、TES(N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)、bicine(N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸)、tricine(N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸)、tris(三(羟甲基)氨基甲烷)以及bis-tris(2-[二(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇)。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的混合物,其中所述制剂包含蔗糖和Tris-HCl。
13.一种混合物,其包含:
(a)用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下基本稳定储存的制剂,该制剂包含:
(i)氨基磺酸或硫酸铵,和
(ii)非还原糖、酰胺或聚乙二醇中的至少一种;以及
(b)PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分;
其中所述PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下储存后保持稳定至少三个月的时间。
14.根据权利要求13所述的混合物,其中所述制剂包含式(II)的氨基磺酸:
其中R1和R2独立地选自H、未取代或取代的烷基和未取代或取代的芳基。
15.根据权利要求13-14中任一项所述的混合物,其中所述氨基磺酸是牛磺酸。
16.根据权利要求13所述的混合物,其中所述制剂包含硫酸铵。
17.根据权利要求13-16中任一项所述的混合物,其中所述制剂包含选自蔗糖和海藻糖的非还原糖。
18.根据权利要求13-17中任一项所述的混合物,其中所述非还原糖是蔗糖。
19.根据权利要求13-18中任一项所述的混合物,其中所述制剂包含选自式(III)化合物的酰胺:
其中R1、R2和R3独立地选自H、未取代或取代的烷基和未取代或取代的芳基。
20.根据权利要求13-18中任一项所述的混合物,其中所述制剂包含选自N,N-二甲基丙酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、丁酰胺和二甲基甲酰胺的酰胺。
21.根据权利要求13-18中任一项所述的混合物,其中所述制剂包含二甲基异丁酰胺。
22.根据权利要求13-18中任一项所述的混合物,其中所述制剂包含甲基丙酰胺。
23.根据权利要求13-18中任一项所述的混合物,其中所述制剂包含聚乙二醇。
24.根据权利要求23所述的混合物,其中所述聚乙二醇是PEG8000或PEG 400。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的混合物,其中PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分包含聚合酶。
26.一种用于使PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分在环境温度下基本稳定储存的方法,其包括:将PCR或RT-PCR反应混合物的一种或多种组分与选自下组的制剂混合:
a)包含羟基酸和硼酸盐组合物的制剂;
b)包含非还原糖和缓冲液的制剂;
c)包含以下成分的制剂:i)氨基磺酸或硫酸铵,和ii)非还原糖、酰胺或聚乙二醇中的至少一种;
其中PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分在环境温度下储存后保持稳定至少三个月的时间。
27.根据权利要求26所述的方法,其中至少80%的PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分在环境温度下保持稳定至少三个月的时间。
28.根据权利要求26-27中任一项所述的方法,其中PCR或RT-PCR反应混合物的所述一种或多种组分是RT-PCR主混合物、RT-PCR内部对照模板核酸或其组合。
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