CN108517312A - 一种盖髓材料体外评估模型的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明申请涉及牙科制剂技术领域，具体涉及盖髓材料体外评估技术领域。本发明公开了一种盖髓材料体外评估模型的制备方法，其特征在于包括以下步骤：S1.获取离体牙；S2.分离牙髓细胞；S3.扩增细胞；S4.加ECM成球生长；S5.连续诱导，制备人牙本质提取物，将含牙本质提取物的培养基加入到培养板中连续诱导细胞，制成人牙髓类器官模型。本发明选取人体离体牙牙髓细胞，经过细胞分离、扩增，并采用创形式的细胞成球生长方法，最后采用连续诱导的方式，细胞的生长效率高，并高度模拟了人体牙髓器官，提升了整个材料体外评估的效率和准确性。
Description
技术领域
本发明属于牙科制剂技术领域，具体涉及盖髓材料体外评估技术领域。
背景技术
目前，在我国每年有大量的患者因为龋坏或外伤导致牙髓暴露或接近暴露，该疾病可能继发牙髓炎和根尖周炎，甚至能引起牙槽骨和颌骨炎症，龋齿的继发感染可以形成病灶，致成或加得关节炎、心骨膜炎和多种眼病等全身其他疾病。目前针对上述情况，在没有明显不可逆感染的情况下，患牙需要接受盖髓治疗，即用盖髓材料直接至于暴露的牙髓组织处，起到封闭暴露牙髓，避免感染和进一步刺激以及促进局部牙本质桥形成的作用。盖髓治疗又叫盖髓术，是一种保护活髓的方法，即用具有使牙髓病变恢复效应的制剂覆盖在近髓的牙本质上或已穿露的牙髓创面上，以保护牙髓，使其病变消除，盖髓术分为直接盖髓术和间接盖髓术。间接盖髓术适用于深龋引起的可复性牙髓炎，自发性痛，除腐质后未见穿髓而难以判断的慢性牙髓炎(可作为诊断性治疗)。直接盖髓术，用于意外穿髓、穿髓孔直径不超过0.5mm者，年轻恒牙的急性牙髓炎，或无明显自发痛的患牙，在除腐质穿髓时，其穿髓孔小，牙髓组织鲜红而敏感者。
因为盖髓材料和牙髓组织直接接触，对其材料生物相容性要求极高，一种理想的牙科盖髓材料要求具备极佳的生物相容性，即(1)能促进牙髓细胞增殖；(2)对牙髓细胞完全无刺激，不会导致牙髓细胞坏死和凋亡；(3)促进局部牙髓细胞矿化，形成牙本质桥。目前常用的直接盖髓材料有氢氧化钙，MTA等材料，虽然这些材料有比较好的性能，但是仍需改进。国内外的牙科产品公司也在不断开发新的牙科盖髓材料，新的材料在临床试验前需要检测材料对牙髓组织的生物相容性。
常用的临床前评估模型有2D细胞检测模型和动物体内模型，但都存在不同程度的问题。目前的体外细胞模型即是在培养平皿上接种人牙髓细胞，细胞呈单层生长，而细胞在体内是呈三维生长状态，用这种模型进行药物筛查检测不能反映人体内实际情况。动物体内模型有多种选择，如啮齿类动物、犬科动物、灵长类动物等，采用啮齿类动物或犬科动物，其牙髓细胞和人牙髓组织细胞差异很大，如小鼠的前牙可以一生都生长，故采用这种方法只能在一定程度上反映药物对牙髓组织的毒性或生物相容性，但是和人牙髓组织存在区别；而采用灵长类动物，则耗费巨大，并且存在违背伦理学审查要求的可能。故目前急需一种基于人牙髓细胞的研究模型来补充现有的牙髓研究模型，即采用人牙髓组织细胞建立的可用于盖髓材料生物相容性筛查的牙髓类器官模型。
发明内容
本发明公开了一种盖髓材料体外评估模型的制备方法，以代替现有的2D细胞检测模型和动物体内模型，实现通过人牙髓组织细胞建立可用于盖髓材料生物相容性筛查的牙髓类器官模型。
为解决上述问题，本发明提供的基础方案为，一种盖髓材料体外评估模型的制备方法，包括以下步骤：
S1.获取离体牙：取口腔门诊上新鲜拔除的健康完整、无牙体牙周疾病的阻生磨牙或因正畸拔除的前磨牙，即刻放入预冷的含青链霉素的无血清DMEM/F12培养基中进行原代培养，随后进行分离培养；
S2.分离牙髓细胞：清洗并将牙齿截断，暴露牙髓，取出牙髓用含青链霉素的PBS冲洗，将牙髓组织剪碎,随后进行离心操作,去除上清，并吸去多余的PBS冲洗液；
S3.扩增细胞：将步骤S2中的牙髓组织加入I型胶原酶溶液，加入含有FBS的DMEM/F12培养基终止消化，随后离心操作，去除上清；将组织块转移培养箱中培养，用胰酶消化收集细胞；将细胞用冻存液重悬后转移至冻存管，放入程序化冻存盒，冷却，后转移至液氮罐长期保存；
S4.加ECM成球生长：制备人牙髓特异性ECM，将步骤S3所获取牙髓细胞接种于培养板中，加入含有人牙髓特异性ECM的培养基进行培养；
S5.连续诱导：制备人牙本质提取物，将含牙本质提取物的培养基加入到培养板中连续诱导细胞，制成人牙髓类器官模型。
本发明的技术原理及有益效果：1.本基础方案选取人体离体牙牙髓细胞，经过细胞分离、扩增，并采用创形式的细胞成球生长方法，最后采用连续诱导的方式，细胞的生长呈三维生长，存活率高，牙髓特异性蛋白表达阳性，通过ECM和牙本质提取物构建细胞生长环境，即牙髓组织在体内的实际内外环境(被牙本质包裹和牙髓特异性基质微环境)，高度模拟了人体牙髓器官，提升了整个材料体外评估的效率和准确性。
2.本基础方案相比现有的2D细胞检测模型，具有更加接近于人体细胞的三维生长结构，检测的结果更加准确，对于盖髓材料体外评估的效果更加的精确，具有更加科学的参考意义。
3.本基础方案相比动物体内模型，其检测结果根据科学性，更加接近于人体真实情况，并有效了避免了对实验活体的伤害，还有效节约了实验成本。
进一步，所述步骤S1中获取离体牙的患者年龄控制在11-22岁之间。有益效果：该年龄段患者的牙髓细胞具有更强的生命力，细胞生长速度和存活率更高，提升了牙髓细胞培养的效率和实验的成功率。
进一步，所述S2中牙齿的截断位置为牙釉质牙骨质界。有益效果：解剖参照点清晰，重复性高，有助于区分冠髓和根髓，便于分离牙髓组织。
进一步，所述步骤S3中I型胶原酶溶液的浓度为3mg/mL，I型胶原酶溶液体积是组织块体积10倍以上。有益效果：在上述配比情况下，能够实现组织细胞的充分解离，促进细胞生长。
进一步，所述步骤S3中在进行细胞收集之前，细胞长至汇合度达70％。有益效果：细胞生长至该汇合度情况下，其生长情况已经达到一个较好的状态，便于细胞在后期的持续生长。
进一步，步骤S4中人牙髓特异性ECM制备的具体方式为，收集新鲜拔除的正畸牙或者阻生牙，取出牙髓组织，采用胰酶消化液处理，洗去尽残留胰酶，冻存2天，换用Triton X-100处理4天，冲洗采用真空冻干机冻干2天，将冻干的组织块粉碎成粉末，采用γ射线消毒；将上述消毒后的组织粉末和胃蛋白酶混合，加入HCL溶液溶解，离心操作，将所得上清液过滤后低温保存备用。有益效果：去除牙髓组织中细胞效率高，低温处理保存牙髓组织中的基质蛋白活性，并充分提取牙本质基质中的活性蛋白成分。
进一步，所述步骤S5中的制备人牙本质提取物的具体方式为，收集新鲜拔除的正畸牙或者阻生牙，截断丢弃牙冠保留牙根，去除牙根表面的软组织和磨出外壁残留牙骨质，去除根管内残留的牙髓，清洗，将牙本质磨成小块，浸入去离子水中用超声清洗剂荡洗，然后用EDTA溶液处理，处理后将其储存在含青链霉素的PBS中3天，接着用超声清洗剂荡洗，然后将其研磨成粉末。将上述粉末加入到α-MEM培养基中，充分搅拌，取该法所制备的人牙本质提取物的100％萃取液。有益效果：上述处理方式所提取的人牙本质提取物纯度高，无污染，对后期的实验数据影响较小。
进一步，所述EDTA溶液处理是采用浓度为17％的EDTA溶液处理5min，浓度为10％的EDTA溶液处理5min，浓度为5％的EDTA溶液处理10min。有益效果：上述在用量上逐渐减少的处理方式有利于逐步并充分暴露牙本质小管，使牙本质中的活性蛋白成分暴露析出。
进一步，在所述S5之后进行步骤S6，将拟检测盖髓材料的浸渍液20μL加入到S5建立的人牙髓类器官模型，用盖髓材料处理后制成人牙髓细胞3D盖髓模拟模型。有益效果：上述方式用于人牙髓细胞3D模型的建立，便于盖髓材料生物相容性的检测。
进一步，所述评估内容包括live/dead法检测活和死细胞比例、HE染色研究牙髓类器官模型形态结构变化、TUNEL法检测凋亡细胞数量、茜素红S染色检测材料诱导矿化能力、免疫荧光法检测特定炎症蛋白的表达。有益效果：本发明的盖髓材料体外评估模型在上述评估检测实验中的运用，能够较为完善的评估盖髓材料相容性，评估结果更具科学性。
附图说明
图1为本发明实施例工作流程的示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
实施例工作流程如附图1所示，本发明申请一种盖髓材料体外评估模型的制备方法，具体步骤为：
第一步，分离获取人牙髓细胞，收集口腔门诊新鲜拔除的正畸牙和阻生牙，取出牙髓，采用改良酶消化组织块法分离培养人牙髓细胞。待细胞长满瓶底约80％-90％时，常规传代并扩大培养。
具体方式为，(1)取口腔门诊上新鲜拔除的健康完整、无牙体牙周疾病的阻生磨牙或因正畸拔除的前磨牙,患者年龄控制在11-22岁之间，拔除前口腔内清洁消毒,拔除后即刻放入预冷的含200U/ml青霉素和0.2mg/ml链霉素的无血清DMEM/F12培养基中,并保证在4小时内进行原代培养，条件允许最好立刻分离培养。
(2)在超净工作台中,从预冷的培养基中取出牙齿,放在一60mm培养皿中，用含200U/ml青霉素和0.2mg/ml链霉素的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline)反复冲洗，去除牙齿表面残留的血液、唾液以及杂质；用便携式牙科涡轮机将牙齿从牙釉质和牙骨质界截断，暴露牙髓，用PBS充分冲洗；
(3)在1.5mL离心管中加入1mL PBS用镊子和牙科拔髓针将牙髓组织从牙髓腔中取出并放在EP管中，用含100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的PBS(磷酸缓冲盐溶液)冲洗3次；
(4)用剪刀将牙髓组织剪碎,充分控制牙髓组织尺寸,使组织的最大长度小于1mm3，随后进行离心操作，离心速度控制在1000rpm，时间为5min,去除上清，并吸去多余的PBS冲洗液；
(5)加入3mg/mL的I型胶原酶溶液，保证I型胶原酶溶液体积是组织块体积10倍以上，用振荡器充分震荡后置于37℃水浴40min；
(6)加入含有10％FBS的DMEM/F12培养基终止消化；
(7)随后离心操作，速度1000rpm，时间5min,去除上清；
(8)加入少量胎牛血清(FBS),将组织块转移至T25细胞培养瓶中，均匀分布于瓶底，于显微镜下方观察组织块分布情况；
(9)将T25细胞培养瓶底朝上放置，将培养瓶倒置放置在37℃,CO2浓度为5％的培养箱中培养；
(10)培养24h后翻转T25细胞培养瓶，加入3-4mL含10％FBS的DMEM/F12培养基，继续放入37℃,CO2浓度为5％的培养箱中培养；
(11)每3天跟换培养基一次，并在倒置显微镜下观察细胞是否从组织块中爬出，以及细胞形态和生长情况；
(12)待细胞长至汇合度为70％时，用浓度为0.25％的胰酶消化收集细胞，按照1：2或1：3传代。或将细胞转移至冻存管然后加入1mL冻存液，放入程序化冻存盒，放置于-80℃冰箱，1日后转移至液氮罐长期保存，以此获得人牙髓细胞。
第二步，人牙髓特异性ECM制备，此处的ECM是指细胞外基质，是组成间质和上皮血管中基质的不溶性结构成分，主要有胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖和糖蛋白等。研究表明，ECM可影响细胞分化、增殖、黏附、形态发生和表型表达等生物学过程，每种器官组织均有其特异性ECM构成，细胞的分化潜能，其增殖、分化和迁移与ECM有非常密切的关系。
具体为，收集新鲜拔除的正畸牙或者阻生牙，从牙釉质和牙骨质界处截断，取出牙髓组织，反复冲洗去除血液，采用0.05％胰酶消化液处理1小时，处理温度为37℃，后用去离子水冲洗去尽残留胰酶，放置在-80℃冰箱冻存2天，换用2％Triton X-100处理4天(处理温度为4℃，置于转速为300rpm的摇床上)，去离子水反复冲洗采用真空冻干机冻干2天，用研磨器将冻干的组织块粉碎成粉末，采用γ射线消毒。将上述消毒后的组织粉末(1g)和胃蛋白酶(100mg)混合，加入0.1N HCL溶液(10mL)溶解(防止于摇床转速控制在300rpm至混合均匀)，离心操作(转速1500rpm，时间5min)，保留上清，共离心3次，将所得上清液经0.22μm注射式过滤器过滤后保存在-80℃备用。
第三步，人牙本质提取物制备，收集新鲜拔除的正畸牙或者阻生牙，从牙釉质和牙骨质界处截断，丢弃牙冠，保留牙根，用刮治器去除牙根表面的软组织和磨出外壁残留牙骨质，并用拔髓针去除根管内残留的牙髓，用1％次氯酸钠溶液反复冲洗，生理盐水冲洗(反复3次，每次时间5min)，去除牙髓碎屑及次氯酸钠残留，将牙本质磨成最大长度小于1cm的小块，浸入去离子水中，用超声清洗剂荡洗30min，然后用浓度为17％的EDTA(EthyleneDiamine Tetra-acetic Acid，Sigma,USA)溶液处理5min，浓度为10％的EDTA溶液处理5min，浓度为5％的EDTA溶液处理10min，处理后将其储存在含1X AA(Antibiotic-Antimycotic，Thermo Fisher Scientific)的PBS中3天，接着用超声清洗剂荡洗30min，然后将其研磨成粉末。将上述粉末20g加入到100mL的α-MEM培养基中，充分搅拌(放置摇床上，转速300rpm，时间24h，温度4℃)，1500rpm状态下离心5min去除沉淀，取该法所制备的人牙本质提取物的100％萃取液。
第四步，人牙髓类器官模型的建立，将步骤一所获取牙髓细胞接种于96孔3D低黏附培养板(Ultra Low Attachment Microplate)中，每孔8000细胞，每孔加入100μL含10％牙髓ECM(步骤二制得)的培养基进行培养，3天后用加入100μL含10％牙本质提取物(步骤三获得)的培养基连续诱导1周。
第五步，盖髓材料的生物相容性检测，将拟检测盖髓材料的浸渍液20μL加入到步骤四的培养板中建立人牙髓类器官模型，每两天一换液，在用盖髓材料处理后一定时间(1，3，7，14，28天等，根据研究目的调整)后收集处理后的人牙髓细胞3D模型，进行下列检测来评估材料对人牙髓组织的生物相容性。检测的内容包括：
(1)live/dead法检测活和死细胞比例；
(2)HE染色研究牙髓类器官模型形态结构变化；
(3)TUNEL法检测凋亡细胞数量；
(4)茜素红S染色检测材料诱导矿化能力；
(5)免疫荧光法检测特定炎症蛋白的表达(如TNF-α的表达)。
Claims (10)
1.一种盖髓材料体外评估模型的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
S1.获取离体牙：取口腔门诊上新鲜拔除的健康完整、无牙体牙周疾病的阻生磨牙或因正畸拔除的前磨牙，即刻放入预冷的含青链霉素的无血清DMEM/F12培养基中进行原代培养，随后进行分离培养；
S2.分离牙髓细胞：清洗并将牙齿截断，暴露牙髓，取出牙髓用含青链霉素的PBS冲洗，将牙髓组织剪碎,随后进行离心操作,去除上清，并吸去多余的PBS冲洗液；
S3.扩增细胞：将步骤S2中的牙髓组织加入I型胶原酶溶液，加入含有FBS的DMEM/F12培养基终止消化，随后离心操作，去除上清；将组织块转移培养箱中培养，用胰酶消化收集细胞；将细胞用冻存液重悬后转移至冻存管，放入程序化冻存盒，冷却，后转移至液氮罐长期保存；
S4.加ECM成球生长：制备人牙髓特异性ECM，将步骤S3所获取牙髓细胞接种于培养板中，加入含有人牙髓特异性ECM的培养基进行培养；
S5.连续诱导：制备人牙本质提取物，将含牙本质提取物的培养基加入到培养板中连续诱导细胞，制成人牙髓类器官模型。
2.根据权利要求1所述的盖髓材料体外评估模型的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中获取离体牙的患者年龄控制在11-22岁之间。
3.根据权利要求1所述的盖髓材料体外评估模型的制备方法，其特征在于：所述S2中牙齿的截断位置为牙釉质牙骨质界。
4.根据权利要求1所述的盖髓材料体外评估模型的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中I型胶原酶溶液的浓度为3mg/mL，I型胶原酶溶液体积是组织块体积10倍以上。
5.根据权利要求1所述的盖髓材料体外评估模型的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中在进行细胞收集之前，细胞长至汇合度达70％。
6.根据权利要求1所述的盖髓材料体外评估模型的制备方法，其特征在于：步骤S4中人牙髓特异性ECM制备的具体方式为，收集新鲜拔除的正畸牙或者阻生牙，取出牙髓组织，采用胰酶消化液处理，洗去尽残留胰酶，冻存2天，换用Triton X-100处理4天，冲洗后采用真空冻干机冻干2天，将冻干的组织块粉碎成粉末，采用γ射线消毒；将上述消毒后的组织粉末和胃蛋白酶混合，加入HCL溶液溶解，离心操作，将所得上清液过滤后低温保存备用。
7.根据权利要求1所述的盖髓材料体外评估模型的制备方法，其特征在于：所述步骤S5中的制备人牙本质提取物的具体方式为，收集新鲜拔除的正畸牙或者阻生牙，截断丢弃牙冠保留牙根，去除牙根表面的软组织和磨出外壁残留牙骨质，去除根管内残留的牙髓，清洗，将牙本质磨成小块，浸入去离子水中用超声清洗剂荡洗，然后用EDTA溶液处理，处理后将其储存在含青链霉素的PBS中3天，接着用超声清洗剂荡洗，然后将其研磨成粉末。将上述粉末加入到α-MEM培养基中，充分搅拌，取该法所制备的人牙本质提取物的100％萃取液。
8.根据权利要求7所述的盖髓材料体外评估模型的制备方法，其特征在于：所述EDTA溶液处理是采用浓度为17％的EDTA溶液处理5min，浓度为10％的EDTA溶液处理5min，浓度为5％的EDTA溶液处理10min。
9.根据权利要求8所述的盖髓材料体外评估模型的制备方法，其特征在于：在所述S5之后进行步骤S6，将拟检测盖髓材料的浸渍液20μL加入到S5建立的人牙髓类器官模型，用盖髓材料处理后制成人牙髓细胞3D盖髓模拟模型。
10.根据权利要求9所述的盖髓材料体外评估模型的制备方法，其特征在于：所述评估内容包括live/dead法检测活和死细胞比例、HE染色研究牙髓类器官模型形态结构变化、TUNEL法检测凋亡细胞数量、茜素红S染色检测材料诱导矿化能力、免疫荧光法检测特定炎症蛋白的表达。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN116077347A (zh) * | 2023-01-17 | 2023-05-09 | 重庆医科大学附属口腔医院 | 一种天然牙本质提取材料及其制备方法和应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102138865A (zh) * | 2011-03-31 | 2011-08-03 | 四川大学 | 一种具有生物活性的盖髓剂及其制备方法 |
| CN103966158A (zh) * | 2014-05-28 | 2014-08-06 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种牙周组织特异性细胞外基质ecm的制备方法及其应用 |
| CN106890363A (zh) * | 2015-12-17 | 2017-06-27 | 西安组织工程与再生医学研究所 | 一种工程化牙髓的制备方法 |
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102138865A (zh) * | 2011-03-31 | 2011-08-03 | 四川大学 | 一种具有生物活性的盖髓剂及其制备方法 |
| CN103966158A (zh) * | 2014-05-28 | 2014-08-06 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种牙周组织特异性细胞外基质ecm的制备方法及其应用 |
| CN106890363A (zh) * | 2015-12-17 | 2017-06-27 | 西安组织工程与再生医学研究所 | 一种工程化牙髓的制备方法 |
| CN107267451A (zh) * | 2017-07-27 | 2017-10-20 | 温州优牙生物科技有限公司 | 一种原代牙髓干细胞的制备方法及构建牙髓干细胞库的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MINJU SONG ET.AL.,: "Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice", 《JOURNAL OF VISUALIZED EXPERIMENTS》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116077347A (zh) * | 2023-01-17 | 2023-05-09 | 重庆医科大学附属口腔医院 | 一种天然牙本质提取材料及其制备方法和应用 |
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