CN1085729C

CN1085729C - 蜡质芽孢杆菌转基因工程菌构建及生产方法

Info

Publication number: CN1085729C
Application number: CN93108849A
Authority: CN
Inventors: 梅汝鸿; 计平生; 唐文华; 巴峰; 严志农; 吴加志; 梁平彦; 田颖川; 孙良武
Original assignee: Beijing Agricultural University
Current assignee: Beijing Agricultural University; Beijing University of Agriculture
Priority date: 1992-09-10
Filing date: 1993-07-26
Publication date: 2002-05-29
Anticipated expiration: 2013-07-26
Also published as: CN1083862A

Abstract

用苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis var.kurstaki HD-1)的δ内毒素基因和穿梭载体构建的重组质粒，在电击穿孔条件下转化进入了蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus)中。转化子检测证实确有外源基因存在并且能够稳定复制和表达。虫试结果表明该工程菌在4-6天内对鳞翅目幼虫的致死率达80-100%。工程菌对作物的田间增产、抗逆等效果与野生型蜡质芽孢杆菌无显著差异。该工程菌可以进行工业化生产。

Description

蜡质芽孢杆菌转基因工程菌构建及生产方法

本发明涉及向蜡质芽孢杆菌转移杀灭鳞翅目害虫的Bt基因工程菌及工业生产方法。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringsis)是Berliner从地中海粉螟罹病幼虫中分离出的一种芽孢杆菌，1915年命名为苏云金芽孢杆菌。1953年发现它的蛋白质伴孢晶体对鳞翅目幼虫有明显的毒效后，引起了人们广泛的重视。随后，1958年在国外首次出现了商品制剂，1959年发现此菌的一些品系产生热稳定毒素，对几个月昆虫的种类起杀伤作用，从而这种病原细菌很快地商品化。

苏云金芽孢杆菌主要是经口传染昆虫的，它可由菌体本身的活动而导致害虫的死亡，但导致害虫死亡的主要因素是菌体产生的毒素，毒素可使害虫在短时间内中毒死亡。苏云金芽孢杆菌在生产过程中所产生的毒素有几种，其中一类是内毒素，即伴孢晶体，其主要成份是蛋白质。在苏云金芽孢杆菌的孢子囊里，一端是芽孢，另一端是晶体，晶体一般呈菱形、圆形、正方形或不规则形。一个孢子囊一般只有一个晶体，偶然也有两个晶体是一种毒原，经昆虫胃液作用后析出有活性的毒素，受苏云金杆菌感染的鳞翅目幼虫，它们的胃液是碱性，其pH值与苏云金芽孢杆菌的生长繁殖pH相近，并且这个pH液与晶体的溶解程度有关。鳞翅目幼虫在食入毒素后几分钟可引起中肠麻痹，1～7小时肠壁破损，肠内碱性物漏入体腔，引起血液ph增高(增高1～1.5单位)，而导致全身瘫痪而死亡。也有的昆虫中肠麻痹后肠的内含物不漏入体腔，因而血液的pH值基本不变，无全身瘫痪症状，经2～4天死亡。苏云金芽孢杆菌各变种对50多种昆虫有不同程度的致病和毒杀作用。应用于防治农作物叶上那些取食量大、消化液呈碱性的害虫效果好。

由于化学农药对环境的污染引起了人们的不安，加上害虫抗药性的迅速形成，一般化学农药只能使用2～3年。随着生活水平的提高，人们更加关心食品卫生，而且苏云金芽孢杆菌制剂较其它微生物农药毒力高且速效，因此，Bt杀虫剂发展很迅速。例如日本的东亚合成化学公司对苏云金芽孢杆菌制剂已研究了三十五年，先后研制出了Bt死菌制剂和活菌制剂。又如美国的Mycogen专门微生物农药公司与日本的久保田公司合作，总投资20亿日元，开发Bt杀虫剂，现已推出了对斜纹夜蛾、茶小卷叶蛾高效的Bt死菌制剂。又如美国主要的玉米种子生产公司，Lowa州的Hi-Bred公司已放弃使用多年的化学杀虫剂，转向用生物防治剂苏云金芽孢杆菌来防治玉米螟。

与化学农药相比，苏云金芽孢杆菌使用安全，可较长时间保持其活性，害虫抗药性产生慢，但Bt制剂也存在一些缺点，那就是此菌对害虫的作用时间较长，使用效果受低温和阳光的影响，特别是日光的照射，对病原菌的存活有很大影响，在强烈阳光下，苏云金芽孢杆菌容易失活，晶体也发生破坏，对一些钻蛀性的害虫如玉米螟、稻螟蛉等，由于苏云金芽孢杆菌不是植物体内共生菌，只附着于植物体表，因而感染机会不多，防效不稳定。随着生物技术的发展，近年来杀虫微生物的研究国际上进展很快。苏云金芽孢杆菌所产生的毒素蛋白由毒素蛋白基因控制，1977年前苏联首次报道苏云金芽孢杆菌的毒蛋白由大质粒编码，1981年Schnepf等首次克隆了Bt毒蛋白基因：1989年美国的Calogero，S等人已经实现了苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(Bacillus thuring-iensis subsp.kurstaki HD-73)δ-内毒素基因整合到Bacillus subtilis的染色体上并得到表达。1991年，Bar，-E等人，将苏云金芽孢杆菌以色列亚种的δ-内毒素基因克隆于B.sphaericus中并得到表达。

1989年，美国的Crissman，J.W.等人，将来自于Bacillus thuringiensissubsp kurstaki编码对Lepidoptera专化的δ-内毒素基因转移到Bacillussubtilis中得到表达，在细菌生长的对数生长后期时，其毒蛋白含量占全蛋白含量的25％。另外，美国的CGI公司，将Bacillus thuringensis的δ-内毒素基因转入一种Clavibacter xyli subsp.Cynodontis的细菌，构建了重组细菌，进行玉米株的接种，可以阻止European Corn borer的鳞翅目昆虫的幼虫对玉米根的危害。英国剑桥大学和美国华盛顿大学的二个研究小组发现大多数Bt毒蛋白有两个不同的功能区，一个是决定毒素攻击的昆虫种类的结合区，另一个区具有杀昆虫幼虫活性。Bt各菌株间结合区的氨基酸顺序相差很大，而所有毒素的杀幼虫区的氨基酸顺序几乎完全相同。据此，美国加州大学利用重组DNA技术将两种不同的Bt蛋白融和在一起。

目前，转Bt基因工程植株有棉花、蕃茄、烟草、马铃薯等。由于生物的遗传背景复杂，基因的高表达、表达特异性等都很难控制。重组的毒素遍布整株植物，这种蛋白毒素在通过酸性的哺乳动物肠道时并不能被分解。转基因植物中经遗传工程改造的仍保留活性的苏云金芽孢杆菌毒素去掉了蛋白质的N末端，但它对动物的作用方面尚无良好的数据。

本发明的目的是：将苏云金芽孢杆菌的毒素蛋白基因转移到作物增产菌中，构建作物增产菌的转基因工程菌，使得增产菌即能增产又可杀虫。并提供一种相应的便于工业化生产的新方法。

本发明的特征在于一种既能促进作物增产，又能杀灭鳞翅目害虫的工程菌，该菌是蜡质芽孢杆菌Bacillus Cereus，菌种编号：TB 83-10，保藏号：CGMCC NO 0176。

一种转移Bt基因的方法，包括选择宿主菌株、基因分离、基因转移、重组质粒构建、基因分析、基因测试、工业化生产。本发明的转移Bt基因的方法如下：

a、选择作物增产菌为转基因工程的宿主菌株；

b、Bt基因及其相应载体构建重组质粒；

c、重组质粒转化大肠杆菌DH5a；

d、从大肠杆菌中提取重组质粒，并进行质粒纯化、电转化；

e、重组质粒转化进入作物增产菌中，从而获得转基因工程菌；

f、转基因工程菌经过基因分析、稳定性测试、昆虫毒理测试、田间杀虫试验，从而筛选出既有作物增产菌的遗传特性，又有Bt杀虫基因的作物增产菌工程菌菌株保藏号CGMCC NO 0176，保藏日期92年9月3日；

g、作物增产菌工程菌经过菌种活化、扩大培养、种子罐发酵、发酵罐培养，获得在农作物上应用的菌剂产品。

本发明优点和积极效果为：

用作物增产菌作为宿主，引入特异杀鳞翅目害虫的外源基因后，将使作物增产菌在增产、改进品质等方面的基础上，同时成为一种生物杀虫剂，从而赋予增产菌更多的优良性状，进一步提高作物产量和品质。经田间试验结果表明，工程菌杀虫有效率达60％以上，未死的活虫其发育指数明显下降成为僵虫，增产形状同野生型增产菌增产性状统计分析差异不显著。由于增产菌在作物上只是一定时间内形成的种群优势，是一定时间内局部的动态平衡，过一段时间，宿主要恢复其平衡，因而可以避免转基因植物令人担忧的安全性问题。

附图说明：

图1：作物增产菌转移Bt基因流程图

图2：Bt工程菌工业化生产流程图

图3：转移Bt基因工程菌技术路线图

下面叙述发明的实施例：

一、作物增产菌株

作物增产菌的转基因工程菌株，其宿主菌株是从植物体内或体表分离筛选得到的作物增产菌Y-91-010。

(一种蜡质芽孢杆菌菌株CGMCC0137保藏日期1988年9月20)

二、重组质粒DNA的构建

1、作物增产菌的杀虫基因

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis var.Kurstaki HD-1)，其δ-内毒素基因原始克隆的大小为15，5kb，用Hind III酶消解，建立如下酶切体系：

DNA 3μI

酶切缓冲液 2μI

Hind III酯 1μI 37℃下保温2小时

重蒸馏水 13μI

总计 20μI

用1％低融点琼脂糖凝胶电泳后，用溴化乙锭染色，在紫外灯下将4.2Kb的DNA片断切下，装入Eppendorf管中，并加入5倍体积的20mM Tris.HCl(pH8.0)，1mMEDTA。水浴加热15分钟，使其完全熔化后，室温下用正丁醇浓缩，用苯酚/氯仿、氯仿各抽提一次，加入1/10体积的3MnaAc(pH7.0)，在2倍体积冷水乙醇中-70℃下沉淀3小时，离心，70％乙醇洗涤，真空干燥后，溶于重蒸水中。

2、载体大小为5.8Kb，取2μg的载体DNA，加入2μl10倍Hind III酶切缓冲液，加入1μl Hind III酶后于37℃水浴1小时，电泳检测为一条线状质粒带后，将溶液用酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次，加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)、2倍体积冷的无水乙醇，-70℃下沉淀1小时，离心，70％乙醇洗涤。真空干燥后溶于10mMTris.HclpH8.0中。

取5μl载体DNA，用小牛肠道磷酸酯酶(CIP)脱磷酸化，建立如下反应体系：

载体DNA 5μl

10×CIP缓冲液 5μl

CIP(1.4U/μl) 2μl

重蒸馏水 38μl

37℃水浴30分钟

停止反应后，加入40μl重蒸馏水，l0μl10倍SET，5μl10％SDS，在68℃下加热20分钟，用酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次，加入1/10体积3M NaAc(pH7.0)、2倍体积冷无水乙醇-70℃下沉淀1小时，离心，70％乙醇沉淀，真空干燥后溶于重蒸水中。

3、连接时把载体和目的DNA以1∶3的摩尔数，同补充体积的重蒸水混合，55℃水浴加热10分钟，立即放入冰浴中，冷至0℃后建立如下连接反应体系：

DNA(载体+片断) 13μl

10×连接缓冲液 2μl

5mM ATP 2μl

100mMDTT 2μl

T₄DNA连接酶 1μl(2.5U)

总计 20μl12℃下连接过夜，连接后取2μl，电泳后染色观察连接效果。

三、重组质粒转化大肠杆菌DH5α

1、大肠杆菌DH5α菌株的单菌落接种于10ml LB培养液中，37℃培养过夜后取1ml接种于1升三角瓶中的100ml LB液体培养基中，37℃下在300rpm下培养约3小时，使0.D.值在0.5时取出置于冰上；

2、转移到50ml离心管中，冰浴10分钟后以4000rpm离心10分钟，温度4℃，除去上清；

3、将沉淀小心悬浮在10ml 0.1M的Cacl₂溶液中，置于冰上，4℃下4000rpm离心10分钟后除去上清；

4、将沉淀悬浮于2ml 0.1M Cacl₂中，置于冰上；

5、于1.5μl Eppendorf管中加入200μl感受态细胞，加入DNA轻轻混合后放置于冰上30分钟；

6、热激温度42℃，精确热激90秒后迅速置于冰上冰浴2小时；

7、加入800μl SOC培养液，37℃下以225rpm培养45分钟后涂布于含氨苄和新霉素抗性的SOB培养基中(其中含20mMMgSO₄)、37℃下培养12小时后长出转化子，计算转化率；

8、SOB培养基配方为：

胰蛋白胨20克、酵母粉5克、氯化钠0.5克，溶于950ml水后加入10ml250mM的KCl溶液，调pH至7.0，调整体积到1升，灭菌；使用前加入5ml灭菌的2Mmgcl₂溶液；SOC培养基配方为：

胰蛋白胨20克，酵母粉5克，氯化钠0.5克，溶于950ml水后，加入10ml250mM的KCI溶液后调pH至7.0，调整体积至980ml，15磅灭菌后，将培养基冷却至60℃时，加入20ml 1M的葡萄糖溶液。

四、重组质粒DNA的提取：

1、挑取E.coliDH5α-的转化子，在5mlLB液体培养基([Amp]为50μg/ml)中过夜培养后取1ml溶液接种于200ml含相应抗生素的LB液体培养基中37℃下培养12小时。

2、加入氯霉素，使其终浓度为170μg/ml，37℃下继续培养12小时，离心(6000rpm，15mins，4℃)收集沉淀。

3、将菌体悬浮在10ml含5mg/ml溶菌酶的Solution I中，室温下放置30分钟，加入20ml新鲜配制的Solution II中，混匀后冰浴15分钟，小心慢慢摇动；加入15ml冰冷的3MKAc(pH9.8)迅速混匀，冰浴30分钟后离心(15000rpm，4℃，30分钟)弃去沉淀。

4、在上清中加入2倍体积的无水乙醇，充分混合后放置-70℃下1小时后在15000rpm，4℃下离心20分钟回收DNA，用70％乙醇洗涤沉淀，真空干燥后，将沉淀溶于1ml TE(pH8.0)中。

五、重组质粒DNA的纯化：

1、将粗提样品加入2g氯化铯，200μl溴化乙锭(10mg/ml)，定容至2ml；移入Backman 100Ti转头所用的2ml离心管；

2、在20℃下，100Krpm离心16小时；长波紫外光下抽出质粒DNA带，4℃中避光保存；

3、使用水饱和的正丁醇反复抽取，去除溴化乙锭，-20℃下过夜；12Krpm离心20分钟，用70％乙醇洗沉淀2次，抽干后溶于pH8.0的TE中；

4、取1μl DNA酶切后电泳检测。

六、作物增产菌的受体细胞制备；

1、作物增产菌菌株，在LB平板上划线后取单菌落接种于5ml LB培养液中过夜培养；

2、取1ml过夜培养物接种到500ml瓶中的200ml LB培养液中，在37℃下300rpm振荡培养约3小时，使0.D值为0.6时取出，置于冰浴中40分钟后在4000rpm，4℃下离心20分钟收集菌体；

3、用冰冷无菌的1mMHEPES(PH7.0)(N-2羟乙基哌嗪-N′-乙烷磺酸)缓冲液处理菌体2次，每次处理后置于冰浴中10分钟；

4、将菌体悬浮于冰冷的1mM HG缓冲溶液中，冰浴20分钟后分装于Eppendorf管中，每管200μl，-70℃下过夜；

5、HG缓冲溶液配方为：

HEPES：1mM、甘油10％、重蒸水配制后过滤灭菌

七、重组质粒的电转化：

1、受体细胞经冻融后每管加入5μl重组质粒DNA，混匀后置于冰浴中；

2、将DNA和细胞转移到无菌的电转化杯中，电极间距为0.2cm；

3、脉冲波型为指数衰减波，电转常数为：电阻470Ω，电容27μF，电压1.35KV，将电转杯置于电脉冲仪中，接上电极后，施故指数脉冲：

4、取下电转杯立即放于冰上，转移菌至1.5ml Eppendorf管中，加1ml LB培养液，在37℃ 250rpm下精确振荡60分钟；

5、在4℃下3000rpm离心2分钟后，调整菌液体积为200μl；

6、将菌液涂布于合新霉素(5.5μg/ml)的LB平板上，37℃培养16小时，挑取转化子。

八、转化子的酶切分析：

1、取转化子单菌落，接种于含新霉素5.5μg/ml的5ml LB培养液中，37℃下振荡培养过夜。

2、取1ml培养液，离心后倒去上清，加入100μl Solution I混匀，加入溶菌酶，使终浓度为10mg/ml，37℃下保温2小时；

3、加入200μ新鲜配制的Solution II，轻轻混合均匀后置于冰上10分钟，然后加入150ml冰冷的Solution III，置于冰上5分钟；

4、离心后取上清，分别用苯酚、苯酚/氯仿、氯仿抽取后，用无水乙醇沉淀DNA；离心后用70％乙醇洗，真空干燥后溶于50μl TE中。

5、取5μl DNA，加入12μl重蒸水、2μl缓冲液和1μl Hind III酶混匀后置于37℃水浴中，保温1小时；

6、将重组DNA和酶切后DNA同时进行电泳，紫外光下检测外源Bt基因片断的插入，片断大小为4.2Kb。

九、工程菌的毒力试验和田间试验

1、毒力试验：

在新霉素浓度为5.5μg/ml下培养工程菌；以苏云金杆菌为阳性对照，以未转基因的野生型作物增产菌为阴性对照；供试虫源为玉米螟和烟青虫；以1ml菌液(菌液浓度为100亿/ml)/24克饲料和0.25ml菌液/25g饲料喂虫源4天和6天后，校正死亡率达90～100％。

2、田间试验：

分别设清水对照、作物增产菌、转基因工程菌、苏云金杆菌四个处理，每处理3个重复，进行田间试验，结果表明，杀虫有效率达60％以上，未死的活虫其发育指数明显下降，成为僵虫。田间试验同时表明，工程菌的增产性状同野生型增产菌增产性状方差分析差异不显著。

3、工程菌的生物学特性

本发明的工程菌是一种蜡质芽孢杆菌Bacillus Cereus，菌种编号为TB8310保藏号为：CGMCC NO 0176。

菌体直杆状，成链，光镜下长2.5-3.5μm，宽1μm，革兰氏反应阳性，芽孢椭圆或柱状，中生，孢囊不膨大。

琼脂平板培养，菌落圆形，直径0.2cm，边远整齐，稍隆起，无光泽，不透明，蜡质，液体培养形成菌膜，生长温度15-45℃，置27-32℃适且pH6.0-7.5。适宜碳源为麦芽糖、蔗糖，适且氮源为蛋白胨，无机氨源为NH⁺ ₄发酵葡萄糖、麦芽糖产酸，木糖、乳糖、甘露醇不产酸、水解淀粉，利用柠檬酸盐，还原硝酸盐成亚硝酸盐，7％NaCl中生长，pH5.7生长，V.P.阳性，能厌氧生长，接触酶阳性，碳水化合物产气阴性，不产生吲哚，苯丙氨酸脱氨阴性。

4、工程菌的培养、换代与保藏：

将菌种划线接种于含新霉素5.5ppm的牛肉汁蛋白胨培养基(蛋白胨5g，牛肉汁3g，NaCl5g，琼脂粉15g，1000ml水)，培养后用液体石蜡油封存4℃冰箱或冷库保存，定期转管换代。

十、转基因工程菌的工业生产方法

1、菌种活化

将生长在LB培养基固体斜面(含新霉素5.5ppm)的工程菌种划线接种于上述固体牛肉汁斜面培养基，接种前将装有培养基的扁瓶的121℃下灭菌30分钟，加入新霉素使浓度为5.5ppm，接种后30℃下培养48小时，然后制成菌悬浮液，用于种子罐接种；

2、种子罐发酵

将种子罐灭菌后，装入培养液再次灭菌，待温度降至30℃时，加新霉素，使浓度为5.5ppm，接入上述菌悬液，然后通入无菌空气培养，即得种子罐发酵菌液；

3、发酵罐培养

将发酵罐先灭菌，在装入培养液后，需添加5.5ppm的新霉素，然后保压降温至25-30℃，按1-2％的接种量种子罐发酵菌液接入发酵罐培养液中培养，然后放罐；

4、灭菌及培养条件

上述灭菌采用高压蒸汽灭菌，即在121℃，压力0.3-0.5Kg/cm²条件下，灭菌30分钟，种子罐，发酵罐培养液，灭菌搅拌速度230-250rpm/min，种子罐接种后，在28-35℃条件下培养8-10小时，发酵罐接种后，在28-35℃条件下培养18-30小时，通气量1-2Vols/vol/min，氧气含量30-40％。

种子罐配方为

蛋白胨0.4-0.6％，牛肉汁0.3-0.5％，NaCl0.4-0.6％，豆油0.3-0.5％，葡萄糖0.1-0.3％，淀粉0.3-0.5％，硫酸镁0.05-0.1％，磷酸二氢钾0.03-0.04％，碳酸钙0.3-0.05％，500-1000μm的Cu、Mn、Zn、Fe搅拌，pH值消毒前，7.5-7.8，消毒后7.0-7.4；

5、发酵液要求

发酵液含菌量在每毫升50亿以上，培养24小时后放罐，进行质粒稳定性测定和δ内毒素测定，无杂菌。

Claims

1、一种既能促进作物增产，又能杀灭鳞翅目害虫的工程菌，其特征在于：该菌是蜡质芽孢杆菌Bacillus Cereus，菌种编号：TB83-10，保藏号：CGMCC NO 0176。

2、一种转移Bt基因的方法，包括选择宿主菌株、基因分离、基因转移、重组质粒构建、基因分析、基因测试、工业化生产，其特征在于：转移Bt基因的方法如下：

a、选择作物增产菌为转基因工程的宿主菌株；

b、Bt基因及其相应载体构建重组质粒；

c、重组质粒转化大肠杆菌DH5a；

d、从大肠杆菌中提取重组质粒，并进行质粒纯化、电转化；

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于Bt基因分离及其与相应载体构建重组质粒为：

a、苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis var.Kurstaki HD-1)，其δ-内毒素基因原始克隆的大小为15，5kb，用Hind III酶消解，建立如下酶切反应体系：

DNA 3μI

酶切缓冲液 2μI 37℃下保温2小时

Hind III 1μI

重蒸馏水 13μI

总计 20μI

用低融点琼脂糖回收4.2kb片断，纯化；

b、载体大小为5.8Kb，具有一个多克隆位点和Amp及Kam抗性，用Hind III酶消解，用小牛肠道磷酸酯酶(CIP)脱磷酸化；

①首先从低融点胶上回收的载体DNA，用苯酚和氯仿抽提后乙醇沉淀；

②再将DNA溶于最小体积的10mM TrisHcl(pH8.0)，建立如下反应体系；

载体DNA 5μl

10×CIP缓冲液 5μl 37℃保温30分钟

CIP(1.4U/μl) 2μl

重蒸馏水 38μl

总计 50μl

③加入40μl重蒸水，10μl 10×SET，5μl 10％SDS，68℃保温20分钟；

④苯酚、苯酚/氯仿(24∶1)各抽提一次；

⑤加入1/10体积3M NaAc(pH7.0)、2倍体积冷无水乙醇-70℃下沉淀1小时，离心，70％乙醇沉淀，真空干燥后溶于重蒸水中。

c、连接时载体DNA和连接片断以1∶3的摩尔浓度混合，建立如下连接反应体系：

DNA(载体+片断) 13μl

10×连接缓冲液 2μl

5mM ATP 2μl

100mMDTT 2μl

T4DNA连接酶 1μl(2.5U)

总计 20μl12℃连接过夜连接后取2μl跑小胶，电泳后染色观察连接效果。

4、根据权利要求2所述的方法，其特征在予重组质粒转化大肠杆菌DH5α为：

a、大肠杆菌DH5α菌株的单菌落接种于10ml LB培养液中，37℃培养过夜后取1ml接种于1升三角瓶中的100ml LB液体培养基中，37℃下在300rpm下培养约3小时，使0D值在0.5时取出置于冰上；

b、转移到50ml离心管中，冰浴10分钟后以4000rpm，温度4℃，离心10分钟，除去上清；

c、将沉淀小心悬浮在10ml 0.1M的Cacl₂溶液中，置于冰上，4℃下4000rpm离心10分钟，倒去上清；

d、将沉淀悬浮于2ml 0.1M Cacl₂中，置于冰上；

e、于1.5ml eppendorf管中加入200μl感受态细胞，加入DNA轻轻混合后放置于冰上30分钟；

f、热激温度42℃，精确热激90秒后迅速置于冰上冰浴2小时；

g、加入800μl SOC培养液，37℃下以225rpm培养45分钟后，涂布于含氨苄和新霉素抗性的SOB培养基中(其中含20mM MgSO₄)、37℃下培养12小时后长出转化子，计算转化率；

h、SOB培养基配方为：

胰蛋白胨20g、酵母粉5g、氯化钠0.5g溶于950ml水中后再加入10ml 250mM的KCl溶液，调PH值至7.0，调整体积至1升，15磅灭菌20分钟，使用前加入5ml灭菌的2M Mgcl₂溶液；

i、SOC培养基配方为：

胰蛋白胨20g、酵母粉5g、氯化钠0.5g溶于950ml水中后再加入10ml250mM的KCI溶液后调PH至7.0，调整体积至980ml，15磅灭菌20分钟后，待培养基冷却至60℃时，加入20ml 1M的葡萄糖溶液。

5、根据权利要求2所述的方法，其特征在于含Bt基因的重组质粒DNA的提取；

a、挑取E.coli DH5α的转化子，在5ml LB液体培养基(含Amp 50μg/ml)中过夜培养后取1ml溶液接种于200ml含相应抗生素的LB培养液中，37℃培养12小时；小时，离心(8000rpm，15mins，4℃)收集沉淀；

c、将菌体悬浮在10ml含5mg/ml溶菌酶的Solution I中，充分悬浮后，室温下放置30分钟；

D、加入20ml新鲜配制的Solution II中，混匀后，冰浴15分钟，小心慢慢摇动；

e.加入15ml冰冷的3MKAc(pH9.8)迅速混匀，冰浴30分钟

f、离心(15000rpm，30mins，4℃)弃去沉淀后在上清中加入二倍体积的无水乙醇，充分混合后放置-70℃下1小时；

g、15000rpm，20mins，4℃离心，回收DNA，用70％乙醇洗涤沉淀物，抽真空干燥，将沉淀溶于1ml TE(pH8.0)中。

6、根据权利要求2所述的方法，其特征在于含Bt基因重组质粒DNA的纯化为：

a、将粗提样品加入2g氯化铯，200μl溴化乙锭(10mg/ml)，定容至2ml，移入Backman 100Ti转头所使用的2ml离心管；

b、20℃，100Krpm，离心16小时后在长波紫外光下抽出质粒DNA带，4℃下避光保存；

c、使用水饱和的正丁醇反复抽取，去除溴化乙锭，-20℃下过夜；

d、12Krpm离心20分钟，用70％乙醇洗沉淀2次，抽干后溶于pH8.0的TE中；

e、取1μl DNA酶切后检测。

7、根据权利要求2所述的方法，其特征在于作物增产菌受体细胞制备；

a、作物增产菌菌株，在LB平板上划线后取单菌落接种于5ml LB培养液中过夜培养；

b、取1ml过夜培养物接种到500ml瓶中的200ml LB培养液中，在37℃下300rpm振荡培养约3小时，使0.D值为0.6时取出，置于冰浴中40分钟后，在4000rpm，4℃下离心20分钟收集菌体；

c、用冰冷无菌的1mMHEPES(PH7.0)缓冲液处理菌体2次，每次处理后置于冰浴中10分钟；

d、将菌体悬浮于冰冷的1mM HG缓冲液中，冰浴20分钟后分装于Eppendorf管中，每管200μl，70℃下过夜；

e、HG缓冲液配方为：

HEPES：1mM、甘油10％、重蒸水；

8、根据权利要求2所述的方法，其特征在于含Bt基因重组质粒的电转化为：

a、受体细胞经冻融后每管加入5μl重组质粒DNA，混匀后置于冰浴中；

b、将DNA和细胞转移到无菌的电转化杯中，电极间距为0.2cm；

c、脉冲波型为指数衰减波，电转常数为：电阻470Ω，电容27μF，电压1.35KV将电转杯置于电脉冲仪中，接上电极；

d、按电钮施放指数脉冲：

e、取下电转杯，立即放于冰上；

f、转移菌至1.5ml eppendorf管中，加1ml LB培养基，在37℃ 250rpm条件下精确振荡60分钟；

g、4℃，8000rpm下离心2分钟后，调整菌液体积为200μl；

h、将转化子涂布于含新霉素(5.5μg/ml)的LB平板上，37℃培养18小时，挑取转化子。

9、根据权利要求2所述的方法，其特征在于基因分析为：

a、取转化子单菌落，接种于含新霉素5.5μg/ml的5ml LB培养液中，37℃下振荡培养过夜；

b、取1ml培养液，离心后倒去上清，加入100μl Sotution I混匀，加入溶菌酶，使终浓度为10mg/ml，37℃下保温2小时；

c、加入200μ新鲜配制的Solution II，轻轻混合均匀后置于冰上10分钟，然后加入150ml冰冷的Solution II，置于冰上5分钟；

d、离心后取上清，分别用苯酚、苯酚/氯仿、氯仿抽取后，用无水乙醇沉淀DNA；离心后用70％乙醇洗，真空干燥后溶于50μl TE中；

e、取5μl DNA，加入12μl重蒸水、2μl缓冲液和1μl Hind III酶混匀后于37℃水浴中，保温1小时；

f、将重组DNA和酶切后DNA同时进行电泳，紫外光下检测外源Bt基因片断的插入，片断大小为4.2Kb。

10、根据权利要求2所述的方法，其特征在于作物增产菌工程菌的毒理测试为：

在新霉素浓度为5.5μg/ml下培养工程菌；以苏云金杆菌为阳性对照，以未转基因的野生型作物增产菌为阴性对照：供试虫源为玉米螟和烟青虫；以1ml(菌液浓度为100亿/ml)/24克饲料和0.25ml菌液/25g饲料喂虫源4天和8天后，校正死亡率达90～100％。

11、根据权利要求2所述的方法，其特征在于作物增产菌工程菌的田间试验为：

分别设清水对照、作物增产菌、转基因工程菌、苏云金杆菌四个处理，每处理3个重复，进行田间试验，结果表明，杀虫有效率达60％以上，未死的活虫其发育指数明显下降，成为僵虫，田间试验同时表明，工程菌的增产性状同野生型增产菌性状方差分析差异不显著。

12、根据权利要求2所述的方法，其特征在于作物增产菌工程菌的工业生产方法为：

a、菌种活化

b、种子罐发酵

c、发酵罐培养

d、灭菌及培养条件

上述灭菌采用高压蒸汽灭菌，即在121℃，压力0.3-0.5Kg/cm²条件下，灭菌30分钟，种子罐，发酵罐培养液，灭菌搅拌速度230-250rpm/min，种子罐接种后，在28-35℃条件下培养8-10小时，发酵罐接种后，在28-35℃条件下培养13-30小时，通气量1-2Vols/vol/min，氧气含量30-40％。

e、种子罐配方为

蛋白胨0.4-0.6％，牛肉汁0.3-0.5％，NaCl0.4-0.8％，豆油0.3-

0.5％，葡萄糖0.1-0.3％，淀粉0.3-0.5％，硫酸镁0.05-0.1％，磷酸二氢钾0.03-0.04％，碳酸钙0.03-0.05％，500-1000μm的Cu、Mn、Zn、Fe搅拌，pH值消毒前，7.5-7.8，消毒后7.0-7.4；

f、发酵液要求

发酵液含菌量在每毫升50亿以上，培养24小时后放罐，进行质粒稳定测定和δ内毒素测定，无杂菌。