CN108553683A - 基于天然多糖/短肽的复合纳米止血材料及其制备方法 - Google Patents

基于天然多糖/短肽的复合纳米止血材料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于天然多糖/短肽的复合纳米止血材料及其制备方法，属于纳米医用止血材料技术领域。其是以天然多糖和短肽复配而成，其中天然多糖包括壳聚糖及壳聚糖衍生物、透明质酸及透明质酸衍生物、海藻酸钠及海藻酸钠类衍生物，短肽的氨基酸序列为X3‑4QK1‑2或QX(3‑4)K1‑2。本发明制备的复合纳米止血材料具有较好的止血性能，能显著降低出血时间以及出血量，并且该复合纳米止血材料具有合成价格低廉、易于合成和控制、生物毒性低、生物相容性好等优点，满足纳米止血材料的要求，可将其制备成具有临床价值的止血药物，对纳米止血材料的发展具有较大的意义。

Description

基于天然多糖/短肽的复合纳米止血材料及其制备方法
技术领域
本发明属于纳米医用止血材料技术领域，具体涉及一种基于天然多糖/短肽的复合纳米止血材料及其制备方法。
背景技术
日常生活中，自然或人为因素所引起的过量失血直接威胁生物体的生命安全，因此在科学日益发展的今天，研发一种快速而有效的止血材料显得尤为重要。现有技术中比较常用且具有代表性的止血材料有干燥纤维蛋白粘合止血剂(Dry Fibrin SealantDressing,DFSD)、WoundStat止血剂(WoundStat，WS)、QuikClot止血剂(QuikClot，QC)、战斗纱布、HemCon壳聚糖止血剂(HemCon Chitosan Dressing,HCD)等。
上述止血材料在止血的同时，还存在一定的弊端，如：
DFSD由羟基乳酸聚合物、人的凝血酶和纤维蛋白原以及氯化钙组成，具有效果好、使用方便等优点，但是便携性和耐久性欠佳且价格昂贵；
QuikClot主要由沸石粉组成，具有性质稳定、易于携带、价格低等优点，但是使用过程中与血液接触会有放热反应，使用前必须经过必要培训，使用安全性较差；
WS主要是由蒙脱石颗粒组成，虽然止血效果明显，但是容易在血管内形成血栓，现已停止其使用；
战斗纱布主要由特殊的外科纱布以及高岭土组成，具有止血效果好，覆盖面广、方便使用和移除等优点，但是仍具有在血管内形成血栓的危险；
HCD主要由壳聚糖的乙酸盐组成，具有操作简便、易学易用等优点，但是粘附率较差、对于股动脉出血效果较差。综上所述不难发现，到目前为止，还没有一种高效、安全的理想止血材料。
因此，研发高效凝血材料显得尤为重要。
对于高效凝血材料的研究，现有技术如“羧甲基壳聚糖在大鼠创伤出血模型的止血效果的观察”(吴伟萍，彭承宏，韩宝三，外科理论与实践2010年第15卷第3期)等研究发现羧甲基壳聚糖(CMCS)具有较好的止血功能，并且其生物相容性较好，CMCS是壳聚糖的衍生物，既具有壳聚糖本身的优点，同时又改善了壳聚糖水溶性差的缺点，因此具有更加广阔的应用空间。同时CMCS具有较好的生物相容性与生物降解性，又具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌、止血及愈创等功能。
然而，羧甲基壳聚糖其止血效果非常有限，原因在于羧甲基壳聚糖的凝血过程主要是依靠形成血凝块，而血凝块的形成时间较长，另外，出血部位通常压力比较大，羧甲基壳聚糖不易黏附在伤口部位并形成血块以达到止血的目的。
目前，现有技术中的凝血材料还存在一个显著的问题，即其凝血速度普遍需要几十秒钟甚至更长时间，如刘霞等人[刘霞，赵桂芝，王昱霁，朱婉萍，羧化壳聚糖止血及其生物安全性评价，中国组织工程研究第21卷第22期]利用羧甲基壳聚糖以鼠尾静脉创面止血时间为51.6s左右，肝脏创面止血时间为40s左右。
而本领域技术人员公知，凝血速度是考量止血材料的一个关键因素，然而，该学科的研究者们却无法突破这一技术瓶颈。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的技术缺陷，本发明的目的在于提出一种基于天然多糖/短肽的复合纳米止血材料及其制备方法，其可以提升止血效果，且凝血速度可缩短至十秒以内。
为实现上述目的，本发明所需要克服的技术难点有：
(1)利用多肽固相合成方法，合成出目标多肽；(2)制备壳聚糖衍生物、海藻酸钠衍生物以及透明质酸衍生物；(3)天然多糖/多肽水凝胶的制备。
本发明的任务之一在于提供一种基于天然多糖/短肽的复合纳米止血材料。
一种复合纳米止血材料，其特征在于：其是以天然多糖和短肽为原料复配而成，所述的天然多糖与所述短肽的体积配比为1:1；所述的短肽其氨基酸序列为X3-4-Q-K1-2或Q-X(3-4)-K1-2，其C端和N端未保护，或C端氨基化，或N端乙酰化。
上述技术方案直接带来的有益技术效果为(1)天然多糖的加入可大幅度提高多肽水凝胶的机械强度，强的机械强度对出血口有较强的物理阻碍作用，加速凝血过程。(2)天然多糖/多肽水凝胶对血小板有较强的吸附作用，达到快速止血的目的。(3)短肽和天然多糖成本都较低，而止血性能优良，生物毒性低、生物相容性好，是一种理想的纳米止血材料，对提高人民幸福生活指数均具有较大的意义。
作为本发明的一个优选方案，所述的天然多糖为壳聚糖及壳聚糖的衍生物。
作为本发明的另一个优选方案，所述的天然多糖为透明质酸及透明质酸的衍生物。
优选的，所述的天然多糖为海藻酸钠及海藻酸钠类衍生物。
优选的，所述的短肽中，其中的X为疏水氨基酸。
优选的，所述的疏水氨基酸为异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸。
优选的，天然多糖的浓度为0.1％-95％，所述的多肽的浓度为0.1％-75％。
本发明的另一任务在于提供一种复合纳米止血材料的制备方法，依次包括以下步骤：
a利用固相合成法合成目标短肽，将合成的短肽溶解在pH＝7.4的Hepes缓冲溶液中，配制成短肽溶液；
b将步骤a所得短肽溶液依次经旋转振荡器震荡、超声处理、水浴加热后，静置待用；
c将一定量的天然多糖加入至静置后的短肽溶液中进行复配，37℃孵育24h，即得复合纳米止血材料。
上述技术方案直接带来的有益技术效果为：(1)多肽固相合成技术的使用降低了短肽的合成成本，多肽溶解在缓冲溶液中，其pH接近生理pH值。(2)经过涡旋、超声以及水浴加热的多肽，可得到更加均一的多肽溶液，也使多肽自组装以后的形貌更加均一。(3)孵育过过的复配水凝胶混合更加充分稳定。
优选的，步骤b中，震荡2～10min，超声处理20～40min，水浴加热1～3h，静置24h。
优选的，所述的天然多糖为壳聚糖及壳聚糖的衍生物、透明质酸及透明质酸的衍生物、海藻酸及海藻酸类衍生物，其中，壳聚糖及其衍生物的止血效果最好。
与现有技术相比，本发明止血材料具有较好的止血性能，能显著降低出血时间以及出血量，并且该复合纳米止血材料具有生物毒性低、生物相容性好等优点。
本发明短肽材料与血液中的某些物质可发生化学反应，形成多肽水凝胶并达到凝血的效果。将短肽材料与天然多糖进行复配得到的止血材料，经实验验证，其止血速度可缩短为5～10s，与已有研究中的几十秒相比较，相当于一个质的飞跃。
附图说明
下面结合附图对本发明做进一步说明(以Ac-IIIQGK-NH2为例)：
图1为本发明的Ac-IIIQGK-NH2在加入TGase前后的样品在25℃下的圆二色谱图；
图2为本发明的CMCS以及Ac-IIIQGK-NH2+CMCS在加入TGase前后的样品在25℃下的圆二色谱图；
图3中(3a)为本发明的Ac-IIIQGK-NH2样品的原子力(AFM)高度图，(3b)为透射(TEM)电镜图；
图4中(4a)为本发明的Ac-IIIQGK-NH2+CMCS样品的原子力(AFM)高度图,(4b)为透射(TEM)电镜图；
图5中(5a)为本发明的Ac-IIIQGK-NH2+TGase样品的原子力(AFM)高度图，(5b)为透射(TEM)电镜图；
图6中(6a)为本发明的Ac-IIIQGK-NH2+CMCS+TGase样品的原子力(AFM)高度图，(6b)为透射(TEM)电镜图；
图7为本发明的Ac-IIIQGK-NH2样品在加入TGase的频率扫描图；
图8为本发明的Ac-IIIQGK-NH2样品在加入TGase的应力扫描图；
图9为本发明的Ac-IIIQGK-NH2+CMCS样品在加入TGase的频率扫描图；
图10为本发明的Ac-IIIQGK-NH2+CMCS样品在加入TGase的应力扫描图；
图11为本发明的CMCS、Ac-IIIQGK-NH2+CMCS以及Ac-IIIQGK-NH2接触血液之后产生的水凝胶的频率图；
图12为本发明的CMCS、Ac-IIIQGK-NH2+CMCS以及Ac-IIIQGK-NH2接触血液之后产生的水凝胶的应力扫描图；
图13为本发明的CMCS、Ac-IIIQGK-NH2、Ac-IIIQGK-NH2+HA、以及Ac-IIIQGK-NH2+CMCS以及空白对照样品的凝血时间图；
图14为本发明的天然多糖/短肽复合纳米止血材料的溶血性图；
图15为本发明的Ac-IIIQGK-NH2，Ac-IIIQGK-NH2+CMCS的生物相容性测试图。
具体实施方式
本发明提出了一种基于天然多糖/短肽的复合纳米止血材料及其制备方法，为了使本发明的优点、技术方案更加清楚、明确，下面结合具体实施例对本发明做详细说明。
首先对本发明所需主要原料及实验器材做详细说明，见表1、表2。
表1实验仪器
表2实验药品
本发明原料短肽的氨基酸序列为X3-4QK1-2或QX(3-4)K1-2，，其中X为异亮氨酸、亮氨酸、或缬氨酸等疏水氨基酸。
本发明中所使用的短肽可以用Brace Merrifield在1963年提出的多肽固相合成方法合成，其合成步骤大致为：
(1)将溶胀后的树脂放入微波反应器中，利用脱保护剂将氨基上的Fmoc基团脱下，裸露的氨基与下一个活化后的氨基酸的羧基发生反应，形成肽键，不断重复此种过程，将所需要的氨基酸依次连接起来，达到合成多肽的目的；
(2)将上述过程得到的产物使用裂解剂进行裂解，将裂解后的溶液使用旋蒸仪旋蒸，得到少许固体物质；
(3)将冰乙醚加入到盛有上述少许固体物质的烧瓶中，将多肽沉淀出来，之后再用冰乙醚将其离心至上清液的pH＝7左右，之后用冻干机冻干即得目标多肽。
另外，本发明中用到的CMCS，为中国海洋大学提供。
本发明的天然多糖/短肽复合纳米止血材料具有较好的止血效果，且生物毒性低，生物相容性好，使用安全，满足纳米止血材料的要求，可将其制备成具有临床价值的止血药物，对纳米止血材料的发展具有较大的意义。
下面结合具体实施例对本发明做详细说明。
实施例1：
利用Fmoc微波辅助固相合成多肽的方法合成目标多肽。
步骤1：将实验中所用到的DMF和哌啶进行重蒸。
步骤2：通过多肽合成仪上的软件计算合成的目标多肽中各个氨基酸、脱保护剂、活化剂、活化碱、盖帽剂的用量，称取相对应的药品，配制溶液。以合成0.25mM的Ac-IIIQGK-NH2为例，所需的氨基酸、树脂、脱保护剂、活化剂、活化碱、盖帽剂的用量如下表所示：
表3各个药品用量及配制方法
将所需溶液按照上述表格配制好后，将溶胀后的树脂放入微波反应器中，利用脱保护剂将氨基上的Fmoc基团脱下，然后裸露的氨基与下一个活化后的氨基酸的羧基发生反应，形成肽键，不断重复此种过程，将所需要的氨基酸依次连接起来，达到合成多肽的目的，此步骤是在多肽合成仪中设定好程序，仪器自动合成。
步骤3：多肽的纯化、冻干和纯度分析
将合成好的多肽经过过滤转移至锥形瓶中，加入裂解剂15mL，裂解4-6h，裂解结束后，利用旋蒸仪将多余液体旋出，剩余少许固体物质，然后利用冰乙醚将多肽沉淀出来，并离心10次左右，离心时间为10min，转速为9000rmp/min，直至多肽中的上清液的pH值为7左右。最后将目标多肽溶于超纯水中并冻干，放入冰箱内密封保存。合成好的目标多肽利用基质辅助激光解析飞行时间质谱仪和反向高效液相色谱进行纯度分析。
此种方法，还用于合成本发明中的其他多肽，例如AC-IIINGK-NH2、AC-IIIQK-NH2等多肽。
实施例2：对本发明中制备的天然多糖/短肽复合纳米止血材料进行二级结构测定。
25mM的Hepes溶液的配制：称取2.9789mg Hepes盐，溶于400mL超纯水中，然后用NaOH溶液调节其pH＝7.4，然后加入超纯水至500mL容量瓶中定容。以Hepes溶液作为溶剂，称取一定量的多肽配制多肽溶液，旋转振荡器震荡5min，超声30min，水浴加热2h，静置48h待用。称取一定量的CMCS溶于Hepes缓冲溶液中，将CMCS溶液等体积加入多肽溶液中，使多肽和CMCS最终的浓度分别为7.06mM和0.44mg/mL，将上述溶液倒入至光程为0.1mm的石英池中，波长采集范围为190-270nm，采集步长和响应时间分别为1nm和1s，单独采集Hepes缓冲溶液3次并取平均值作为采集背景扣除，单个样品也采集三次取平均值，之后平滑曲线，所有实验均在室温下进行，测量结果如图1所示。
从图1中可以看出，Ac-IIIQGK-NH2在TGase酶加入均在192nm和220nm处分别有一个正峰和一个负峰，这说明加入TGase前后其肽溶液均在Hepes缓冲溶液中的二级结构是β-折叠，只是其信号强度变低。
CMCS在加入TGase酶前后在此波长范围内均没有信号，但加入Ac-IIIQGK-NH2以后，其二级结构为β-折叠，再进一步加入TGase酶以后，其信号强度也降低(图2)。
实施例3：
本发明中的Ac-IIIQGK-NH2以及CMCS+Ac-IIIQGK-NH2的自组装形貌测试，其中包括原子力显微镜(AFM)和透射电子显微镜(TEM)测试，具体操作步骤如下：
AFM测试：取一定量的待测溶液于剥离干净的云母片上，吸附一定时间，然后用一定量的超纯水冲洗，之后用氮气吹扫至云母片干燥。将所得样品放在检测台上，利用tapping模式进行样品形貌扫描，扫描角度为0°，扫描速率为512×512，扫描速率为1Hz，同一样品需要重复扫描以确定其真实形貌。从图3中(3a)、(3b)和图4中(4a)、(4b)均可看出，Ac-IIIQGK-NH2以及CMCS+Ac-IIIQGK-NH2在Hepes缓冲溶液中是带状结构。
TEM测试：用移液枪吸取少量的待测溶液于封口膜的表面上，将铜网覆盖于待测溶液上，吸附50s左右，各个样品的吸附时间不等，将铜网上的多余液体处理干净，之后将铜网置于醋酸双氧铀溶液上进行负染，负染时间为5min左右，最后取下铜网，将铜网上多余的液体吸干，即得待测样品。其实验结果如图3和图4所示，其形貌与AFM检测的结果一致，均为带状结构。
实施例4：
本发明中的Ac-IIIQGK-NH2以及CMCS+Ac-IIIQGK-NH2在加入TGase酶之后的自组装形貌测试，其中包括原子力显微镜(AFM)和透射电子显微镜(TEM)测试。
Ca2+依赖性溶液的配制：
取0.62mg DTT，1.10mg CaCl2溶于2mL的Hepes缓冲溶液之中，DTT的浓度为2mM，CaCl2的浓度为5mM。
TGase酶母液的配制：
取0.62mg DTT，0.2gTGase加入到2mL的Hepes缓冲溶液之中，使之充分溶解之后得到TGase母液，-20℃下冷冻保存。将TGase酶母液与Ca2+依赖性溶液分别加入到AC-IIIQGK-NH2以及CMCS+AC-IIIQGK-NH2中，使TGase的最终浓度为3.85U/mL，多肽的浓度为7.06mM，CMCS的浓度为0.44mg/mL。待测样品配制好以后，采用和实施例3中相同的方法进行AFM和TEM的形貌检测，实验结果如图5中(5a)、(5b)和图6中(6a)、(6b)所示，结果表明AC-IIIQGK-NH2以及CMCS+AC-IIIQGK-NH2加入TGase以后形成纤维束，具有更多的纤维结构。
实施例5：
本发明中的Ac-IIIQGK-NH2以及CMCS+Ac-IIIQGK-NH2在加入TGase酶之后的凝胶强度检测，检测时使用Haake流变仪，本发明中的流变实验使用的转子的直径是35mm，锥度为2°，测试温度为25℃，测试狭缝为0.105nm，对待测样品进行频率和应力扫描。首先以1Hz的频率进行应力扫描，应力扫描范围为0.01％-100％，由应力扫描确定该样品的线性粘弹区，然后更换待测样品进行频率扫描。
取至少450μL待测样品于测试台上，先进行应力扫描，选定应力为0.1％的情况下进行频率扫描。其实验结果如图7-图10所示。当Ac-IIIQGK-NH2加入TGase酶以后，能诱导Ac-IIIQGK-NH2形成强度为500Pa的水凝胶，而CMCS+Ac-IIIQGK-NH2在加入TGase酶后，其凝胶强度达到了3000Pa左右，由此可见，CMCS的加入能显著提高水凝胶的强度。
实施例6：
本发明的Ac-IIIQGK-NH2、CMCS以及Ac-IIIQGK-NH2+CMCS接触血液之后产生的水凝胶的频率及应力扫描图。
将Ac-IIIQGK-NH2和CMCS+Ac-IIIQGK-NH2样品配制好以后，加入同体积的新鲜的未凝的自然血液，之后采用和实施例5中相同的方法进行水凝胶强度的检测，实验结果如图11、12所示，当Ac-IIIQGK-NH2和CMCS+Ac-IIIQGK-NH2样品和血液混合以后，能瞬间提高凝胶强度至10000Pa，而CMCS加入血液之后的凝胶强度仅为300Pa左右。
实施例7：
本发明的Ac-IIIQGK-NH2、CMCS以及Ac-IIIQGK-NH2+CMCS等样品的凝血时间测试。
将新鲜的鸡固定在手术台上，采用翼下静脉取血的方式获得鸡的新鲜未凝的血液，用于下一步的实验。将制备好的各个样品等体积的加入新鲜未凝的鸡血，本实验中VCMCS:VAC-IIIQ(N)GK-NH2:Vblood＝200μL:200μL:200μL，加入鸡血的瞬间立即用秒表记录时间，每隔5s将样品倾斜一次，观察血液是否凝固，当血液凝固时记录下此时时间。Ac-IIIQGK-NH2、CMCS、Ac-IIIQGK-NH2+HA以及Ac-IIIQGK-NH2+CMCS的出血时间测试如图13所示。从图13中可以发现，本发明中使用的多肽系列有效的降低了出血时间，而加入CMCS以后，明显的降低了其出血时间，凝血时间可降低至5-10s左右，其对照样品组成成分为Hepes：血＝1:1。
实施例8：
本发明的Ac-IIIQGK-NH2以及Ac-IIIQGK-NH2+CMCS等样品的溶血实验以及生物毒性检测。
溶血实验具体操作：
使用新鲜鸡红细胞评估Ac-IIIQGK-NH2、CMCS以及Ac-IIIQGK-NH2+CMCS样品的溶血活性。通过从新鲜鸡血中离心(1000×g，5分钟)获得红细胞，并用PBS洗涤三次，配制8％(v/v)的红细胞悬浮液，将100μL红细胞悬浮液与100μL不同的待测样品在无菌96孔板中混合，并在37℃孵育1小时。然后，将96孔板以1000×g离心10分钟，并将上清液转移到新的96孔板中。最后，使用酶标仪记录在540nm处的吸光度。使用PBS和0.1％(v/v)Triton X-100中的血红蛋白释放分别作为阴性(0％释放)和阳性对照(100％释放)。实验结果如图14所示，结果显示，本发明中的Ac-IIIQGK-NH2、CMCS以及Ac-IIIQGK-NH2+CMCS的溶血活性很低。
生物毒性(Calcein-AM/PI双染色实验)检测操作：
配制Calcein-AM/PI溶液：将Calcein-AM粉末溶于DMSO并使最终浓度为1mg/mL，-20℃下保存。将PI溶液用超纯水稀释成1mg/mL，-20℃下保存。将实验组和对照组上的培养基吸出，用PBS洗涤实验组和对照组，然后加入培养基、Calcein-AM和PI溶液，使Calcein-AM和PI溶液的浓度为1μg/mL和5μg/mL，然后将96孔板放入细胞培养箱中孵育30min，之后将孔板拿出，用PBS洗涤，用荧光倒置显微镜观察并记录。实验结果如图15所示。从图中可以观察到，本发明中的Ac-IIIQGK-NH2+CMCS样品生物毒性低，生物相容性良好。
本发明中未述及的部分借鉴现有技术即可实现。
需要说明的是：在本说明书的教导下本领域技术人员所做出的任何等同方式，或明显变型方式均应在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种复合纳米止血材料，其特征在于：其是以天然多糖和短肽为原料复配而成，所述的天然多糖与所述短肽的体积配比为1:1；
所述的短肽其氨基酸序列为X3-4QK1-2或QX(3-4)K1-2，且其中X为除了G之外的疏水氨基酸，其C端和N端未保护，或C端氨基化，或N端乙酰化。
2.根据权利要求1所述的一种复合纳米止血材料，其特征在于：所述的天然多糖为壳聚糖及壳聚糖的衍生物。
3.根据权利要求1所述的一种复合纳米止血材料，其特征在于：所述的天然多糖为透明质酸及透明质酸的衍生物。
4.根据权利要求1所述的一种复合纳米止血材料，其特征在于：所述的天然多糖为海藻酸钠及海藻酸钠类衍生物。
5.根据权利要求1所述的一种复合纳米止血材料，其特征在于：所述的短肽中，其中的X为疏水氨基酸。
6.根据权利要求5所述的一种复合纳米止血材料，其特征在于：所述的疏水氨基酸异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸。
7.根据权利要求1所述的一种复合纳米止血材料，其特征在于：所述的天然多糖的浓度为0.1％-95％，所述的多肽的浓度为0.1％-75％。
8.根据权利要求1所述的一种复合纳米止血材料的制备方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
a利用固相合成法合成短肽，将合成的短肽溶解在pH＝7.4的Hepes缓冲溶液中，配制成短肽溶液；
b将步骤a所得短肽溶液依次经旋转振荡器震荡、超声处理、水浴加热后，静置待用；
c将一定量的天然多糖加入至静置后的短肽溶液中进行复配，37℃孵育24h，即得复合纳米止血材料。
9.根据权利要求8所述的一种复合纳米止血材料的制备方法，其特征在于：步骤b中，震荡2～10min，超声处理20～40min，水浴加热1～3h，静置24h。
10.根据权利要求8所述的一种复合纳米止血材料的制备方法，其特征在于：所述的天然多糖为壳聚糖及壳聚糖的衍生物。
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