CN108529693A - 一种肽功能化纳米钯及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肽功能化纳米钯，所述肽功能化纳米钯采用的配体为多肽，所述多肽为五肽、功能化肽中的一种或两种的混合物，所述五肽由CALNN的氨基酸序列表示，所述功能化肽为在CALNN氨基酸序列基础上增加功能序列。采用上述五肽或功能化肽为稳定配体，能够提高肽功能化纳米钯在水溶液中的稳定性，制得的肽功能化纳米钯具有良好的稳定性、生物相容性，能够实现纳米钯的肽功能化。
Description
技术领域
本发明涉及纳米材料技术领域，更具体地，涉及一种肽功能化纳米钯及其制 备方法。
背景技术
近年来，钯纳米材料在催化应用领域得到了广泛的研究，根据钯纳米材料高 消光系数、高催化活性、高表面电子密度等特性分析，其在生物传感中亦应该具 有广阔的应用前景。然而，相比而言，以钯纳米材料为基础的生物传感器研究较 少。其主要原因是钯纳米材料的表面性质较难实现生物分子的偶联。
目前纳米钯的合成主要在有机溶剂中，以四辛基溴化铵(Langmuir,2001,17,4701)、PVP(J.Mater.Chem.,2003,13,1069)等有机化合物为配体实现。这些方法 制备的纳米钯难以通过常用的配体交换等方法，实现纳米钯的功能化，进而实现 生物分子的偶联。Zhifei Wang等人的研究以11-mercaptoundecanoic acid(MUDA) 为配体，制备出了羧基功能化的纳米钯，并实现了纳米钯与DNA的偶联 (Nanoscale,2012,4,3536)。但是在生物应用中，这个方法涉及到材料的偶联和 后处理，过程较为繁琐。同时，以MUDA为配体的纳米钯在水溶液中的稳定性 较差，影响其使用。
发明内容
本发明为克服上述现有技术所述的缺陷，提供一种肽功能化纳米钯。
本发明的另一目的在于提供一种肽功能化纳米肽的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种肽功能化纳米钯，所述肽功能化纳米钯包括纳米钯和作为配体的多肽， 所述多肽为五肽、功能化肽中的一种或两种的混合物，所述五肽由CALNN的氨 基酸序列表示，所述功能化肽为在CALNN氨基酸序列基础上增加功能序列。
采用上述五肽或功能化肽作为纳米钯的稳定配体，能够提高肽功能化纳米钯 在水溶液中的稳定性，制得的肽功能化纳米钯具有良好的稳定性、生物相容性， 能够实现纳米钯的肽功能化。
优选地，所述功能化肽为十肽、十二肽或FITC标记的十肽，所述十肽由CALNNGGARK的氨基酸序列表示，所述十二肽由CALNNRIYGEFK的氨基酸 序列表示。根据需要，在CALNN氨基酸序列基础上增加功能序列，得到功能化 肽，例如氨基酸序列为CALNNGGARK的十肽、氨基酸序列为CALNNRIYGEFK 的十二肽；其中，采用十肽或FITC标记的十肽作为稳定配体，则该配体具有胰 蛋白酶底物活性。FITC为异硫氰酸荧光素。
上述肽功能化纳米钯的制备方法，包括如下步骤：
S1.制得含有多肽和水合肼的水溶液；
S2.将氯钯酸钠溶液加入到S1.的水溶液中，混合均匀，室温下充分反应；
S3.反应后进行纯化，得到肽功能化纳米钯，低温保存；
所述多肽与氯钯酸钠的物质的量比为0.2～1:1。
上述制备方法，在温和条件下，一步完成纳米钯的制备和肽功能化，快速、 简便，无需偶联，避免了繁琐的过程，为纳米钯的生物应用提供条件。
所述S1.可以加入与多肽等当量的NaOH溶液，也可以不加NaOH溶液；混 合溶液中加有水合肼，该混合溶液一般呈强碱性。
所述S2.中加入氯钯酸钠溶液的滴加速率可以采用常用的滴加速率，还可以 一次性倒入，一次性倒入制备得到的肽功能化纳米钯的尺寸更为均匀。
所述S3.中的低温保存一般是指在冰箱中保存，确保制得的肽功能化纳米钯 不会被冻住，温度可以为0～6℃，冰箱一般为4℃。
优选地，所述水合肼与氯钯酸钠的物质的量比为40～100:1。
优选地，所述水合肼与氯钯酸钠的物质的量比为40～50:1。
优选地，所述混合溶液的pH为12～14。该混合溶液的pH一般为12，可以 采用NaOH溶液调节为12～14。
优选地，S2.的所述反应的时间为20～60min。
更优选地，S2.的所述反应的时间为30min。
优选地，所述氯钯酸钠溶液为二氯化钯与氯化钠按物质的量比为1:2，在酸 性条件下混合配制而成。在配制时，可以滴加1～2滴浓盐酸。
优选地，所述纯化的方法为高速离心、透析或超滤。
纯化方法采用高速离心时，需要先用酸将反应溶液调至弱酸性，酸可以是浓 盐酸或稀盐酸，然后高速离心，反复用水洗涤4次即可；纯化方法采用透析时， 可以采用截留分子量为10K的透析袋，将反应溶液装入透析袋中，在pH＝7.4的 缓冲溶液中透析24h，每8小时更换一次缓冲溶液，收集透析袋中的产品即可； 纯化方法采用超滤时，可以将反应溶液放入超滤管中离心超滤，随后用pH＝7.4 的缓冲溶液反复洗涤4次即可。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明制得的肽功能化纳米钯采用五肽或功能化肽为稳定配体，五肽的氨基 酸序列为CALNN，能够提高肽功能化纳米钯在水溶液中的稳定性，制得的肽功 能化纳米钯具有良好的稳定性、生物相容性，能够实现纳米钯的肽功能化。
附图说明
图1为实施例1的肽功能化纳米钯的透射电镜图。
图2为BCA方法分析实施例1的纳米钯表面包覆多肽配体的测试结果。
图3为BCA方法和可见光吸收光谱分析实施例2的纳米钯表面包覆多肽配 体的测试结果。
图4为可见光吸收光谱分析实施例3的纳米钯表面包覆多肽配体的测试结 果。
图5为可见光吸收光谱分析实施例4的纳米钯表面包覆多肽配体的测试结 果。
图6为可见光吸收光谱分析实施例5的纳米钯表面包覆多肽配体的测试结 果。
图7为可见光吸收光谱分析实施例6的纳米钯表面包覆多肽配体的测试结 果。
图8为Bradford方法分析实施例7、8的纳米钯表面包覆多肽配体的测试结 果。
图9为实施例2的具有胰蛋白酶底物活性的肽功能化纳米钯的稳定性测试结 果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。
实施例中使用的氯钯酸钠溶液采用如下方法制备：称量0.0876g的氯化钯， 加入6mL 0.2mol/L氯化钠，用蒸馏水溶解，滴加1～2滴浓盐酸，定容至250mL， 储备。
实施例中使用的水合肼为40wt％～50wt％浓度的水合肼溶液。
具体实施方式中，CALNN是指氨基酸序列为CALNN的五肽； CALNNGGARK是指氨基酸序列为CALNNGGARK的十肽； CALNNGGARK(FITC)是指FITC标记的氨基酸序列为CALNNGGARK的十肽； CALNNRIYGEFK是指氨基酸序列为CALNNRIYGEFK的十二肽。
实施例中，高分辨透射电镜采用的仪器是FEI Tecnai G2F30，测试条件：加 速电压300KV；
BCA方法是一种蛋白检测方法，检测步骤为：购买BCA试剂盒(生工生物 工程(上海)股份有限公司)，选取酶标板上3个孔，各孔分别加入20μL一定 浓度的肽功能化纳米钯、肽对照样品和缓冲液空白，再加入200μLBCA工作液， 迅速混匀。在37℃水浴中保温30min，冷却至室温后，在酶标仪上测各孔的吸 收光谱。
Bradford方法是一种蛋白检测方法，检测步骤为：购买Bradford试剂盒(生 工生物工程(上海)股份有限公司)，在酶标板上分别加入20μL一定浓度的肽 功能化纳米钯、阳性对照和阴性对照，再加入200μLBradford工作液，迅速混 匀。各样品组分别设置试剂参比。室温25～30℃，反应5min后，在酶标仪上测 各孔的A595值。
可见光吸收光谱的测试方法：在酶标仪(Tecan infinite M200Pro)上使用透 明96孔板，波长扫描范围400-700nm。采用肽功能化纳米钯分散液测试。
荧光强度的测试方法：在酶标仪(Tecan infinite M200Pro)上使用荧光96 孔板，激发波长490nm，发射波长520nm，荧光Top Read模式，进行2×2每孔 多读。
实施例1
一种肽功能化纳米钯，采用如下方法制备得到：
S1.称量0.0067g CALNN于三颈烧瓶中，加入7mL的蒸馏水，再向溶液中 加入0.07mL水合肼，采用氢氧化钠溶液调节pH至12；
S2.取7mL配制好的氯钯酸钠溶液快速加入到上述三颈烧瓶的溶液中，然 后搅拌30min，使之充分反应；
S3.采用稀盐酸将反应溶液pH调至弱酸性，在高速冷冻离心机中以16000 转高速离心沉淀，去除上清液后以蒸馏水反复洗涤4次，最后将纯品重新分散于 pH＝7.4的缓冲溶液中，于冰箱4℃保存。经上述方法可一步制备以CALNN为配 体的肽功能化纳米钯。
本实施例中，多肽与氯钯酸钠的物质的量比为0.9:1；水合肼与氯钯酸钠的 物质的量比为40～50:1。
实施例2
本实施例的肽功能化纳米钯，采用如下方法制备得到：
S1.称量0.0021g CALNNGGARK(FITC)和0.0067g CALNN于三颈烧瓶中， 加入7mL的蒸馏水，再向溶液中加入0.14mL水合肼，采用氢氧化钠溶液调节 pH至12；
S2.取14mL氯钯酸钠储备溶液快速加入到上述三颈烧瓶的溶液中，然后搅 拌30min，使之充分反应；
S3.将反应溶液装入截留分子量为10K的透析袋中，以pH＝7.4的缓冲溶液 中透析24小时，当中每8小时更换一次缓冲溶液；最后收集透析袋中的产品， 保存于冰箱4℃。经上述方法可一步获得具有胰酶底物活性，同时带有荧光团的 肽功能化纳米钯。
本实施例中，多肽与氯钯酸钠的物质的量比为0.5:1；水合肼与氯钯酸钠的 物质的量比为40～50:1。
将制得的肽功能化纳米钯进行稳定性测试，测试荧光强度，表征该肽功能化 纳米钯的胰蛋白酶底物活性，如图9所示，胰蛋白酶的浓度为10μg/mL，空白对 照没有加入胰蛋白酶。
实施例3
与实施例2的区别在于，CALNNGGARK(FITC)的使用量为0.0029g，CALNN 的使用量为0.0097g；
其他原料使用量及操作步骤与实施例2相同。同样能够制备得到肽功能化纳 米钯。本实施例中，多肽与氯钯酸钠的物质的量比为0.7:1；水合肼与氯钯酸钠 的物质的量比为40～50:1。
实施例4
与实施例2的区别在于，CALNNGGARK(FITC)的使用量为0.0008g，CALNN 的使用量为0.0027g；
其他原料使用量及操作步骤与实施例2相同。同样能够制备得到肽功能化纳 米钯。
本实施例中，多肽与氯钯酸钠的物质的量比为0.2:1；水合肼与氯钯酸钠的 物质的量比为40～50:1。
实施例5
与实施例2的区别在于，水合肼的使用量为0.28mL；
其他原料使用量及操作步骤与实施例2相同。能够制备得到肽功能化纳米 钯，但是制得的肽功能化纳米钯对胰酶的响应性比实施例2稍差。
本实施例中，多肽与氯钯酸钠的物质的量比为0.5:1；水合肼与氯钯酸钠的 物质的量比为80～100:1。
实施例6
与实施例2的区别在于，S1.中调节pH至14；
其他原料使用量及操作步骤与实施例2相同。同样能够制备得到肽功能化纳 米钯，但制得的肽功能化纳米钯对胰酶的响应性比实施例2稍差。
本实施例中，多肽与氯钯酸钠的物质的量比为0.5:1；水合肼与氯钯酸钠的 物质的量比为40～50:1。
实施例7
与实施例2的区别在于，S1.中称量0.0021g CALNNGGARK和0.0067g CALNN；S2.中取7mL氯钯酸钠储备溶液；
其他原料使用量及操作步骤与实施例2相同。同样能够制备得到肽功能化纳 米钯。
本实施例中，多肽与氯钯酸钠的物质的量比为1:1；水合肼与氯钯酸钠的物 质的量比为40～50:1。
实施例8
与实施例2的区别在于，S1.中称量0.0019g CALNNRIYGEFK和0.0067g CALNN；
其他原料使用量及操作步骤与实施例2相同。同样能够制备得到肽功能化纳 米钯。
本实施例中，多肽与氯钯酸钠的物质的量比为0.5:1；水合肼与氯钯酸钠的 物质的量比为40～50:1。
测试结果：
对实施例1的肽功能化纳米钯的进行透射电镜测试，结果如图1所示，由图 1可知，所制备纳米材料的尺寸约为5nm；其中高分辨透射电镜图可看出，材料 的晶面间距为0.25nm和0.22nm，与钯的晶格结构中{1,1,0}面间距和{1,1,1}面间 距数据相符，表明制备所得确为纳米钯材料。实施例2～8制得的肽功能化纳米钯 的透射电镜测试结果与实施例1一致。
利用BCA方法分析实施例1的肽功能化纳米钯的肽配体，结果如图2所示， 从图2中可看出，以CALNN为阳性对照，利用BCA方法可使溶液的紫外-可见 吸收光谱发生变化，在564nm处出现最大吸收；对应地，本发明实施例1所制 备的纳米材料亦在564nm处出现与阳性对照一样的最大吸收峰，表明纳米材料 表面确是包覆了配体CALNN。
利用BCA方法和可见光吸收光谱分析实施例2的肽功能化纳米钯的肽配体， 结果如图3所示，BCA方法测试结果表明，实施例2制得的纳米材料表面确是 包覆了肽配体；同时由纳米钯的可见吸收光谱可知，相比实施例1中CALNN配 体包覆的纳米钯，实施例2的纳米钯在490nm处出现了一个吸收峰，这一吸收 峰与FITC的吸收峰相一致，表明纳米钯确是被肽CALNNGGARK(FITC)功能化。
同样利用可见光吸收光谱分析实施例3～6的肽功能化纳米钯，结果如图4～7 所示，测试结果表明，实施例3～6制得的纳米钯均被肽CALNNGGARK(FITC) 功能化。
对实施例7和实施例8制得的纳米钯，由于功能化肽上不带有产生明显紫外 -可见吸收峰的基团，改用Bradford方法对其功能化进行表征，由于Bradford试 剂主要与蛋白或肽上的碱性氨基酸，如精氨酸(R)和赖氨酸(K)结合，引起 Bradford试剂可见光吸收光谱的改变，造成595nm处的吸光度增强。测试结果 如图8所示，由于肽CALNNGGARK和CALNNRIYGEFK均带有R和K，经实 施例7和实施例8制得的功能化纳米钯与Bradford试剂作用后，595nm处的吸 光度明显增强，与阳性对照的结果相一致，而以实施例1制得的纳米钯为阴性对 照，由于肽不含有碱性氨基酸，其595nm处的吸光度相对试剂参比而言没有产 生明显的变化。结果表明，实施例7和实施例8制得的纳米钯确是分别被肽 CALNNGGARK和CALNNRIYGEFK功能化。
实施例2中，功能化肽上的FITC荧光团固定于纳米钯表面，由于纳米钯的 猝灭作用，FITC无法发射出荧光；当胰蛋白酶将功能化肽水解，荧光团游离出 来，远离纳米钯表面，纳米钯对FITC的猝灭作用减弱，从而FITC可发射出荧 光；因此，以FITC荧光强度的变化可验证纳米钯的胰蛋白酶活性，同时分析肽 功能化纳米钯的稳定性情况。如图9和表1所示，结果可以看出，相比于空白对 照，当胰蛋白酶存在时，荧光强度明显增强，说明肽功能化纳米钯确实具有胰蛋 白酶底物活性；同时，比较新鲜制备的肽功能能化纳米钯与存放了8个月之久的 肽功能化纳米钯可以看到，两者荧光强度变化一致，表明经过长时间的存放，肽 功能化纳米钯依然保持最初的状态和活性，具有很好的稳定性。
由表1可知，与实施例2类似，实施例3、实施例4、实施例5和实施例6 制备得到的肽功能化纳米钯均具有胰蛋白酶底物活性，且以实施例2制得的纳米 钯对胰蛋白酶的响应性最优。新鲜制备的肽功能化纳米钯与存放了8个月之久的 肽功能化纳米钯的荧光强度变化一致，具有很好的稳定性。因此，本发明制备得 到的肽功能化纳米钯具有良好稳定性，作为稳定配体的多肽为CALNN，作为功 能化的配体为CALNN增加功能化肽序列。
表1功能化纳米钯存放前后对胰蛋白酶响应情况比较
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非 是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明 的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施 方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进 等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种肽功能化纳米钯，其特征在于，所述肽功能化纳米钯包括纳米钯和作为配体的多肽，所述多肽为五肽、功能化肽中的一种或两种的混合物，所述五肽由CALNN的氨基酸序列表示，所述功能化肽为在CALNN氨基酸序列基础上增加功能序列。
2.根据权利要求1所述的肽功能化纳米钯，其特征在于，所述功能化肽为十肽、十二肽或FITC标记的十肽，所述十肽由CALNNGGARK的氨基酸序列表示，所述十二肽由CALNNRIYGEFK的氨基酸序列表示。
3.权利要求1~2任一项所述的肽功能化纳米钯的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1. 制得含有多肽和水合肼的水溶液；
S2. 将氯钯酸钠溶液加入到S1.的水溶液中，混合均匀，充分反应；
S3. 反应后进行纯化，得到肽功能化纳米钯，低温保存；
所述多肽与氯钯酸钠的物质的量比为0.2~1:1。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述水合肼与氯钯酸钠的物质的量比为40~100:1。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述水合肼与氯钯酸钠的物质的量比为40~50:1。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述混合溶液的pH为12~14。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，S2.的所述反应的时间为20~60min。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述氯钯酸钠溶液为二氯化钯与氯化钠按物质的量比为1:2，在酸性条件下混合配制而成。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述纯化的方法为高速离心、透析或超滤。
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