CN108486241A

CN108486241A - 用于诊断复发性流产的血清信使核糖核酸生物标志物、引物组及应用和试剂盒

Info

Publication number: CN108486241A
Application number: CN201810205531.2A
Authority: CN
Inventors: 王嵘; 于明明; 徐俏俏; 杜桂珍; 韩莉; 陆春城; 夏彦恺; 王心如
Original assignee: Nanjing Medical University
Current assignee: Nanjing Medical University
Priority date: 2018-03-13
Filing date: 2018-03-13
Publication date: 2018-09-04
Anticipated expiration: 2038-03-13
Also published as: CN108486241B

Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及用于诊断复发性流产的血清信使核糖核酸生物标志物、引物组及应用和试剂盒。所述血清信使核糖核酸生物标志物包括：与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有90％以上同源性的第一mRNA、与SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有90％以上同源性的第二mRNA和与SEQ ID NO：3所示核苷酸序列具有90％以上同源性的第三mRNA中的至少一种。血清mRNA是新颖的生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，而且定量精确，将大大提高复发性流产诊断的敏感性和特异性。

Description

用于诊断复发性流产的血清信使核糖核酸生物标志物、引物组及应用和试剂盒

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地，涉及用于诊断复发性流产的血清信使核糖核酸生物标志物、引物组及应用和试剂盒。

背景技术

自然流产是生育年龄妇女最常见的疾患之一，生育年龄的妇女，15～20％的临床妊娠以自然流产为结局。流行病学调查研究认为，自然流产是一种多病因疾病。目前已经明确的自然流产的主要原因仍然是胚胎染色体的异常。母体生殖道解剖异常、内分泌异常、免疫紊乱、凝血功能异常、代谢异常等也可能导致流产的发生。但即使经过详细严格的病因筛查，仍有40～60％的自然流产病因不明，这使临床上自然流产的有效治疗受到限制，也给临床遗传咨询医生指导患者再次妊娠带来困难，也使自然流产发病机制的研究成为优生遗传和辅助生育技术中的热点之一。多年前，由于检测条件的限制以及人类基因组的复杂性和多样性，人们主要研究流产组织的核型。近年来，随着分子细胞遗传学的进步和人类基因组工程的完成，对流产组织的分析逐渐进入分子水平。研究表明，蜕膜组织的免疫相关基因群、血管发生相关基因群、凋亡相关基因群和其他一些未确定的基因与自然流产有关。但是，至今未确定某个基因在自然流产的胚胎停育中有致死突变作用。

成功的妊娠建立在母体子宫内膜和胚胎之间相互协调、精确调控的基础之上：一方面，滋养层细胞分裂、增殖，并沿着蜕膜和蜕膜外两个方向分化，形成生物学特性明显不同的两种细胞：无侵袭能力的细胞滋养层细胞(Cytotrophoblast cells，CTB)和有侵袭能力的蜕膜外滋养层细胞(Extravillous trophoblast cells，EVT)。EVT的侵袭作用在妊娠9～12周达高峰，并向子宫内膜间质和螺旋动脉腔内侵袭性生长，为胎盘形成及胚胎早期发育分化创造条件。另一方面，子宫内膜发生一系列复杂而精细的蜕膜化改变如细胞外基质的降解重塑和血管的发生。在此过程中，细胞外基质从间质型转化为基膜型，胶原基质的纤维成分减少，VI型胶原被降解。而血管生成有两种方式即Angiogenesi和Vasculogenesis。Angiogenesi是从现有的血管经过上皮细胞重塑，长出新血管的过程，而Vasculogenesis是从干细胞分化出新血管的过程。前者是个入侵的过程，需要细胞外基质的降解和内皮细胞的增殖、迁移以及新基质成分的合成。近年来，随着对子宫内膜容受性及蜕膜化过程的研究揭示，胚胎滋养细胞对子宫内膜的有控性侵袭是胚胎正常发育的基础。

随着人类基因组物理图谱的初步完成，人类对生命本质和疾病的研究进入了后基因组时代，即从“结构基因组学”进入了“功能基因组学”和“蛋白质组学”。目前将转录组测序和蛋白质组学技术应用于正常的生理过程——正常妊娠子宫内膜蜕膜化已有较多研究，而对于病理过程.自然流产子宫内膜蜕膜化研究报道很少。自然流产子宫蜕膜组织微环境的整体变化如何？究竟有哪些基因和蛋白发生了变化？其相应的的信号通路又是如何改变的？这些变化与子宫内膜蜕膜化、胚胎滋养细胞的侵袭、妊娠结局的关系如何？目前仍缺乏相关研究资料。

研究发现血清中存在着很多的mRNA，性质相对稳定、表达量丰富，特异性较高，且易于定量检测。据报道，在肺癌、结肠癌等疾病中已经证实mRNA的表达谱对早期诊断有一定的提示作用，可作为这些疾病的潜在生物标志物。因此，血清mRNA作为信使RNA，其差异表达谱同样也可能可以作为复发性流产早期诊断的生物标志物。

目前还没有将mRNA应用于复发性流产辅助诊断的报道，若能筛选出复发性流产相关的mRNA作为早期诊断的生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对复发性流产的诊断现状必将是一次有力的推动，也为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟了一条新的途径。

发明内容

本发明的目的是提供与复发性自然流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)发生相关的血清信使核糖核酸生物标志物、引物组及应用和试剂盒。

本发明人通过分离和检测复发性流产病例和非医学原因选择流产对照血清中的mRNAs，发现了血清中存在可用于评估复发性流产发生风险的特异性和敏感性(实施例5的ROC曲线显示具有较好的灵敏度)的mRNA组合，从而提出了复发性流产患者的血清mRNA标志物组合，以及所述血清mRNA标志物或其引物在制备复发性流产辅助诊断试剂中的应用，研制出便于临床应用的复发性流产诊断试剂盒。

具体地，本发明的第一方面提供一组用于诊断复发性流产的血清信使核糖核酸生物标志物，所述血清信使核糖核酸生物标志物包括：与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列(ZBP1)具有90％以上同源性的第一mRNA、与SEQ ID NO：2所示核苷酸序列(ARID5A)具有90％以上同源性的第二mRNA和与SEQ ID NO：3所示核苷酸序列(ALPL)具有90％以上同源性的第三mRNA中的至少一种。

优选地，所述血清信使核糖核酸生物标志物包括：与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有95％以上同源性的第一mRNA、与SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有95％以上同源性的第二mRNA和与SEQ ID NO：3所示核苷酸序列具有95％以上同源性的第三mRNA中的至少一种。

进一步优选地，所述血清信使核糖核酸生物标志物包括：与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有96％、97％、98％、99％以上同源性的第一mRNA、与SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有96％、97％、98％、99％以上同源性的第二mRNA和与SEQ ID NO：3所示核苷酸序列具有96％、97％、98％、99％以上同源性的第三mRNA中的至少一种。

再优选地，所述血清信使核糖核酸生物标志物包括：具有如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的第一mRNA(ZBP1)、具有如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的第二mRNA(ARID5A)和具有如SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的第三mRNA(ALPL)中的至少一种，最优选为三种的组合。

本发明的第二方面提供用于检测上述的血清信使核糖核酸生物标志物的引物组，所述引物组包括以下三组中至少两组的引物：

用于检测第一mRNA的上游引物和下游引物；

用于检测第二mRNA的上游引物和下游引物；

用于检测第三mRNA的上游引物和下游引物。

本领域技术人员能够确定，引物组中具体包括哪两组取决于标志物的类型。

本领域技术人员可根据常规手段设计上述引物，优选地，

用于检测第一mRNA的上游引物具有SEQ ID NO：4所示核苷酸序列，下游引物具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；

用于检测第二mRNA的上游引物具有SEQ ID NO：6所示核苷酸序列，下游引物具有SEQ ID NO：7所示核苷酸序列；

用于检测第三mRNA的上游引物具有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列，下游引物具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列。

本发明的第三方面提供上述的血清信使核糖核酸生物标志物和/或引物组在制备复发性流产诊断或监测试剂中的应用。所述试剂为能够测定这些血清mRNA标志物在血清中表达量的试剂。

本发明的第四方面提供一种复发性流产诊断或监测试剂盒，该试剂盒包括上述的引物组。

所述试剂盒还可以包括内参，以及相关PCR技术常用的其他试剂。优选地，所述试剂盒还包括：

(1)内参GAPDH的正反向引物(SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12)；和/或

(2)DNA聚合酶、PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs、水和核酸染料中的至少一种。

本发明人严格按照标准操作程序(SOP)采集符合标准的蜕膜组织和血液等生物样本，系统收集完整的人群基础信息和临床资料，并采用了高通量测序技术和qRT-PCR等方法进行检测。

研究方法主要包括以下几个部分：

一、研究对象选择和样本采集

(1)根据诊断标准：连续2次或2次以上的孕20周前或胎儿体重不足500g的妊娠丢失的孕妇为病例组；根据年龄、妊娠周数、BMI等指标，以频数匹配法选择生育能力正常、非医学原因选择流产的孕妇(无流产征兆及体征，无流产史，且至少有一个正常小孩出生)为对照组。

(2)B超显示无胚芽或无胎心搏动，且需排除因单基因遗传病、多基因遗传病、染色体异常以及基因突变等因素引发的流产。

(3)研究对象分组：

A组：非医学原因选择流产孕妇对照组(n＝63，3人测序筛选，30人一期验证，30人独立人群验证)；

B组：不明原因复发性流产孕妇(n＝63，3人测序筛选，30人一期验证，30人独立人群验证)。

(4)经知情同意，样本采集纳入此次研究孕妇的血液、蜕膜组织等生物样本。

注：BMI(即身体质量指数，Body Mass Index，简称BMI)，是体重公斤数与身高米数平方的比值，是目前国际上常用的衡量人体胖瘦程度以及是否健康的一项标准。

二、蜕膜组织RNA提取

(1)取50-100mg蜕膜组织于液氮中磨碎，加入1mL TRIzol，用匀浆超声仪进行匀浆处理，室温(15～30℃)放置放置5min，使核酸蛋白酶完全分离。

(2)每使用1mL TRIzol加入200μl氯仿，剧烈震荡30s，冰上放置15-30min。

(3)4℃12000rpm离心15min，样品分为3层：底层为红色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中。

(4)将水相转移至新的去RNA酶的1.5mL EP管中，用与水相等体积的异丙醇沉淀水相中的RNA，室温放置10min后，-20℃沉淀过夜。

(5)4℃，12000rpm离心15min，弃上清。

(6)用1mL新鲜的75℅乙醇洗涤RNA沉淀，4℃不超过7500g离心10min，弃上清，重复两次。

(7)室温干燥RNA沉淀至透明或半透明，加入200μlDEPC水，4℃放置2-3小时，使RNA充分溶解，用Nanodrop2000测定浓度。

(8)提取的RNA置于-70℃保存。

三、蜕膜组织转录组测序

选取3例不明原因复发性流产病例和3例非医学原因选择流产对照样本蜕膜组织，采用Illumina Hiseq 2500高通量测序平台完成转录本测序(双向配对末端测序)。依据RNA提取试剂说明书的步骤提取蜕膜组织总RNA。所提取的RNA样本经过严格质控后，采用去除rRNA，富集剩余mRNA，long noncoding RNA方法构建测序文库。对测序得到的原始数据(Fastq格式)进行接头过滤和污染序列过滤，滤除质量低和长度小于35bp的读长(read)。进而运用FastQC软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布、读长质量、GC含量、PCR重复含量等。进行质控后，利用TopHat软件将读长数据比对(mapping)到参考基因组(hg19版本)，去除无法mapping到基因组上的片段及重复片段,最终得到每个转录本的FPKM值。为了保证分析结果的准确性，选用两种方法(Cuffdiff和DESeq)做mRNA差异表达分析，取二者交集作为最终结果。差异mRNA筛选标准为：FoldChange>2或Fold Change<0.5，FDR<0.05。

四、血清分离及前处理

(1)5ml新鲜肝素抗凝血于离心机3000rpm离心5min，取上清分装至洁净1.5ml EP管中，每管100μl。

(2)向EP管中加入900μl TRIzol，充分震荡混匀后，4℃，12000rpm离心15min，立即取上清转移至洁净1.5ml EP管中。

(3)向EP管中加入1.5倍上清水相体积的无水乙醇，充分混匀后转移至离心柱，10000rpm 4℃离心15秒，弃下层废液。

(4)在离心柱上加入700μl RWT缓冲液(Qiagen miRNeasy Mini Kit，货号217004)，10000rpm 4℃离心15秒，弃下层废液。

(5)在离心柱上加入500μl RPE缓冲液(Qiagen miRNeasy Mini Kit，货号217004)，10000rpm 4℃离心15秒，弃下层废液。此步骤重复一遍。

(6)往离心柱加入一个新的2ml的管子，10000rpm 4℃离心1分钟，目的用于去除RPE缓冲液。

(7)将离心柱安装于一新的1.5ml的离心管中，同时在柱子上加入50μl DEPC处理的水，离心1分钟。

(8)-70℃保存处理后的样本。

五、实时定量PCR方法测量样品中mRNAs表达量

1、设计3条目标mRNAs的引物。

2、加入荧光染料进行qRT-PCR反应。检测并比较人工流产对照、复发性流产病例血清样本中mRNAs表达量的差异(病例和对照各60人)。

3、选择独立人群(对照和病例各60人)进行qRT-PCR检测，结果均与转录组测序结果一致。

因此，最终确认为存在差异表达的人工流产对照和自然流产病例血清mRNAs包括ZBP1(SEQ ID NO：1)、ARID5A(SEQ ID NO：2)、ALPL(SEQ ID NO：3)，具体引物见表1。其中ZBP1和ARID5A在病例血清中的表达量显著高于对照组，而ALPL在病例血清中的表达量显著低于对照组，同时这些mRNAs在血清中表达具有稳定性。采用SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3这3个构成的组合可以将对照组、病例组区分开。

六、诊断试剂盒制备方法

根据上述一系列实验结果，本发明人制备了一种能应用于复发性流产辅助诊断的试剂盒，所述试剂盒包含检测受试者血清中稳定存在且可检测的ZBP1、ARID5A、ALPL的引物和工具。诊断试剂盒包含血清mRNAs引物和一些常用的试剂。

本发明采用血清mRNA评价复发性流产发生风险的生物标志物的优越性在于：

(1)血清mRNA是新颖的生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，而且定量精确，将大大提高复发性流产诊断的敏感性和特异性。该类信使RNA生物标志物的成功开发，颠覆了以蛋白为主的传统生物标志物的检测方法，将为复发性流产的防治开创全新局面，同时为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。

(2)本发明提供的血清mRNA标志物可用于复发性流产辅助诊断标志物，通过微创方式对复发性流产进行早期辅助诊断，从而为临床医生进一步深入检查提供依据，达到快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度的效果。同时，为下一步及时采取更具个性化的防治方案提供支持，延缓和阻止疾病进展。

(3)本发明采用符合复发性流产病例和非医学原因选择流产对照人群的样本进行验证，证明所述几种mRNA标志物表达量存在显著性差异并具有一定的稳定性，以说明该标志物具有特异性，可作为复发性流产生物标志物应用。

(4)本发明采用严密、多阶段的验证和评价体系。第一阶段，通过预实验高通量测序筛选多种蜕膜组织差异mRNAs。第二阶段，应用qRT-PCR等方法对研究人群血清样本进行验证和独立人群验证，采用分层评分系统对诊断结果进行标化。第三阶段，在另一组独立人群中对血清mRNA标志物和诊断试剂盒进行盲法评价，保证了该血清mRNA生物标志物和诊断试剂盒的可靠性。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述。

图1为复发性流产蜕膜组织样本转录组测序mRNA表达差异程度的火山图。在Control组和Case组之间样本中的显著的基因分布(大于0的为上调的基因，小于0的为下调的基因)。

图2为Real-time PCR检测ZBP1、ARID5A、ALPL在复发性流产蜕膜组织样本中的表达示意图；*表示P<0.05。

图3为Real-time PCR检测ZBP1、ARID5A、ALPL在复发性流产血清样本中的表达示意图；*表示P<0.05。

图4为个体血清mRNA表达水平波动性分析。

图5为正常对照组和复发性流产病例组之间的ROC曲线。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。

以下结合具体实施方式对本发明做进一步说明。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为本领域常规方法，一般按照试剂商所建议的条件与步骤进行。

实施例1：蜕膜组织mRNA筛选

1材料

1.1研究对象选择和样本采集

(3)研究对象分组：

(4)经知情同意，样本采集纳入此次研究孕妇的血清和蜕膜组织。

1.2试剂

购自美国Invitrogen公司。反转录试剂盒(DRR037A)购自日本Takara公司。荧光实时(Real-time)定量PCR所用SYBR试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司。所有引物由上海英骏(Invitrogen)生物有限公司设计并合成。转录组测序和数据分析工作由上海天昊生物科技有限公司完成。

2方法

选取3例不明原因复发性流产病例和3例非医学原因选择流产对照样本蜕膜组织，采用Illumina Hiseq 2500高通量测序平台完成转录本RNA测序(双向配对末端测序)。依据RNA提取试剂说明书的步骤提取蜕膜组织总RNA。所提取的RNA样本经过严格质控后，采用去除rRNA，富集剩余mRNA方法构建测序文库。对测序得到的原始数据(Fastq格式)进行接头过滤和污染序列过滤，滤除质量低和长度小于35bp的读长(read)。进而运用FastQC软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布、读长质量、GC含量、PCR重复含量等。进行质控后，利用TopHat软件将读长数据比对(mapping)到参考基因组(hg19版本)，去除无法mapping到基因组上的片段及重复片段，最终得到每个转录本的FPKM值。为了保证分析结果的准确性，选用两种方法(Cuffdiff和DESeq)做mRNA差异表达分析，取二者交集作为最终结果。差异mRNA筛选标准为：Fold Change>2或Fold Change<0.5，FDR<0.05。

3结果

通过Cuffdiff和DESeq两种方法对差异mRNAs进行筛选，取两者的交集为最终结果。结合生物信息学分析，筛选出3条与复发性流产相关的候选mRNA并进行下一步验证，具体为：ZBP1、ARID5A、ALPL。

实施例2：检测ZBP1、ARID5A、ALPL在蜕膜组织中表达水平

1.材料

1.1引物设计

设计引物(表1)分别对63例不明原因复发性流产病例和63例非医学原因选择流产对照样本蜕膜组织进行各mRNAs的定量Real-time PCR检测。

1.2制备cDNA样品

a)取100mg蜕膜组织；b)加入900μl Trizol，振荡混匀，4℃，12000rpm离心15分钟，弃下层废液；c)加入上清1.5倍体积的无水乙醇震荡混匀，转至离心柱，12000rpm离心15秒，弃下层废液；d)在离心柱上加入700μl RWT缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层废液。e)在离心柱上加入500μl RPE缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层液。f)重复e。g)将离心柱加入一个新的2ml的管子，10000rpm离心1分钟，用于去除RPE缓冲液。h)在柱子上加入50μl DEPC处理水12000rpm离心收集RNA.i)然后通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括4μl 15×AMV缓冲液、2μl10mM dNTP混合液(Takara公司)、0.5μl RNA酶抑制剂(Takara公司)、1μl AMV(Takara公司)以及1.5μl单一mRNA对应的反向引物。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟；

2.方法

qRT-PCR：染料法：检测样品中mRNAs表达水平使用如下体系：

按下列条件进行qPCR反应：预变性(1循环)：95℃30s；循环反应(40循环)：95℃10s+60℃30s；溶解曲线(1循环)：95℃15s+60℃1min+95℃15s。检测并比较正常对照组和复发性流产病例组蜕膜组织中mRNA表达量的变化。分析引物的特异性及扩增效率，根据溶解曲线判断引物的反应的特异性。依据扩增曲线获得ct值，采用相对量法与内参GAPDH进行目的基因相对表达量的分析，可用方程2^–Δct计算mRNA相对表达量(Δct＝ctmRNA–ctGAPDH)。

3.结果

根据结果分析得出，ZBP1、ARID5A、ALPL这3条mRNA在两组之间均有显著差别(如图2)。提示上述mRNAs可能参与调控复发性流产的发生过程，具有应用于复发性流产辅助诊疗的潜在可能。

实施例3：qRT-PCR法检测ZBP1、ARID5A、ALPL在血清中表达水平

1材料

1.1研究对象选择和样本采集

本实施例的研究对象选择和样本采集同实施例1。

1.2试剂

qPCR所用试剂同实施例1。

2方法

2.1提取总RNA

以63例正常对照组和63例复发性流产病例组的血清样品为对象，取5ml新鲜肝素抗凝血于离心机3000rpm离心5min，取上清分装至洁净1.5ml EP管中，每管100μl。向EP管中加入900μl TRIzol，充分震荡混匀后，4℃，12000rpm离心15min，立即取上清转移至洁净1.5ml EP管中。向EP管中加入1.5倍上清水相体积的无水乙醇，充分混匀后转移至离心柱，10000rpm 4℃离心15秒，弃下层废液。在离心柱上加入700μl RWT缓冲液(Qiagen miRNeasyMini Kit，货号217004)，10000rpm 4℃离心15秒，弃下层废液。在离心柱上加入500μl RPE缓冲液(Qiagen miRNeasy Mini Kit，货号217004)，10000rpm 4℃离心15分钟，弃下层废液。此步骤重复一遍。往离心柱加入一个新的2ml的管子，10000rpm 4℃离心1分钟，目的用于去除RPE缓冲液。将离心柱安装于一新的1.5ml的离心管中，同时在柱子上加入50μl DEPC处理的水，离心1分钟。-70℃保存处理后的样本。

2.2逆转录合成cDNA

取经前处理的血清RNA，通过PrimeScript^TM RT reagent Kit(Perfect RealTime)(TaKaRa RR036A)试剂盒，逆转录反应得到cDNA样品。逆转录反应时间设置：37℃孵育15分钟，85℃孵育5秒钟，即可获得cDNA。该cDNA可用于后续mRNAs Real-time PCR检测。

按下表所示配制反转录体系：

2.3引物设计

所有引物由上海英骏(Invitrogen)生物有限公司设计并合成。具体引物序列如表1示.

2.4实时定量PCR

检测样品中mRNAs表达水平使用如下体系：

按下列条件进行qPCR反应：预变性(1循环)：95℃30s；循环反应(40循环)：95℃10s+60℃30s；溶解曲线(1循环)：95℃15s+60℃1min+95℃15s。检测并比较正常对照组和复发性流产病例组血清中mRNA表达量的变化。分析引物的特异性及扩增效率，根据溶解曲线判断引物的反应的特异性。各组样本mRNA的表达量比值可用方程2^–△G表示，其中△G＝CT_group1–CT_group2。为保证各次实验间的可比性，我们在每板上都设置了GAPDH量作为内参调整计算表达量

3结果

根据结果分析得出，ZBP1、ARID5A、ALPL这3条mRNA在两组之间均有显著差别(如图3)，并且与蜕膜组织中表达趋势水平一致，进一步验证了上述mRNAs应用于复发性流产辅助诊疗的可能性。

实施例4：个体血清mRNA表达量的稳定性分析

1材料

1.1研究对象选择和样本采集

本实施例的研究对象选择和样本采集同实施例1。从中选取6名(3名对照组和3名复发性流产病例组)成人，连续三次采集研究对象血清(间隔时间为1周，间隔期内无疾病)作为样本。

1.2试剂

qPCR所用试剂同实施例1。

2方法

采用实施例3的方法对6名(3名对照组和3名复发性流产病例组)成人血清mRNA水平的稳定性进行评价。

3结果

血清中ZBP1、ARID5A、ALPL这3条mRNA表达水平较稳定(如图4)。这些都提示了上述个体血清mRNA的表达量较为稳定，具备作为诊断标志物的特性。

实施例5：mRNA组合对复发性流产的判断

当对ZBP1、ARID5A、ALPL这三个标志物的表达水平进行分层评分时(五分位数分层后累加)，能够对是否会发生复发性流产进行评估，表述为积分越高，确认为复发性流产的风险越高。

表3三个mRNAs五分位数得分并求和

注：每个mRNA按表达量的五分位数分为五个等级0、1、2、3、4，最低的0分，最高的4分，3条mRNA综合可以得分为0～12分，而正常对照组绝大多数得分很低(表达量低，积分按反向计算)，而复发性流产绝大多数得分很高。举例来说，如有一个样本评分为12分(最高的分值组)，则其应为复发性流产。

针对得出的评估分值(即根据具体得分判断其分组，得高分的归入复发性流产组，得低分的归入对照组；比较而言，≥9算高分，≤3算低分)，对另一组独立采集的人群进行盲法首诊，即采用双盲试验，对独立人群(另一医院采集的40例孕妇)同时进行常规诊断分析和血清样品的mRNA检测，结果显示通过3个mRNA检测评分，可以将复发性流产患者及正常对照很好的区分开(40例随机选择样本中有10例评分较高(≥9分)，其中达到12分(最高分)的有3例，这3例经诊断均为复发性流产患者，其余评分较低(≤3分)的均为正常对照)，提示这几种mRNA可作为评估复发性流产的标志物。

实施例6：用于复发性流产监测和风险评估的mRNA诊断试剂盒的制作

本发明的该mRNA试剂盒的制作工艺和操作流程主要基于上述qRT-PCR技术。首先通过转录组测序的方法筛选出对照组和复发性流产病例组具有差异的mRNA，并用qRT-PCR方法验证两组中差异的候选mRNA。结合生物信息学，最后筛选出对应的血清mRNA的数量控制在3条，以此作为复发性流产监测和风险评估的指标，这是在预实验的基础上做出的最优化的精简。

此试剂盒包括一批血清mRNA引物，其中mRNA的引物包括ZBP1、ARID5A、ALPL、GAPDH的正反向引物(见表1)。还可以有相关PCR技术常用的试剂，如Taq酶、PCR缓冲液、MgCl₂、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液、染料等试剂，这些试剂也可采用相应的市售产品。本发明试剂盒的价值在于只需要一次提供少量血液(2ml)，即可检测血清mRNA生物标志物的变化趋势，再通过该变化趋势来预测复发性流产发生的可能性，并易于进行动态监测。

具体试剂盒组成如下：

试剂盒含有以下三对引物：SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.7，SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9，各10μM 0.25μl。

试剂盒中还可以含有0.3μl Taq酶，1μl 20×EVA GREEN，1.2μl 25mM MgCl₂，1.6μl2.5mMdNTP混合液，2μl 10×PCR缓冲液，12.4μl纯水。

试剂盒中还可以含有内参GAPDH的正反向引物一对(表1)。

或者试剂盒中除正向引物外还含有1μl10μM通用反向引物，10μlTaqMan通用PCR混合液，6.6μl H₂O。

试剂盒中的组分除引物外的试剂可以采用现有技术中用于mRNA含量检测的相应试剂。

表1 mRNAs的引物序列

上述实验结果表明，ZBP1和ARID5A在病例血清中的表达量显著高于对照组，而ALPL在病例血清中的表达量显著低于对照组，同时这些mRNAs在血清中表达具有稳定性。采用SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3这3个mRNA构成的组合可以将对照组、病例组区分开。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

序列表

<110> 南京医科大学

<120> 用于诊断复发性流产的血清信使核糖核酸生物标志物、引物组及应用和试剂盒

<130> N180055-NO0302G

<141> 2018-03-13

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2327

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

tttttttttc tttcaaaaga cgaacagaga agtttcattt tctttttctc ctgaaaccga 60

atctggccgg cctggctagg catctatttc cgggctgtaa gcagctgaca cctgcccagt 120

ggaagctggc atccctcccc ttgtgggttc agagctgcaa gaagcaccag gctcggccac 180

ttcagaagcc ccagcctcga cctagcccac cctctcaggg ccacagtgca gaagcctgca 240

cacctgccaa gtctctccga ctccttgcag ctgctgtcag catggcccag gctcctgctg 300

acccgggcag agaaggccac cttgaacaaa gaatcctgca ggtgctgaca gaggctggct 360

ccccggtgaa acttgcccag ctggtgaagg aatgccaagc acccaagagg gagctcaacc 420

aagtcctcta ccgaatgaaa aaggagttga aagtctccct cacatcccct gccacctggt 480

gcttgggcgg gactgatcct gaaggcgagg gtcctgcaga gctggccttg tccagccctg 540

ccgagaggcc ccagcaacat gcagctacaa ttccagagac ccctggccct cagttcagcc 600

aacaacggga ggaagacatc tacaggtttc tcaaagacaa tggtccccag agggccctgg 660

tcatcgccca agcactggga atgaggacag caaaagatgt gaaccgagac ttgtacagga 720

tgaagagcag gcaccttctg gacatggatg agcagtccaa agcatggacg atttaccgcc 780

cagaagattc tggaagaaga gcaaagtcag cctcaattat ttaccagcac aatccaatca 840

acatgatctg ccagaatgga cccaacagct ggatttccat tgcaaactcc gaagccatcc 900

agattggaca cgggaacatc attacaagac agacagtctc cagggaggac ggttccgccg 960

gtccacgcca cctcccttca atggcaccag gtgattcctc aacttggggg accctagttg 1020

atccctgggg gccccaggac atccacatgg agcagtccat actgagacgg gtgcagctgg 1080

gacacagcaa tgagatgagg ctccacggcg tcccgtccga gggccctgcc cacatccccc 1140

ctggcagccc cccagtctct gccactgctg ccggcccaga agcttcgttt gaagcaagaa 1200

ttcccagtcc aggaactcac cctgaggggg aagccgccca gagaatccac atgaaatcgt 1260

gctttctcga ggacgccacc atcggcaaca gcaacaaaat gtctatcagc ccaggggtgg 1320

ctggcccagg aggagtcgca gggtctggag agggggagcc aggggaggac gcaggtcgtc 1380

gtcccgcaga cacacaatcc agaagtcact ttcctcgaga cattggtcag cccatcactc 1440

ccagccactc gaagctcacc cccaagctgg aaactatgac tcttggaaac aggagtcaca 1500

aagctgcaga aggcagccac tatgtggatg aagcctcaca cgaggggagc tggtggggag 1560

gtgggattta gtgcacagcc tcacgtgggg cttggacaca ggctgggggt gggcgcatgc 1620

tagggagact agcctgctgc tctctgcatt ccttagcgtc ttgtttgacc tgcttgcttc 1680

cagacataac ctgcatgaat cagttttggg ggaatggacc tggcatgggg atgggttcag 1740

gccaggtctt ttgatggcca ggagtagatg acagggagtt gccttgggga acctttggtg 1800

tgccaagagg aggtgggtag atgggagtgg ggctcggtcc cccaggccca ggggactctc 1860

tccactcttt cctgggctcg gggcatctgc ctggagttac cttccatcat ggctacctgc 1920

tgtggtttga atgtttgagt cccaacaaaa ttcatatcaa aacataatcc caactgggtg 1980

cagtggctca cgcctgtaat cccagcactt tgggaggccg aggcgggcgg atcaataggt 2040

caggaaatcc agaccgtcct ggctaacatg gtgaaacccc gtctctacta aaaaaaaaaa 2100

tacaaaaaat tagccgggcg ttgtggcggg cacctggagt cccagctact ccggaggctg 2160

agggaggaga atggtgtgaa cccgggaggt ggagcttcca gtgagccgag atcgcgccac 2220

tgcactccag gctgggcgac agagcgagac tccgtctcaa aaaaataaat acataaataa 2280

aaaataaacc aaccataaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 2327

<210> 2

<211> 2229

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

ggaggtggcc ggcgggccgc gccgcgagcc agtatctcag agagcgcggg gtccggacag 60

ccgcgcgctg agggtctcgg ggcgggcgcc gcgggacctc tccgggccat ggcagcccct 120

gtcaaaggga acaggaagca gtccacggag ggtgacgccc tagacccacc tgcatccccc 180

aaacctgctg gcaagcagaa cggaatccag aaccccatct cgctggagga ctcccccgag 240

gcaggcgggg agcgggagga ggagcaggag cgggaggagg agcaggcctt cctggtcagc 300

ctctacaagt tcatgaagga gcgacacacg cccatcgaga gggtgcccca tctcggcttc 360

aagcagatta acctgtggaa gatctacaaa gcagtggaga agctgggggc ctatgagctg 420

gtgaccgggc gccgcctctg gaagaacgtg tacgacgagc tggggggcag cccaggcagc 480

accagcgcgg ccacgtgcac gcgccgccac tacgagaggc tggtcctgcc atacgtgcgg 540

cacctgaagg gggaggatga caagccgctg cccacctcca agcccaggaa acagtacaag 600

atggctaagg agaacagggg ggatgatggg gccaccgaga ggccgaagaa ggccaaggag 660

gagcggcgca tggaccagat gatgccagga aagaccaaag cagatgctgc tgacccagca 720

ccacttccca gccaggagcc ccccaggaac agcacagaac agcagggcct ggcctctggg 780

tcttctgtgt cctttgtggg tgccagcggc tgtcctgagg cctacaagcg gctcctatcc 840

agcttctact gcaaggggac acacggcatc atgtcaccac tggccaaaaa gaagctcctg 900

gcccaggtga gcaaggtgga ggccttgcag tgccaggagg agggctgccg ccatggggca 960

gagccccagg cgtccccagc tgttcacctc ccagagagtc cccagagccc caaagggctg 1020

actgagaact ccaggcaccg gctgacccct caggagggat tgcaggcccc aggtggcagc 1080

ctcagagagg aggcgcaggc aggcccctgc ccggcagccc ccatcttcaa gggctgcttc 1140

tacacccacc ccaccgaggt gctgaagcct gtcagccagc accccaggga cttcttctct 1200

agacttaaag atggggtgct attggggcct cctggcaaag aggggctgtc agtgaaagag 1260

ccccagctgg tgtggggcgg agacgctaac cgcccttctg cgttccataa aggtggctcc 1320

agaaagggca tcctctaccc caagcccaaa gcctgctggg tgtcccccat ggccaaggtc 1380

ccagccgaga gccccacgct cccgcccacc ttccccagta gcccaggcct gggcagcaag 1440

cgcagcctgg aggaagaggg tgctgcccac agtgggaaga gactgcgggc cgtgtctccc 1500

tttcttaagg aggcggatgc caagaagtgt ggggccaaac ctgcagggtc cggcctggtc 1560

tcctgccttc tgggcccagc cctggggcct gtgcccccag aggcctacag gggcaccatg 1620

ctgcactgcc cgctgaactt cactggcacc ccgggcccct tgaagggcca ggctgcactc 1680

cccttcagcc ccctggtcat cccggccttc ccggcccact tcctggccac cgcaggcccc 1740

tcgcccatgg ccgctggcct gatgcacttc cccccaacgt ccttcgacag tgccctccgc 1800

cacagacttt gcccggcctc atctgcctgg cacgcaccac cagtcacaac ctatgcagcg 1860

ccccacttct tccacctcaa caccaagctg taggccagcc catggtgttg tgtacactgt 1920

ggagtcgaca ggggcctaca acaggcaggt actgctgcca gggggctctg aactagtgcc 1980

tgctacccag gacacccggg ccatgcccct ggctgggcag cctggcacaa gtgaagaaga 2040

aggcagtggg aaaactgggt ttatctcaag gcagcagcct gagcccagga gcagaggacc 2100

cagttgttat aaggcgctgg gagaggatgg gcagctccca ctgccccaga gcggagctcg 2160

aagcacccag gttgcccacg gaaaatccaa taaaaagaca ccagtgtgaa tccacgtaaa 2220

aaaaaaaaa 2229

<210> 3

<211> 2331

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

gggctgcccg ggcctcactc gggccccgcg gccgccttta taaggcggcg ggggtggtgg 60

cccgggccgc gttgcgctcc cgccactccg cgcccgctat cctggctccg tgctcccacc 120

gcttgtgcct ggacggaccc tcgccagtgc tctgcgcaga gaaagagaaa gaccccaagt 180

actggcgaga ccaagcgcaa gagacactga aatatgccct ggagcttcag aagctcaaca 240

ccaacgtggc taagaatgtc atcatgttcc tgggagatga cgtacaacac caatgcccag 300

gtccctgaca gcgccggcac cgccaccgcc tacctgtgtg gggtgaaggc caatgagggc 360

accgtggggg taagcgcagc cactgagcgt tcccggtgca acaccaccca ggggaacgag 420

gtcacctcca tcctgcgctg ggccaaggac gctgggaaat ctgtgggcat tgtgaccacc 480

acgagagtga accatgccac ccccagcgcc gcctacgccc actcggctga ccgggactgg 540

tactcagaca acgagatgcc ccctgaggcc ttgagccagg gctgtaagga catcgcctac 600

cagctcatgc ataacatcag ggacattgac gtgatcatgg ggggtggccg gaaatacatg 660

taccccaaga ataaaactga tgtggagtat gagagtgacg agaaagccag gggcacgagg 720

ctggacggcc tggacctcgt tgacacctgg aagagcttca aaccgagata caagcactcc 780

cacttcatct ggaaccgcac ggaactcctg acccttgacc cccacaatgt ggactaccta 840

ttgggtctct tcgagccagg ggacatgcag tacgagctga acaggaacaa cgtgacggac 900

ccgtcactct ccgagatggt ggtggtggcc atccagatcc tgcggaagaa ccccaaaggc 960

ttcttcttgc tggtggaagg aggcagaatt gaccacgggc accatgaagg aaaagccaag 1020

caggccctgc atgaggcggt ggagatggac cgggccatcg ggcaggcagg cagcttgacc 1080

tcctcggaag acactctgac cgtggtcact gcggaccatt cccacgtctt cacatttggt 1140

ggatacaccc cccgtggcaa ctctatcttt ggtctggccc ccatgctgag tgacacagac 1200

aagaagccct tcactgccat cctgtatggc aatgggcctg gctacaaggt ggtgggcggt 1260

gaacgagaga atgtctccat ggtggactat gctcacaaca actaccaggc gcagtctgct 1320

gtgcccctgc gccacgagac ccacggcggg gaggacgtgg ccgtcttctc caagggcccc 1380

atggcgcacc tgctgcacgg cgtccacgag cagaactacg tcccccacgt gatggcgtat 1440

gcagcctgca tcggggccaa cctcggccac tgtgctcctg ccagctcggc aggcagcctt 1500

gctgcaggcc ccctgctgct cgcgctggcc ctctaccccc tgagcgtcct gttctgaggg 1560

cccagggccc gggcacccac aagcccgtga cagatgccaa cttcccacac ggcagccccc 1620

ccctcaaggg gcagggaggt gggggcctcc tcagcctctg caactgcaag aaaggggacc 1680

caagaaacca aagtctgccg cccacctcgc tcccctctgg aatcttcccc aagggccaaa 1740

cccacttctg gcctccagcc tttgctccct ccccgctgcc ctttggccaa cagggtagat 1800

ttctcttggg caggcagaga gtacagactg cagacattct caaagcctct tatttttcta 1860

gcgaacgtat ttctccagac ccagaggccc tgaagcctcc gtggaacatt ctggatctga 1920

ccctcccagt ctcatctcct gaccctccca ctcccatctc cttacctctg gaacccccca 1980

ggccctacaa tgctcatgtc cctgtcccca ggcccagccc tccttcaggg gagttgaggt 2040

ctttctcctc aggacaaggc cttgctcact cactcactcc aagaccacca gggtcccagg 2100

aagccggtgc ctgggtggcc atcctaccca gcgtggccca ggccgggaag agccacctgg 2160

cagggctcac actcctgggc tctgaacaca cacgccagct cctctctgaa gcgactctcc 2220

tgtttggaac ggcaaaaaaa aatttttttt tctctttttg gtggtggtta aaagggaaca 2280

caaaacattt aaataaaact ttccaaatat ttccgaggac aaaaaaaaaa a 2331

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

cgtcttgttt gacctgcttg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ctcttggcac accaaaggtt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

agctgttcac ctcccagaga 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

tgacaggctt cagcacctc 19

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

tacaagcact cccacttcat ctg 23

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

gctcgaagag acccaatagg tagt 24

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

gcaccgtcaa ggctgagaac 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

ggatctcgct cctggaagat g 21

Claims

1.一组用于诊断复发性流产的血清信使核糖核酸生物标志物，其特征在于，所述血清信使核糖核酸生物标志物包括：与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有90％以上同源性的第一mRNA、与SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有90％以上同源性的第二mRNA和与SEQ ID NO：3所示核苷酸序列具有90％以上同源性的第三mRNA中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的血清信使核糖核酸生物标志物，其中，所述血清信使核糖核酸生物标志物包括：与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有95％以上同源性的第一mRNA、与SEQID NO：2所示核苷酸序列具有95％以上同源性的第二mRNA和与SEQ ID NO：3所示核苷酸序列具有95％以上同源性的第三mRNA中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的血清信使核糖核酸生物标志物，其中，所述血清信使核糖核酸生物标志物包括：具有如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的第一mRNA、具有如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的第二mRNA和具有如SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的第三mRNA中的至少一种。

4.用于检测权利要求1-3中任意一项所述的血清信使核糖核酸生物标志物的引物组，其特征在于，所述引物组包括以下三组中至少一组的引物：

用于检测第一mRNA的上游引物和下游引物；

用于检测第二mRNA的上游引物和下游引物；

用于检测第三mRNA的上游引物和下游引物。

5.根据权利要求4所述的引物组，其中，

用于检测第一mRNA的上游引物具有SEQ ID NO：4所示核苷酸序列，下游引物具有SEQID NO：5所示核苷酸序列；

用于检测第二mRNA的上游引物具有SEQ ID NO：6所示核苷酸序列，下游引物具有SEQID NO：7所示核苷酸序列；

用于检测第三mRNA的上游引物具有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列，下游引物具有SEQID NO：9所示核苷酸序列。

6.权利要求1-3中任意一项所述的血清信使核糖核酸生物标志物和/或权利要求4或5所述的引物组在制备复发性流产诊断或监测试剂中的应用。

7.一种复发性流产诊断或监测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求4或5所述的引物组。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括：

(1)内参GAPDH的正反向引物；和/或