CN108486253A - 一种胰腺癌预后分子标志物非编码RNA Lnc-DCTD-25及其应用 - Google Patents

一种胰腺癌预后分子标志物非编码RNA Lnc-DCTD-25及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及胰腺癌预后分子标志物非编码RNA Lnc‑DCTD‑25及其应用，可有效解决制备预测胰腺癌患者预后的试剂盒的问题，一种胰腺癌预后分子标志物非编码RNA Lnc‑DCTD‑25，其转录本长度大于200个核苷酸，序列为SEQ NO:1，在制备胰腺癌预后实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用，该试剂盒包括置于盒体内的用于检测胰腺癌患者预后的试剂盒表达的特异性引物，引物序列为SEQ No：2和3、内参基因TUBA1A表达的引物序列，引物序列为SEQ No：4、5和从胰腺癌组织中提取RNA，并进行逆转录及荧光定量PCR的试剂，本发明非编码RNA Lnc‑DCTD‑25作为胰腺癌预后新的分子标志物，可及时预测胰腺癌预后，并及时对胰腺癌患者进行治疗，延长患者生存时间，提高生存率，是胰腺癌预后上的一大创新。

Description

一种胰腺癌预后分子标志物非编码RNA Lnc-DCTD-25及其 应用
技术领域
本发明涉及肿瘤分子生物学，特别是一种胰腺癌预后分子标志物非编码RNA Lnc-DCTD-25及其应用。
背景技术
胰腺癌是一种恶性程度很高的肿瘤，发病率趋增，预后差，5年生存率低。在美国，患者因胰腺癌死亡，在所有肿瘤死因中居第四位。而在我国，胰腺癌则居癌症死亡率的第6位。究其原因主要与早期诊断率低、具有侵润性、放化疗不敏感等有关。尽管现有诊断方法主要是影像学检查如B超、内镜超声，腹部磁共振及胰胆管造影检查以及腹部计算机断层扫描检查等，当指标升高或症状出现进行影像学检查时病情已到中晚期，限制了胰腺癌的诊治水平，治疗效果及预后自然较差。在众多胰腺癌的治疗方法中，外科手术是唯一可能治愈胰腺癌的手段，五年生存率在根治性切除后可达20％至30％，但临床上大约只有10％的病人得到根治性切除手术的机会。目前，临床上还没有理想的分子指标来评估预后及发生转移的风险。因此，寻找新的预后生物标志物是目前急需解决的问题。
近几十年来，越来越多的研究发现RNA非编码基因片段具有应用在诊断和治疗重大疾病方面潜在的商业价值。非编码基因片段包括非编码RNA和编码蛋白mRNA的非编码区段。非编码RNA是所有不编码蛋白质的RNA转录本的统称，其代表是微小RNA和长非编码RNA。在可编码蛋白mRNA上存在的非编码区段代表是核糖开关。微小RNA是一类长度介于18~25个核苷酸的非编码RNA，研究表明人类编码蛋白的基因中约30%受到miRNAs调控。它们参与基因的表达及调控、RNA加工及剪切和蛋白质翻译等生物学过程，强烈调控着生物的生长和发育。长非编码RNA是一类长度大于二百个核苷酸的非编码RNA，它们参与基因的表达及调控、RNA加工及编辑、蛋白质翻译、印迹调控和端粒系统的调控等。Lnc-DCTD-25是一种新发现的非编码RNA，其转录本长度大于 200个核苷酸。目前，非编码RNA Lnc-DCTD-25在正常细胞发育或肿瘤发生发展的过程中发挥的重要作用还在进一步研究中。Lnc-DCTD-25是否可以作为一种新的肿瘤标志物制备试剂及试剂盒，应用于预测胰腺癌患者预后至今未见有公开报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种胰腺癌预后分子标志物非编码RNA Lnc-DCTD-25及其应用，可有效解决制备预测胰腺癌患者预后的试剂盒的问题。
本发明解决的技术方案是，一种胰腺癌预后分子标志物非编码RNA Lnc-DCTD-25，其转录本长度大于 200个核苷酸，序列为SEQ NO:1；
该胰腺癌预后分子标志物非编码RNA Lnc-DCTD-25在制备胰腺癌预后实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用；
所述的胰腺癌预后实时荧光定量PCR检测试剂盒包括置于盒体内的用于检测胰腺癌患者预后的试剂盒表达的特异性引物，引物序列为SEQ No：2和3、内参基因TUBA1A表达的引物序列，引物序列为SEQ No：4、5和从胰腺癌组织中提取RNA，并进行逆转录及荧光定量PCR的试剂。
本发明Lnc-DCTD-25是一种新发现的非编码RNA，可有效用于制备胰腺癌患者预后的试剂盒，非编码RNA Lnc-DCTD-25作为胰腺癌预后新的分子标志物，可及时预测胰腺癌预后，并及时对胰腺癌患者进行治疗，延长患者生存时间，提高生存率，是胰腺癌预后上的一大创新，经济和社会效益巨大。
附图说明
图1为本发明实时荧光定量PCR分析Lnc-DCTD-25在正常组织与胰腺癌中的表达差异图。
图2为本发明对胰腺癌患者的预后影响生存曲线分析胰腺癌组织来源的Lnc-DCTD-25表达高低图。
具体实施方式
以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，一种胰腺癌预后分子标志物非编码RNA Lnc-DCTD-25，为新发现的一种非编码RNA Lnc-DCTD-25分子标志物，为长链非编码RNA，其转录本长度大于200个核苷酸，该核苷酸序列为SEQ No：1：
SEQ NO:1
CGCTGCAGAAGCCTTCTGTCCCCTGCCTGCCCCGGAAAGCGGTGACATCCCGGGGCTTTCCGCTCGCTGGAAGCCCCCCAGGATCCTGTTAAGACGCCCCCGCAGAAGACGCGGGGCCTCGCCACACATCGGGGGCCGAAGAGGACCTGGCGGGCTCCCCTCCCCGCCCCCACTGGGCGCCCAGCCTCCGGACTGCCTTCCTCAGGGACCCCGGGGCTCCCCAGTACGGGGGCGCGGCGCCTGGCTCCCCGGGCGAGAGGCGCCGGCGAAGTTCCCACCTGAGCCGGCGGCCGGAGATCGCGGGAGAGCCCAATCACGGGGCGAGCTGGACCTGGCTGTGATCATTTATAATCCTTGACTCCTCCGCTCCGCCACTTGTCAAGATGACAGGGGTCATCCGTGAATAACACTTCACGCTGATGAATGGCTCTTGCCGGCTTTCGGCTCTGATGAGGGGTCTGCCCGCCGCCGATTGAAAACACTAATGAACTTACTGCGCCATTTGAAATTCACACGCACCAACAAAATGGGGGGTGGGCATTTCAGGTCAGCTGAGTCACCCGAGGAGGTGGCAGTGCAAGACACTG 587
该胰腺癌预后分子标志物非编码RNA Lnc-DCTD-25在制备胰腺癌预后实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用；
所述的胰腺癌预后实时荧光定量PCR检测试剂盒包括置于盒体内的用于检测胰腺癌患者预后的试剂盒表达的特异性引物，引物序列为SEQ No：2和3、内参基因TUBA1A表达的引物序列，引物序列为SEQ No：4、5和从胰腺癌组织中提取RNA，并进行逆转录及荧光定量PCR的试剂，其中：
SEQ NO:2
GATCCTGTTAAGACGCCCCC
SEQ NO:3
TGTCTTGCACTGCCACCTC
SEQ NO:4
ggtgacgtggttcccaaaga
SEQ NO:5
ttacagcgcgactcttaggc
所述的检测胰腺癌组织中Lnc-DCTD-25表达量的试剂盒为实时荧光定PCR检测试剂盒。
所述的实时荧光定量PCR检测试剂盒包括进行实时荧光定量PCR的特异性引物，包括用于检测Lnc-DCTD-25表达的特异性引物，引物序列为SEQ NO: 2、3，以及内参基因TUBA1A表达的引物序列，引物序列为SEQ NO: 4、5。
所述的实时荧光定量PCR检测试剂盒，除Lnc-DCTD-25的引物外，还含有从胰腺癌组织中提取RNA并进行逆转录及荧光定量PCR的所有试剂。包括：
(1)从胰腺癌的肿瘤或正常对照组织中抽提总RNA所用试剂，包括Trizol液、氯仿、异丙醇、抑制RNA降解溶剂、75％乙醇，DEPC水；
(2)以总RNA为模板将Lnc-DCTD-25逆转录为cDNA所用试剂，包括逆转录反应缓冲液、含有含Mg2+的三磷酸碱基脱氧核苷酸dNTP、逆转录酶M-MLV以及随机引物和Oligo dT引物的混合物；
(3)将cDNA实时定量PCR所用试剂，包括Lnc-DCTD-25实时荧光定量PCR特异性引物、TUBA1A内参特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料、无RNA酶的水。
本发明通过荧光定量PCR与生存曲线分析发现胰腺癌组织来源的Lnc-DCTD-25与患者的生存率相关，含量越高，生存率越高。此法为预测胰腺癌患者的预后生存期分析提供了强有力的技术支持，有助于提高胰腺癌患者的术后生活质量，制订术后治疗方案，提高生存率，具有深远的临床意义。并经实地试验，取得了非常满意的有益技术效果，有关资料如下：
实施例1 制备检测Lnc-DCTD-25表达量的试剂用于制备胰腺癌患者预后的试剂盒(用于30次反应)
1. Trizo l20ml
2. 抑制RNA降解溶剂 40ml
3. 氯仿80ml
4. 异丙醇80ml
5. DEPC水10ml
6. 10×随机引物和Oligo dT引物的混合物100μl
7. 5×逆转录反应缓冲液150μl
8. 10mM含Mg2+的三磷酸碱基脱氧核苷酸dNTP 100μl
9. 200U/μl M-MLV逆转录酶50μl
10. SYBR Green qPCR Mix 500μl
11. 3μM 目的基因Lnc-DCTD-25特异性引物（其序列如SEQ NO: 2、3所示） 50μl
12. 3μM 内参基因TUBA1A特异性引物（其序列如SEQ NO: 4、5所示） 50μl
实施例2 组织样本Lnc-DCTD-25的检测
1、收集待测胰腺癌或正常对照组织，生理盐水清洗干净后，放入盛有抑制RNA降解溶剂的冻存管中，放至-80℃冰箱备用。
2、组织中RNA的抽提：
（1）先在研钵中加入液氮，再将组织剪成小块在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中。组织粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%，充分混合均匀。
（2）室温放置5分钟，然后加入200μL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡0.5分钟。12000转/分钟离心10分钟。
（3）取上层水相于一新的EP管中（勿中间的沉淀层和下层液混入），加入500μL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10分钟，12000转/分钟离心10分钟。
（4）小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000转/分钟离心5分钟。重复操作一次。
（5）弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10分钟（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用50μL DEPC处理过的水将RNA溶解。
（6）RNA浓度测定：用核酸浓度测定仪进行测定，吸1μL RNA样品加至样品孔，根据读数直接确定RNA的浓度。核酸浓度测定仪的测定的OD260/OD280比值，比值在1.8-2.0之间认为RNA纯度很好。最后，RNA贮存于-80℃冰箱备用。
3、Lnc-DCTD-25 RNA的逆转录：使用上海碧云天生物技术有限公司的逆转录试剂盒（D7170S）。具体步骤如下。
（1）去除基因组DNA：将模板Total RNA，5×gDNA Eraser Buffer在冰上解冻，5×RT Buffer、10×RT Primer Mix、DEPC-treated Water在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液混匀并短暂离心以使所有液体沉降至管底。 RNA的变性，把RNA样品在65℃条件下热变性5 分钟后，立即置于冰水中冷却。按下表成分于冰上配制反应混合液，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。
试剂 使用量
5×gDNA Eraser Buffer 2μl
Total RNA up to 0.5μg
DEPC-treated Water 至10μl
总体积 10μl
（2）在PCR仪上或水浴中，37℃孵育2分钟。迅速置于冰上放置备用。
（3）逆转录体系配制：在冰上进行反应液配制，轻柔混匀后立即进行逆转录反应。按照下表的逆转录反应体系配制混合液。
试剂 使用量
5×RT Buffer（含Mg2+和dNTP） 4μl
10×RT Primer Mix（Oligo dT Primer和Random Hexamers混合物） 2μl
BeyoRT™ II M-MLV逆转录酶(RNase H-)（含RNase Inhibitor） 2μl
DEPC-treated water 2μl
上述去除gDNA后的Total RNA 10μl
总体积 20μl
（4）42℃孵育60 分钟以进行逆转录反应，随后80℃孵育10 分钟失活逆转录酶后放于冰上。对于二级结构复杂或高GC含量的模板，可以提高逆转录温度至50℃，以增强逆转录效率。
（5）得到的cDNA可立即或-80℃冻存后用于后续实时荧光定量PCR，cDNA宜避免过多的反复冻融。
4、利用Lnc-DCTD-25的特异性引物进行实时定量PCR：特异性引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成，包括用于检测Lnc-DCTD-25表达的特异性引物，引物序列为SEQNO: 2、3，以及内参基因TUBA1A表达的引物序列，引物序列为SEQ NO: 4、5。实时定量PCR其它试剂利用上海碧云天生物技术有限公司的BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2×)，具体步骤如下。
（1）融解并混匀PCR反应所需的各种溶液，BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix完全融解并混匀后置于冰盒内。
（2）冰浴上设置PCR反应体系(以96孔板为例)：
试剂 使用量
BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X, Low ROX) 10μl
特异性引物(浓度3μM) 2μl
模板DNA 2μl
无RNA酶的水 6μl
总体积 20μl
(3) 通常DNA模板的量以1-10ng cDNA为参考用量，引物的终浓度为0.2-0.5μM时可获得良好的检测效果，也可根据情况调整引物的终浓度。如有必要，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。逆转录PCR反应得到的cDNA直接作为模板时，其添加量不要超过PCR反应总体积的10%。96孔板的推荐反应体系为20μl，也可以根据实际实验需求，按比例扩大或缩小反应体系。
(4) 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。
(5) 将设置好的PCR反应管或PCR反应板置于荧光定量PCR仪上，开始PCR反应。
(6) PCR反应程序：在实时荧光定量PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃ 2分钟。采用如下的PCR程序，本程序是以ABI 7900HT荧光定量PCR仪为例：
a. 预变性：95℃ 2min
b. 变性：95℃ 15sec
c. 退火/延伸：60℃ 15-30sec
d. 重复步骤b和步骤c，总共40个循环
e. 熔解曲线分析(可选)：95℃ 15sec, 60℃ 15sec, 95℃ 15sec
f. 使用荧光定量PCR仪提供的软件分析结果
三步法只需在退火/延伸后加一步72℃ 30sec，随后重复步骤b、c及增加的这一步骤共40个循环即可。
5、Lnc-DCTD-25表达量的数据分析：本实验数据纳入60例胰腺癌患者及其正常对照组织。实时定量PCR的结果分析采用相对定量方法即2^-△△Ct法。具体如下：首先，将一次实验的所有基因Ct值整理好，之后用每一组肿瘤样本中的目的基因Lnc-DCTD-25的Ct值减去自身内参基因TUBA1A的Ct值，得到的数就是△Ct；换成公式就是：△Ct=Ct（目的基因Lnc-DCTD-25）-Ct（内参基因TUBA1A）；然后，将每一组肿瘤样本每一个目的基因Lnc-DCTD-25的△Ct都算好。用本次实验中肿瘤组织样本的△Ct减去正常对照组织组样本的△Ct，并同时对所有结果取相反数，该步运算得到的结果就是-△△Ct。最后，对-△△Ct进行2的幂运算，即2^-△△Ct就得出表达量的倍数改变。重复三次，利用非参数t-检验进行统计分析。我们发现，胰腺癌的肿瘤组织中Lnc-DCTD-25的表达量比正常对照高（见图1），差异具有统计学差异(p＜0.05)。
6、通过对上述实验所纳入的60例胰腺癌患者随访统计资料，包括患者首次发病的时间，治疗情况，复发状况及死亡时间等，随访时间为至少12个月。在所选取的胰腺癌患者中，选取荧光实时定量PCR分析的表达值为参考标准，所得结果与其对应的正常组织相比较。肿瘤组织中Lnc-DCTD-25表达高于正常对照组织的患者定义为Lnc-DCTD-25高表达组，其余为低表达组。通过Kaplan-Meier生存分析，Lnc-DCTD-25高表达患者的生存期比Lnc-DCTD-25低表达组的患者明显降低，预后更差（见图2），差异具有有统计学意义(p＜0.05)。因此，Lnc-DCTD-25可作为胰腺癌患者预后的特异性分子标志物。
由以上可以清楚的看出，本发明公开了一种新的胰腺癌预后分子标志物非编码RNA Lnc-DCTD-25，用于制备胰腺癌患者的试剂盒，通过检测胰腺癌肿瘤组织来源的Lnc-DCTD-25的试剂盒。通过研究证实Lnc-CIT-1在胰腺癌中表达上调，高表达Lnc-DCTD-25的胰腺癌患者，其总体生存率更差。因此，通过检测胰腺癌患者肿瘤组织中Lnc-DCTD-25的表达水平，可以对胰腺癌患者做出预后检查诊断，准确率高达96%以上，并进行及时治疗，提高患者生存率和生存质量，具有深远的临床应用意义和推广应用价值，经济和社会效益巨大。
序列表
<110> 郑州大学第一附属医院
<120> 一种胰腺癌预后分子标志物非编码RNA Lnc-DCTD-25及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 587
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
cgctgcagaa gccttctgtc ccctgcctgc cccggaaagc ggtgacatcc cggggctttc 60
cgctcgctgg aagcccccca ggatcctgtt aagacgcccc cgcagaagac gcggggcctc 120
gccacacatc gggggccgaa gaggacctgg cgggctcccc tccccgcccc cactgggcgc 180
ccagcctccg gactgccttc ctcagggacc ccggggctcc ccagtacggg ggcgcggcgc 240
ctggctcccc gggcgagagg cgccggcgaa gttcccacct gagccggcgg ccggagatcg 300
cgggagagcc caatcacggg gcgagctgga cctggctgtg atcatttata atccttgact 360
cctccgctcc gccacttgtc aagatgacag gggtcatccg tgaataacac ttcacgctga 420
tgaatggctc ttgccggctt tcggctctga tgaggggtct gcccgccgcc gattgaaaac 480
actaatgaac ttactgcgcc atttgaaatt cacacgcacc aacaaaatgg ggggtgggca 540
tttcaggtca gctgagtcac ccgaggaggt ggcagtgcaa gacactg 587
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gatcctgtta agacgccccc 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tgtcttgcac tgccacctc 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ggtgacgtgg ttcccaaaga 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ttacagcgcg actcttaggc 20

Claims (3)

1.一种胰腺癌预后分子标志物非编码RNA Lnc-DCTD-25，为长链非编码RNA，其转录本长度大于200个核苷酸，该核苷酸序列为SEQ No：1。
2.权利要求1所述的胰腺癌预后分子标志物非编码RNA Lnc-DCTD-25在制备胰腺癌预后实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用。
3.权利要求2所述的胰腺癌预后分子标志物非编码RNA Lnc-DCTD-25在制备胰腺癌预后实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述的胰腺癌预后实时荧光定量PCR检测试剂盒包括置于盒体内的用于检测胰腺癌患者预后的试剂盒表达的特异性引物，引物序列为SEQ No：2和3、内参基因TUBA1A表达的引物序列，引物序列为SEQ No：4、5和从胰腺组织中提取RNA，并进行逆转录及荧光定量PCR的试剂。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN106350600A (zh) * 2016-11-04 2017-01-25 叶伟亮 Loc80054在胰腺癌诊断或预后中的用途
CN106399569A (zh) * 2016-12-01 2017-02-15 北京致成生物医学科技有限公司 C21orf82在制备胰腺癌预后评估产品中的应用

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