CN108588133A - 橡子果液态发酵制备柠檬酸的方法 - Google Patents

橡子果液态发酵制备柠檬酸的方法 Download PDF

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CN108588133A CN201810293847.1A CN201810293847A CN108588133A CN 108588133 A CN108588133 A CN 108588133A CN 201810293847 A CN201810293847 A CN 201810293847A CN 108588133 A CN108588133 A CN 108588133A
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张宝善
朱莉莉
李林强
裴亚利
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Abstract

本发明公开了一种橡子果液态发酵制备柠檬酸的方法，该方法先将橡子粉用乙醇水溶液脱除酚类物质，减少橡子粉中发酵微生物抑制因子，提高淀粉的利用率；然后进行糊化、液化，调整液化液总糖含量后，添加豆腐黄浆水和甲醇，再接种驯化后的黑曲霉CICC 2716进行发酵，并在发酵过程中补充糖化酶，大大提高了橡子粉液化液发酵柠檬酸的产量；最后通过浓缩结晶、纯化等过程得到柠檬酸晶体。本发明方法简单，柠檬酸的产量高，提高了橡子粉的转化利用率，而且节约了时间成本及设备成本。

Description

橡子果液态发酵制备柠檬酸的方法
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种橡子果发酵制备柠檬酸的方法。
背景技术
橡子果是壳斗科栎属植物的种子，俗称橡子。我国橡子资源丰富，全国橡树种植面积达200～250万公顷，年产量约1000万吨，主要分布在云南、陕西、湖南、蒙古等地，其中陕西省橡子年产量约占全国1/3，主要集中在陕南三市。橡子果营养物质丰富，中国学者测定橡子仁含淀粉50％～70％、可溶性糖2％～8％、单宁0.26％～17.74％、蛋白质1.17％～8.72％、油脂1.04％～6.86％、粗纤维1.13％～5.89％、灰分1.30％～3.40％。橡子果虽然含有丰富的淀粉、蛋白质等营养物质，但其加工利用率比较低，主要原因是橡子果中含有较多单宁等抗营养因子，且有较强的涩感，使用有很大的局限性。由于橡子果成分中大部分均是淀粉，有些食品加工者将橡子提取粗淀粉加工成橡子凉粉、橡子面条，也有被用作饲料的，但并不普及，利用率很低。橡子资源没有被充分开发利用，造成很大的资源浪费。
柠檬酸作为一种酸味调味剂和添加剂，有很高的实用和应用价值，广泛应用于食品、医药、化妆品、化工等领域，是当前世界上产量和消费量最大的食用有机酸，其全球市场需求量逐年增长，平均每年以5％的速度增长。利用木本植物资源发酵柠檬酸不仅可缓解世界粮食压力，还可以实现资源的充分利用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种橡子果发酵制备柠檬酸的方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：
1、脱单宁橡子粉的制备
收集无污染、霉变的成熟橡子果，自然晒干或在60～70℃的热风干燥机中烘干，用去壳机分离去除橡子壳后，粉碎果实，过60目筛网，得到橡子粉；将橡子粉与体积分数为60％～80％的乙醇水溶液按重量比为1∶5混合，充分搅拌60分钟，用三足式离心机离心，除去上清液，自然晒干或烘干，得到脱单宁橡子粗淀粉。
2、橡子粗淀粉的糊化
向步骤1得到的脱单宁橡子粗淀粉中添加自来水，调整橡子粉浆含水量为75％～85％，将橡子粉浆在糊化罐中加热至90～100℃，保温糊化30分钟，糊化过程中不断搅拌。
3、α-淀粉酶液化
将步骤2糊化后的橡子粉浆冷却至55～65℃，用氢氧化钙调节pH值为6.0～6.5，加入酶活为3700U/g的α-淀粉酶，α-淀粉酶加入量为脱单宁橡子粗淀粉质量的0.8％～1.2％，在50～70℃保温液化，直至碘化钾试剂检测液化液的颜色不变为止，得到橡子粉液化液。
4、发酵菌种的活化和驯化
将黑曲霉CICC 2716接种于PDA培养基上，28℃培养6～7天进行活化；将活化后的黑曲霉CICC 2716接种于柠檬酸含量为18～22g/L、氯化铵含量为3～5g/L、可溶性固形物含量为14％～16％的橡子粉液化液中，在31℃下进行第一代驯化，培养时间为36小时；将第一代驯化后的黑曲霉CICC 2716接种于柠檬酸含量为38～42g/L、氯化铵含量为3～5g/L、可溶性固形物含量为14％～16％的橡子粉液化液中，在31℃下进行第二代驯化，培养时间为36小时；将第二代驯化后的黑曲霉CICC 2716接种于柠檬酸含量为58～62g/L、氯化铵含量为3～5g/L、可溶性固形物含量为14％～16％的橡子粉液化液中，在31℃下进行第三代驯化，培养时间为36小时；将驯化三代后的黑曲霉CICC 2716接种于分离筛选平板上，28℃培养2～3天，所述的分离筛选平板向柠檬酸含量为45～55g/L、氯化铵含量为3～5g/L、可溶性固形物含量为14％～16％的橡子粉液化液中添加18～22g/L琼脂后形成；根据高产菌株的形态特征，从分离筛选平板上挑出单一菌落，分别移接于PDA斜面培养基上，28℃培养6～7天，孢子长好后，分别接入α-萘酚含量为0.8～1.2mg/L、氯化铵含量为3～5g/L、可溶性固形物含量为14％～16％的橡子粉液化液中，31℃下培养60小时，筛选出柠檬酸产量高、糖转化率高且产酸稳定性强的菌种。
5、发酵培养基的配制
取橡子粉液化液，调整其总糖含量为110～130g/L，然后加入橡子粉液化液体积2.5％～7.5％的豆腐黄浆水，用NaOH调节pH为5.5～6.0，在保温罐中95～100℃杀菌10分钟，冷却至常温后加入橡子粉液化液体积0.2％～0.4％的甲醇，得到发酵培养基；
6、黑曲霉发酵
将步骤4筛选的菌株接种到PDA培养基上，28℃培养6～7天，用无菌水将培养基上孢子洗下，剧烈振荡，制成均匀的孢子悬液，孢子数达4.6～5.4×107个/mL；将步骤5得到的发酵培养基在无菌条件下加入发酵罐中，按接种量1.25％～3.75％接入孢子悬液，并在搅拌状态下通入无菌空气，保持发酵液中的溶氧量为0.35～0.45m3/(m3·min)，在31℃发酵36小时后，向发酵液中加入酶活为10000U/mg的糖化酶，糖化酶添加量为发酵培养基质量的0.0004％～0.0006％，继续发酵24小时，得到柠檬酸发酵醪。
7、柠檬酸的提取
将柠檬酸发酵醪在75～90℃保持5分钟，采用加压式过滤机过滤，在滤液中加入过量碳酸钙粉末，80℃保持5分钟使柠檬酸钙沉淀出来，将沉淀用沸水洗涤2次后，在沉淀中加入2倍体积的蒸馏水，并在搅拌条件下加入0.15mol/L硫酸水溶液，80℃保温10分钟，趁热过滤得到酸解液；将酸解液分别通过粉状酸性活性炭柱、阳离子交换树脂柱和阴离子交换树脂柱，得到精柠檬酸溶液；精柠檬酸溶液经过双效蒸发器减压浓缩，一效温度70～80℃，二效温度50～60℃，浓缩液在间歇式结晶器中于30～35℃下结晶得一水柠檬酸晶体，采用对流式干燥法在30℃下干燥，得到柠檬酸晶体。
上述步骤1中，优选将橡子粉与体积分数为70％的乙醇水溶液按重量比为1∶5混合，充分搅拌60分钟。
上述步骤5中，优选调整橡子粉液化液总糖含量为120g/L，然后加入橡子粉液化液体积5％的豆腐黄浆水，用NaOH调节pH为5.5～6.0，在保温罐中95～100℃杀菌10分钟，冷却至常温后加入橡子粉液化液体积0.3％的甲醇，得到发酵培养基。
上述步骤6中，优选将步骤5得到的发酵培养基在无菌条件下加入发酵罐中，按接种量2.5％接入孢子悬液，并在搅拌状态下通入无菌空气，保持发酵液中的溶氧量为0.4m3/(m3·min)，在31℃发酵36小时后，向发酵液中加入酶活为10000U/mg的糖化酶，糖化酶添加量为发酵培养基质量的0.0005％，继续发酵24小时，得到柠檬酸发酵醪。
本发明的有益效果如下：
本发明通过乙醇水溶液脱除橡子粉中的酚类物质，大大提高了橡子粉的液化效率及发酵柠檬酸产量，提高淀粉的利用率，减少橡子粉中发酵微生物抑制因子；在橡子粉液化液中接入驯化后的黑曲霉CICC 2716进行柠檬酸发酵，然后通过在发酵过程中补充糖化酶的发酵方式，使柠檬酸产量有了较大程度的提高。本发明方法简单，提高了橡子粉的转化利用率和柠檬酸的产量，而且节约了时间成本及设备成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
1、脱单宁橡子粉的制备
收集无污染、霉变的成熟橡子果，自然晒干，用去壳机分离去除橡子壳后，粉碎果实，过60目筛网，得到橡子粉；将1kg橡子粉加入5kg体积分数为70％的乙醇水溶液中，充分搅拌60分钟，脱除单宁及其它酚类物质，然后用三足式离心机在1000转/分钟下离心10分钟，除去上清液，固体沉淀物自然晒干，得到脱单宁橡子粗淀粉。
2、橡子粗淀粉的糊化
向0.5kg脱单宁橡子粗淀粉中添加2kg自来水，使橡子粉浆含水量为80％，将橡子粉浆在糊化罐中加热至95℃，保温糊化30分钟，糊化过程中不断搅拌。
3、α-淀粉酶液化
将步骤2糊化后的橡子粉浆冷却至60℃，用氢氧化钙调节pH值为6.0～6.5，加入5g酶活为3700U/g的α-淀粉酶，在60℃保温液化，直至碘化钾试剂检测液化液的颜色不变为止，液化时间大约40min，得到橡子粉液化液，其总糖含量为100g/L、可溶性固形物含量为18％。
4、发酵菌种的活化和驯化
将黑曲霉(Aspergillus niger)CICC 2716接种于PDA培养基上，28℃培养6天进行活化。将活化后的黑曲霉CICC 2716接种于柠檬酸含量为20g/L、氯化铵含量为4g/L、可溶性固形物含量为15％的橡子粉液化液中，在31℃、200转/分钟下进行第一代驯化，培养时间为36小时；将第一代驯化后的黑曲霉CICC 2716接种于柠檬酸含量为40g/L、氯化铵含量为4g/L、可溶性固形物含量为15％的橡子粉液化液中，在31℃、200转/分钟下进行第二代驯化，培养时间为36小时；将第二代驯化后的黑曲霉CICC 2716接种于柠檬酸含量为60g/L、氯化铵含量为4g/L、可溶性固形物含量为15％的橡子粉液化液中，在31℃、200转/分钟下进行第三代驯化，培养时间为36小时。将驯化三代后的黑曲霉CICC 2716接种于柠檬酸含量为50g/L、氯化铵含量为4g/L、琼脂含量为20g/L、可溶性固形物含量为15％的橡子粉液化液形成的分离筛选平板上，28℃培养2天。根据高产菌株的形态特征，从分离筛选平板上挑出单一菌落，分别移接于PDA斜面培养基上，28℃培养6天。孢子长好后，分别接入α-萘酚含量为1mg/L、氯化铵含量为4g/L、可溶性固形物含量为15％的橡子粉液化液中，31℃、200转/分钟下培养60小时，筛选出柠檬酸产量高、糖转化率高且产酸稳定性强的菌种。
5、发酵培养基的配制
取2L橡子粉液化液，减压浓缩调整其总糖含量为120g/L，加入100mL含氮量为16.8％的豆腐黄浆水，混合均匀，用NaOH调节pH为5.5～6.0，在保温罐中100℃下杀菌10分钟，冷却至常温，加入6mL甲醇，得到发酵培养基。
6、黑曲霉发酵
将步骤4筛选的菌株接种到PDA培养基上，28℃培养6天，用无菌水将培养基上孢子洗下，剧烈振荡，制成均匀的孢子悬液，孢子数达4.6～5.4×107个/mL；将2kg步骤5得到的发酵培养基在无菌条件下加入5L发酵罐中，加入50g孢子悬液，并在搅拌状态下通入无菌空气，保持发酵液中的溶氧量为0.40m3/(m3·min)，在31℃发酵36小时后，向发酵液中加入0.01g酶活为10000U/mg的糖化酶，继续发酵24小时，得到柠檬酸发酵醪。
7、柠檬酸的提取
将柠檬酸发酵醪在85℃保持5分钟，采用加压式过滤机过滤，在滤液中加入300g碳酸钙粉末，80℃保持5分钟使柠檬酸钙沉淀出来，将沉淀用沸水洗涤2次后，在沉淀中加入其2倍体积的蒸馏水，并在搅拌条件下加入450mL0.15mol/L硫酸水溶液，80℃保温10分钟，趁热过滤得到酸解液；将酸解液分别通过粉状酸性活性炭柱、阳离子交换树脂柱和阴离子交换树脂柱，去除粗柠檬酸溶液中色素及Ca2+、SO4 2-、Cl-等离子，得到精柠檬酸溶液；精柠檬酸溶液经过双效蒸发器减压浓缩，一效温度70～80℃，二效温度50～60℃，浓缩液在间歇式结晶器中于30～35℃下结晶得一水柠檬酸晶体，采用对流式干燥法在30℃下干燥，除去湿柠檬酸表面的游离水，而又不失去一水柠檬酸的结晶水，得到晶型和晶体表面光洁度良好的柠檬酸晶体。柠檬酸的产量为90.62g。
为了确定本发明的工艺条件，发明人进行了大量的实验室研究试验，具体试验情况如下：
一、实验材料
橡子果粉：橡子果采自秦岭西麓，自然晒干、去壳后粉碎。
发酵菌种：黑曲霉(Aspergillus niger)CICC 2716和黑曲霉(Aspergillusniger)CICC 2160均来自于中国工业微生物菌种保藏管理中心；黑曲霉(Aspergillus niger)QL-1为齐鲁大学微生物实验室保存的菌种。
二、测定方法
还原糖用3,5-二硝基水杨酸法测定；总糖用3,5-二硝基水杨酸法测定；菌悬液浓度用平板菌落计数法测定；柠檬酸含量用酸碱滴定法测定，并用纸上层析法进行柠檬酸的鉴定；总酚含量测定采用酒石酸亚铁法；蛋白质含量采用凯氏定氮法测定；菌体量的测定采用称重法。
三、实验内容
1、不同脱除时间对橡子粉成分及液化的影响
将橡子粉与体积分数为70％的乙醇水溶液按重量比为1∶5混合，分别搅拌0、30、60、90、120分钟，用三足式离心机1000转/分钟离心，除去上清液，自然晒干，得到脱单宁橡子粗淀粉，对不同脱除时间得到的脱单宁橡子粗淀粉的总酚及蛋白质含量进行测定。然后向脱单宁橡子粗淀粉中添加自来水，调整橡子粉浆含水量为80％，将橡子粉浆在糊化罐中加热至95℃，保温糊化30分钟，糊化过程中不断搅拌。糊化结束后冷却至60℃，用氢氧化钙调节pH至6.0～6.5，加入酶活为3700U/g的α-淀粉酶，α-淀粉酶加入量为脱单宁橡子粗淀粉质量的1％，在60℃保温液化，直至碘化钾试剂检测液化液的颜色不变为止，测定液化结束时间及液化液中总糖及还原糖含量。测定结果见表1。
表1脱除时间对橡子粉成分及液化的影响
由表1可知，脱除时间为60分钟时，橡子粉的总酚含量降低了56.31％；脱除时间为120分钟时，橡子粉的总酚含量降低了67.23％，对橡子粉多酚有良好的脱除作用。脱除时间为120分钟时，蛋白质含量由29.31mg/g降到24.31mg/g，表明橡子粉蛋白质在体积分数为70％的乙醇水溶液中有一定的溶解性。液化完成时间随着脱除时间的延长而有所降低，这可能由于多酚与α-淀粉酶结合，降低了酶活，使液化完成时间有所降低。橡子粉液化完全时，总糖含量为63.21g/L，低于其他组；脱除时间大于60分钟，液化完全时的总糖含量之间差异不明显，说明当多酚含量低于5.64mg/g时，多酚不再是液化的限制因素。脱除时间为60分钟时，液化完全的还原糖含量为63.77g/L，高于脱除时间为120分钟和未经处理的橡子粉，说明液化完全的还原糖含量不仅与多酚脱除时间有关，还受液化时间的影响，当多酚含量不再是限制因素时，液化完成时间越短，还原糖含量越低。
2、不同脱除时间对橡子粉液化液糖化的影响
将上述不同脱除时间得到的橡子粉液化液保持在60℃，用6mol/L盐酸将橡子粉液化液调节至pH值为4.5，加入酶活为10000U/mg的糖化酶，糖化酶加入量为橡子粉液化液质量的0.0005％，在搅动状态下保温糖化10小时，每隔2小时进行还原糖含量的测定，结果见表2。
表2脱除时间对橡子粉液化液糖化的影响
由表2可知，糖化6小时之前不同脱除时间对应的橡子粉液化液均不能糖化完全，初始糖化速率随脱除时间的延长而提高。未经处理的橡子粉液化液糖化效率约为67％，不同脱除时间的最终还原糖浓度均有明显提高；当脱除时间为60分钟时，糖化10小时的还原糖浓度为97.63g/L，高于未处理(64.95g/L)和脱除时间为30分钟(77.32g/L)的还原糖浓度，结果表明多酚对糖化酶有一定抑制作用；当脱除时间为120分钟时，糖化10小时的还原糖浓度为92.42g/L，低于脱除时间为60分钟，当多酚不再是限制因素，随着脱除时间的延长，糖化后的还原糖含量有所下降，这可能与液化液中淀粉和蛋白质的变化有关。
3、不同脱除时间液化液的柠檬酸发酵
取40mL不同脱除时间得到的橡子粉液化液于250mL三角瓶中，用NaOH调节pH为5.5～6.0，95℃下杀菌10分钟，冷却至常温，接入1mL孢子数达4.6～5.4×107个/mL的孢子悬液，置于恒温振荡器中发酵，发酵温度31℃，摇床转速200转/分钟，发酵时间60小时，每隔12小时取样测定柠檬酸产量、残还原糖产量及生物量，结果见表3。
表3脱除时间对橡子粉液化液柠檬酸发酵的影响
脱出时间/分钟 柠檬酸产量/g·L-1 残还原糖量/g·L-1 生物量/g·L-1
0 12.29 17.85 10.7
30 17.23 18.62 14.5
60 37.30 23.02 18.6
90 33.42 20.34 18.3
120 30.56 21.21 16.7
由表3可知，未进行多酚脱除和脱除时间为30分钟的橡子粉液化液发酵柠檬酸产量分别为12.29g/L和17.23g/L，明显低于其他脱除时间，说明多酚会抑制柠檬酸的积累，这可能由于多酚会和蛋白质及其他氮源产生沉淀，或螯合金属离子，从而抑制黑曲霉生长，或是抑制黑曲霉分泌糖化酶及其活性，或抑制其他与代谢有关的酶；脱除时间为60分钟的柠檬酸产量(37.30g/L)高于脱除时间为120分钟(30.56g/L)，这可能由于蛋白质含量的减少对发酵产酸不利，氮源是合成细胞物质如蛋白质、氨基酸、核酸、维生素等调节代谢的必需物质，因此当氮源不足时会显著降低柠檬酸的积累。脱除时间为60分钟时，生物量为18.6g/L，高于未处理(10.7g/L)和脱除时间为120分钟(16.7g/L)，说明酚类物质会抑制菌体的生长，当多酚不再是限制因素，氮源的减少会限制菌体的生长。
以上结果显示，脱除时间为60分钟时，对酚类物质有较好的脱除效果。低于60分钟，酚类物质对橡子粉的液化、糖化及发酵均有一定的抑制作用；当多酚不再是限制因素，脱除时间的延长会降低发酵效果，这可能与蛋白质的减少有关。因此选择脱除时间为60分钟的脱单宁橡子粗淀粉进行下一步研究。
4、黑曲霉对橡子果柠檬酸发酵的影响
接种黑曲霉进行柠檬酸发酵，不同种类的黑曲霉对橡子粉糖化液发酵能力不同。本实验选用黑曲霉CICC 2716、黑曲霉CICC 2160、黑曲霉QL-1及驯化后的黑曲霉CICC 2716进行柠檬酸发酵，黑曲霉菌种的扩大培养基均用PDA培养基，将橡子粉糖化液还原糖含量调整为120g/L，用NaOH调节pH为5.5～6.0，95℃下杀菌10分钟，冷却至常温，接种孢子数达4.6～5.4×107个/mL的孢子悬液，接种量为2.5％，发酵温度31℃，摇床转速200转/分钟，连续发酵60小时，发酵效果见表4。
表4黑曲霉菌种对柠檬酸发酵的影响
黑曲霉CICC 2716菌种的最适温度在31℃左右，31℃的柠檬酸产量为30.08g/L，高于黑曲霉CICC 2160和黑曲霉QL-1的最高柠檬酸产量，驯化后的黑曲霉CICC 2716的柠檬酸产量有所提高，最高产量为40.42g/L，柠檬酸产量提高了34.04％。这说明经过驯化后的黑曲霉CICC 2716最适合以橡子粉为原料的柠檬酸发酵。
5、驯化后的黑曲霉CICC 2716接种量对发酵的影响
将橡子粉糖化液还原糖含量调整为120g/L，用NaOH调节pH为5.5～6.0，95℃下杀菌10分钟，冷却至常温，接种孢子数达4.6～5.4×107个/mL的孢子悬液，接种量分别为0.625％、1.25％、2.5％、3.75％，发酵温度31℃，摇床转速200转/分钟，连续发酵60小时，不同接种量对柠檬酸发酵的影响见表5。
表5黑曲霉孢子悬液接种量对柠檬酸发酵的影响
由表5可见，驯化后的黑曲霉CICC 2716孢子悬液接种量为1.25％～3.75％，均有较高的柠檬酸产量。其中当孢子悬液接种量为2.5％时，柠檬酸产量最高，为40.42g/L，而继续增加接种量，产酸量会有所降低，这是由于接种量过大时，菌球体的生长会消耗过多的糖，所以产酸量会有所降低。
6、不同酶解方式橡子粉的柠檬酸发酵
采用驯化后的黑曲霉CICC 2716对脱单宁时间为60分钟的橡子粉液化液、糖化液(液化液糖化6小时)、预糖化液(液化液糖化2小时)以及橡子粉液化液发酵36小时补充糖化酶(酶活10000U/mg，添加量为0.0005％)的发酵液分别进行柠檬酸发酵，孢子悬液接种量为2.5％，发酵温度31℃，摇床转速200转/分钟，连续发酵60小时。不同形式发酵液的柠檬酸发酵结果见表6。
表6不同形式发酵液对柠檬酸发酵的影响
发酵液 柠檬酸产量/g·L-1 残总糖/g·L-1
液化液 37.56 26.94
糖化液 40.42 21.07
预糖化液 40.81 23.36
液化液发酵36h补充糖化酶 42.03 19.57
由表6可见，橡子粉液化液发酵36小时补充糖化酶的发酵液柠檬酸产量为42.03g/L，要高于糖化液(40.42g/L)及预糖化液(40.81g/L)，这可能由于初始高糖浓度会抑制细胞生长；液化液发酵结束后，残糖含量为26.94g/L，显著高于其他三组，这可能由于黑曲霉分泌的糖化酶数量不足，或者由于柠檬酸的积累，pH急速下降导致糖化酶失活。说明橡子粉液化液发酵36小时补充糖化酶能降低发酵液中的残糖含量，提高糖利用率，还能降低初始高浓度糖的抑制作用，提高柠檬酸产量，同时可以减少成本及糖化时间。因此这种在发酵过程中补充糖化酶的发酵方式可以在工厂生产中进行运用。
7、培养基的优化
将橡子粉液化液调整总糖含量为120g/L，然后加入其体积0、2.5％、5％、7.5％的豆腐黄浆水，混合均匀，用NaOH调节pH为5.5～6.0，在保温罐中100℃下杀菌10分钟，冷却至常温，加入橡子粉液化液体积0.3％的甲醇，然后接种孢子悬液进行柠檬酸发酵，接种量为2.5％，发酵温度31℃，摇床转速200转/分钟，连续发酵60小时，并在发酵36小时时补充糖化酶(酶活10000U/mg，添加量为0.0005％)。豆腐黄浆水的添加量对发酵的影响见表7。
表7豆腐黄浆水添加量对发酵的影响
豆腐黄浆水添加量/％ 柠檬酸产量/g·L-1 生物量/g·L-1
0 42.03 18.79
2.5 43.78 19.32
5 45.31 20.12
7.5 44.85 19.04
由表7可见，添加豆腐黄浆水有利于提高柠檬酸产量，这可能由于豆腐黄浆水中含有丰富的氮源、糖类、Mg2+及维生素等营养物质，对菌丝球的生长及代谢有促进作用。当豆腐黄浆水添加量为橡子粉液化液体积的5％时，柠檬酸产量提高了7.8％。氮源是合成细胞物质如蛋白质、氨基酸、核酸、维生素等调节代谢的必须物质，因此当氮源不足时会显著降低生物量及柠檬酸的积累。Mg2+及Mn2+等离子对柠檬酸的积累有着不可或缺的作用，添加豆腐黄浆水补充了促进发酵的离子。因此向发酵液中添加豆腐黄浆水不仅补充了氮源，还弥补了离子的不足，有利于柠檬酸的积累；而且还对豆腐制作过程中的副产物黄浆水这一资源进行了充分的利用。

Claims (4)

1.一种橡子果液态发酵制备柠檬酸的方法，其特征在于该方法由下述步骤组成：
(1)脱单宁橡子粉的制备
收集无污染、霉变的成熟橡子果，自然晒干或在60～70℃的热风干燥机中烘干，用去壳机分离去除橡子壳后，粉碎果实，过60目筛网，得到橡子粉；将橡子粉与体积分数为60％～80％的乙醇水溶液按重量比为1∶5混合，充分搅拌60分钟，用三足式离心机离心，除去上清液，自然晒干或烘干，得到脱单宁橡子粗淀粉；
(2)橡子粗淀粉的糊化
向步骤(1)得到的脱单宁橡子粗淀粉中添加自来水，调整橡子粉浆含水量为75％～85％，将橡子粉浆在糊化罐中加热至90～100℃，保温糊化30分钟，糊化过程中不断搅拌；
(3)α-淀粉酶液化
将步骤(2)糊化后的橡子粉浆冷却至55～65℃，用氢氧化钙调节pH值为6.0～6.5，加入酶活为3700U/g的α-淀粉酶，α-淀粉酶加入量为脱单宁橡子粗淀粉质量的0.8％～1.2％，在50～70℃保温液化，直至碘化钾试剂检测液化液的颜色不变为止，得到橡子粉液化液；
(4)发酵菌种的活化和驯化
将黑曲霉CICC 2716接种于PDA培养基上，28℃培养6～7天进行活化；将活化后的黑曲霉CICC 2716接种于柠檬酸含量为18～22g/L、氯化铵含量为3～5g/L、可溶性固形物含量为14％～16％的橡子粉液化液中，在31℃下进行第一代驯化，培养时间为36小时；将第一代驯化后的黑曲霉CICC 2716接种于柠檬酸含量为38～42g/L、氯化铵含量为3～5g/L、可溶性固形物含量为14％～16％的橡子粉液化液中，在31℃下进行第二代驯化，培养时间为36小时；将第二代驯化后的黑曲霉CICC 2716接种于柠檬酸含量为58～62g/L、氯化铵含量为3～5g/L、可溶性固形物含量为14％～16％的橡子粉液化液中，在31℃下进行第三代驯化，培养时间为36小时；将驯化三代后的黑曲霉CICC 2716接种于分离筛选平板上，28℃培养2～3天，所述的分离筛选平板向柠檬酸含量为45～55g/L、氯化铵含量为3～5g/L、可溶性固形物含量为14％～16％的橡子粉液化液中添加18～22g/L琼脂后形成；根据高产菌株的形态特征，从分离筛选平板上挑出单一菌落，分别移接于PDA斜面培养基上，28℃培养6～7天，孢子长好后，分别接入α-萘酚含量为0.8～1.2mg/L、氯化铵含量为3～5g/L、可溶性固形物含量为14％～16％的橡子粉液化液中，31℃下培养60小时，筛选出柠檬酸产量高、糖转化率高且产酸稳定性强的菌种；
(5)发酵培养基的配制
取橡子粉液化液，调整其总糖含量为110～130g/L，然后加入橡子粉液化液体积2.5％～7.5％的豆腐黄浆水，用NaOH调节pH为5.5～6.0，在保温罐中95～100℃杀菌10分钟，冷却至常温后加入橡子粉液化液体积0.2％～0.4％的甲醇，得到发酵培养基；
(6)黑曲霉发酵
将步骤(4)筛选的菌株接种到PDA培养基上，28℃培养6～7天，用无菌水将培养基上孢子洗下，剧烈振荡，制成均匀的孢子悬液，孢子数达4.6～5.4×107个/mL；将步骤(5)得到的发酵培养基在无菌条件下加入发酵罐中，按接种量1.25％～3.75％接入孢子悬液，并在搅拌状态下通入无菌空气，保持发酵液中的溶氧量为0.35～0.45m3/(m3·min)，在31℃发酵36小时后，向发酵液中加入酶活为10000U/mg的糖化酶，糖化酶添加量为发酵培养基质量的0.0004％～0.0006％，继续发酵24小时，得到柠檬酸发酵醪；
(7)柠檬酸的提取
将柠檬酸发酵醪在75～90℃保持5分钟，采用加压式过滤机过滤，在滤液中加入过量碳酸钙粉末，80℃保持5分钟使柠檬酸钙沉淀出来，将沉淀用沸水洗涤2次后，在沉淀中加入2倍体积的蒸馏水，并在搅拌条件下加入0.15mol/L硫酸水溶液，80℃保温10分钟，趁热过滤得到酸解液；将酸解液分别通过粉状酸性活性炭柱、阳离子交换树脂柱和阴离子交换树脂柱，得到精柠檬酸溶液；精柠檬酸溶液经过双效蒸发器减压浓缩，一效温度70～80℃，二效温度50～60℃，浓缩液在间歇式结晶器中于30～35℃下结晶得一水柠檬酸晶体，采用对流式干燥法在30℃下干燥，得到柠檬酸晶体。
2.根据权利要求1所述的橡子果液态发酵制备柠檬酸的方法，其特征在于：步骤(1)中，将橡子粉与体积分数为70％的乙醇水溶液按重量比为1∶5混合，充分搅拌60分钟。
3.根据权利要求1所述的橡子果液态发酵制备柠檬酸的方法，其特征在于：步骤(5)中，取橡子粉液化液，调整其总糖含量为120g/L，然后加入橡子粉液化液体积5％的豆腐黄浆水，用NaOH调节pH为5.5～6.0，在保温罐中95～100℃杀菌10分钟，冷却至常温后加入橡子粉液化液体积0.3％的甲醇，得到发酵培养基。
4.根据权利要求1所述的橡子果液态发酵制备柠檬酸的方法，其特征在于：步骤(6)中，将步骤(5)得到的发酵培养基在无菌条件下加入发酵罐中，按接种量2.5％接入孢子悬液，并在搅拌状态下通入无菌空气，保持发酵液中的溶氧量为0.4m3/(m3·min)，在31℃发酵36小时后，向发酵液中加入酶活为10000U/mg的糖化酶，糖化酶添加量为发酵培养基质量的0.0005％，继续发酵24小时，得到柠檬酸发酵醪。
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