CN108486200A - 酰化改性酪蛋白多肽、纳米乳液、其制备方法及应用 - Google Patents

酰化改性酪蛋白多肽、纳米乳液、其制备方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108486200A
CN108486200A CN201810296442.3A CN201810296442A CN108486200A CN 108486200 A CN108486200 A CN 108486200A CN 201810296442 A CN201810296442 A CN 201810296442A CN 108486200 A CN108486200 A CN 108486200A
Authority
CN
China
Prior art keywords
casein polypeptide
casein
polypeptide
nanoemulsions
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810296442.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108486200B (zh
Inventor
章宝
潘怡
陈寒青
李小敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hefei University of Technology
Original Assignee
Hefei University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hefei University of Technology filed Critical Hefei University of Technology
Priority to CN201810296442.3A priority Critical patent/CN108486200B/zh
Publication of CN108486200A publication Critical patent/CN108486200A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108486200B publication Critical patent/CN108486200B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了一种酰化改性酪蛋白多肽、纳米乳液、其制备方法及应用。所述酰化改性酪蛋白多肽的制备方法包括：以马来酸酐对酪蛋白多肽进行酰化改性，在酪蛋白多肽中引入羧基，获得酰化改性酪蛋白多肽。采用高压均质和微射流技术，使所述酰化改性酪蛋白多肽的水相溶液与乳化油相组分均匀混合，获得水包油型的pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液。本发明制备的pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液具有纳米级粒径，其小液滴尺寸具有允许高效递送特性，可提高疏水性生物活性物质吸收效率，同时具备较好pH响应性、抗氧化活性、抗菌性、较好的乳化性及乳化稳定性等优点，在营养物质的递送、药物的控释、生物活性物质的稳定等领域具有广泛用途。

Description

酰化改性酪蛋白多肽、纳米乳液、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液的制备方法，尤其涉及一种马来酸酐酰化改性酪蛋白多肽及其制备方法，以及基于该酰化改性酪蛋白多肽制备的pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液及其应用，属于蛋白深加工技术领域。
背景技术
纳米乳液是一种胶体分散体系，是非热力学稳定体系，呈透明或半透明状，粒度尺寸在50-200nm之间，具有抗沉降和乳析的动力学稳定特性。水包油型纳米乳液作为水不溶性生物活性物质的载体，应具有良好的乳化性及乳化稳定性，以及高效的递送作用，因此乳化剂的选择和应用受到越来越多人的重视。
酪蛋白作为乳化剂具有高的生物相容性、生物降解性、生物安全性等特性。经超声辅助酶法适度水解制得的酪蛋白肽，使其功能基团更好地暴露出来，改善其的乳化特性。酪蛋白肽再经马来酸酐酰化改性，引入羧基，与原蛋白相比，溶解性、抗氧化活性、乳化性及乳化稳定性得到一定程度的提高，同时等电点降低，在作为递送载体时，赋予其pH响应性。因此，将其作为乳化剂制备纳米乳液作为生物活性物质载体，有一定的研究意义。
因此如何制备稳定有效的稳定剂以用于制备水包油型纳米乳液成为研究的热点课题，也是目前业界研发人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种酰化改性酪蛋白多肽及其制备方法，以克服现有技术的不足。
本发明的另一主要目的在于提供基于前述酰化改性酪蛋白多肽制备的pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液及其制备方法。
本发明的另一主要目的在于提供前述pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液的应用。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种酰化改性酪蛋白多肽的制备方法，其包括：
提供酪蛋白多肽；
以马来酸酐对酪蛋白多肽进行酰化改性，在酪蛋白多肽中引入羧基，获得酰化改性酪蛋白多肽，其中，所述酰化改性的反应液pH值为8～10，温度为40～60℃，时间为3～3.5h。
在一些实施例中，所述马来酸酐与酪蛋白多肽的质量比为1：5～3：5。
在一些实施例中，所述制备方法包括：将所述马来酸酐分批加入反应体系中，对所述酪蛋白多肽进行酰化改性。
进一步地，所述酰化改性酪蛋白多肽的酰化度为50～80％。
进一步地，所述制备方法包括：在pH值为6.8～7.5的条件下，采用超声辅助处理，使酪蛋白和胰蛋白酶于40～60℃进行酶水解反应90～120min，获得酪蛋白多肽。
进一步地，所述酪蛋白多肽的水解度为10～20％。
本发明实施例还提供了由前述方法制备的酰化改性酪蛋白多肽。
本发明实施例还提供了一种pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液的制备方法，其包括：
按照前述方法制备酰化改性酪蛋白多肽；
采用高压均质和微射流技术，使所述酰化改性酪蛋白多肽的水相溶液与乳化油相组分均匀混合，获得水包油型的pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液。
在一些实施例中，所述制备方法具体包括：采用高压均质技术，对所述乳化油相组分和水相溶液的混合液于15℃以下进行剪切2～5min，形成粗乳液，之后采用高压微射流技术，在100～120MPa下将所述粗乳液进一步进行均化处理，获得pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液，之后于2～6℃下储存。
进一步地，所述制备方法包括：使疏水性生物活性物质溶于油相溶剂中，并避光50～60℃搅拌10～12min，之后于20～25℃下搅拌1～1.5小时，制得所述乳化油相组分。
进一步地，所述制备方法包括：将所述酰化改性酪蛋白多肽溶于磷酸盐缓冲液中，并搅拌3h以上，形成所述的水相溶液。
本发明实施例还提供了由前述方法制备的pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液。
进一步地，所述pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液的形态结构为球形，粒径分布为80～200nm。
进一步地，所述pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液具备pH响应性，且在pH值为2.5～3.9的条件下性质稳定。
本发明实施例还提供了前述的pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液于营养物质的递送、药物的控释、生物活性物质的稳定领域中的用途。
与现有技术相比，本发明的优点包括：
本发明以乳化稳定性较好的酪蛋白多肽、马来酸酐为原料，制备用马来酸酐酰化改性的酪蛋白多肽，在酪蛋白多肽中引入羧基，降低其等电点，具有pH响应性、较好的乳化性及乳化稳定性，并将其作为乳化剂，通过高压均质和高压微射流技术，制备马来酸酐酰化改性的酪蛋白多肽稳定的水包油型纳米乳液及载体系统；同时，本发明制备的水包油型纳米乳液具有纳米级粒径，具有抗沉降和乳析的动力学稳定特性，其小液滴尺寸具有允许高效递送特性，易转运吸收，可提高疏水性生物活性物质吸收效率，具备较好pH响应性、抗氧化活性、抗菌性、较好的乳化性及乳化稳定性等优点，在pH值为2.5～3.9条件下较为稳定，作为递送载体在胃肠道环境中可保持相对稳定，其良好的生物包埋性和活性物质高效递送作用，在营养物质的递送、药物的控释、生物活性物质的稳定等领域具有广泛用途。
具体实施方式
鉴于现有技术存在的技术问题，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
本发明主要是以酪蛋白为原料，经超声辅助酶水解成酪蛋白多肽，再与马来酸酐进行酰化反应，采用高压均质和微射流的方法，制备酰化改性的酪蛋白多肽水包油型的pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液。
本发明实施例的一个方面提供的一种酰化改性酪蛋白多肽的制备方法，其包括：
提供酪蛋白多肽；
以马来酸酐对酪蛋白多肽进行酰化改性，在酪蛋白多肽中引入羧基，获得酰化改性酪蛋白多肽，其中，所述酰化改性的反应液pH值为8～10，温度为40～60℃，时间为3～3.5h。
在一些实施例中，所述马来酸酐与酪蛋白多肽的质量比为1：5～3：5。
在一些实施例中，所述制备方法包括：将所述马来酸酐分批加入反应体系中，对所述酪蛋白多肽进行酰化改性。
进一步地，所述酰化改性酪蛋白多肽的酰化度为50～80％。
在一些更为优选的实施案例之中，所述制备方法具体包括：
利用马来酸酐对酪蛋白多肽进行改性，在酪蛋白肽中引入羧基，降低其等电点，提高其乳化性，得到酰化度为50～80％的酰化改性酪蛋白多肽。
进一步地，所述制备方法包括：在pH值为6.8～7.5的条件下，采用超声辅助处理，使酪蛋白和胰蛋白酶于40～60℃进行酶水解反应90～120min，获得酪蛋白多肽。
进一步地，利用超声辅助胰蛋白酶对酪蛋白进行限制水解处理，控制酶解时间和反应过程的pH，得到水解度为10％～20％的酪蛋白多肽。
进一步地，所述酪蛋白包括酪蛋白含量为5～15wt％的酪蛋白水溶液。
进一步地，所述胰蛋白酶的添加量为50～60U/g。
进一步地，所述超声辅助处理采用的温度为60～70℃，功率为450～500W，时间为40～60min。
进一步地，所述制备方法还包括：在所述酶水解反应完成后，向所述酶水解反应的反应液中加入抑制剂灭活胰蛋白酶终止反应。
进一步地，所述酪蛋白多肽具有裸露的氨基酸侧链氨基。
在一些更为优选的实施案例之中，所述酪蛋白多肽的制备方法具体可包括：
将酪蛋白(10％水溶液)用50U/g的添加量的胰蛋白酶在50℃水浴中进行反应，调节pH至7.0，利用超声辅助(温度64℃，功率460W，时间60min)对蛋白进行限制性水解，在水解过程中检测pH变化并用1mol/L的NaOH调节，反应2h后加入抑制剂灭活胰蛋白酶终止反应。得到水解度为10～20％的酪蛋白多肽。
其中，水解度为10～20％酪蛋白多肽中功能基团暴露，具有更好的溶解度、乳化性及乳化稳定性。
本发明实施例的另一个方面还提供了由前述方法制备的酰化改性酪蛋白多肽。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液的制备方法，其包括：
按照前述方法制备酰化改性酪蛋白多肽；
采用高压均质和微射流技术，使所述酰化改性酪蛋白多肽的水相溶液与乳化油相组分均匀混合，获得水包油型的pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液。
在一些实施例中，所述制备方法具体包括：采用高压均质技术，对所述乳化油相组分和水相溶液的混合液于15℃以下进行剪切2～5min，形成粗乳液，之后采用高压微射流技术，在100～120MPa下将所述粗乳液进一步进行均化处理，获得pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液，之后于2～6℃下储存。
进一步地，所述乳化油相组分与水相溶液的质量比为1：8～10。
在一些更为优选的实施案例之中，所述pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液的制备方法具体可包括：
所述乳化油相组分与水相溶液按1：9的质量比通过高压剪切机剪切2min形成粗乳液，而后通过高压微射流仪在103.4MPa下将粗乳液进一步均质数次得到粒径为80～200nm的纳米乳液，均质化期间使用碎冰保持温度低于15℃，样品储存于2～6℃条件下。
进一步地，所述制备方法包括：使疏水性生物活性物质溶于油相溶剂中，并避光50～60℃磁力低速搅拌10～12min，之后于20～25℃下搅拌1～1.5小时以确保完全溶解，制得所述乳化油相组分。
进一步地，所述油相溶剂包括玉米油，但不限于此。
进一步地，所述制备方法包括：将所述酰化改性酪蛋白多肽(2.0％，w/w)溶于磷酸盐缓冲液(pH7.0，10mmol/L)中，并磁力搅拌3h以上，充分搅拌，使多肽充分溶解，形成所述的水相溶液。
其中，作为本发明的一更为优选的实施案例之一，所述制备具体还可以包括以下步骤：
1、酪蛋白多肽的制备：将酪蛋白(10％水溶液)用50U/g的添加量的胰蛋白酶在50℃水浴中进行反应，调节pH至7.0，利用超声辅助(温度64℃，功率460W，时间60min)对蛋白进行限制性水解，在水解过程中检测pH变化并用1mol/L的NaOH调节，反应2h后加入抑制剂灭活胰蛋白酶终止反应，得到水解度为10％～20％的酪蛋白多肽。
2、酰化改性酪蛋白多肽的制备：利用分批滴加马来酸酐水溶液对酪蛋白多肽进行酰化改性，得到酰化度为50％～80％的酰化改性酪蛋白多肽。
3、配制乳化油相组分：将疏水性生物活性物质溶于玉米油等油相溶剂中，避光60℃磁力低速搅拌10min，随后在室温下搅拌1小时以确保完全溶解，制成乳化油相组分。
4、配制水相溶液：将酰化改性酪蛋白多肽(2.0％，w/w)溶于磷酸盐缓冲液(pH7.0，10mmol/L)中，磁力搅拌3h以上，充分搅拌，使多肽充分溶胀，形成水相溶液。
5、水包油型纳米乳液的制备：乳化油相组分与水相溶液按1：9的重量比通过高压剪切机剪切2min形成粗乳液，而后通过高压微射流仪在103.4MPa下将粗乳液进一步均质数次得到粒径为80～200nm的纳米乳液，均质化期间使用碎冰保持温度低于15℃，样品储存于2～6℃条件下。
本发明实施例的另一个方面还提供了由前述方法制备的pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液。
进一步地，所述pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液的形态结构为球形，粒径分布为80-200nm。所得纳米乳液具有抗沉降和乳析的动力学稳定特性，同时具备较好抗氧化活性、抗菌性、乳化性及乳化稳定性，良好的生物包埋性和活性物质高效递送作用。
本发明在马来酸酐酰化在酪蛋白多肽中引入羧基，酰化度为50％～80％，降低其等电点，提高其乳化性，使之成为pH响应型乳化剂，乳液在pH值为2.5～3.9的储存条件下较为稳定，当pH高于4.5，乳液内包埋的活性物质开始释放。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液于营养物质的递送、药物的控释、生物活性物质的稳定领域中的用途。
本发明所得纳米乳液具备pH响应性，在pH值为2.5～3.9条件下较为稳定，作为递送载体在胃肠道环境中可保持相对稳定。避光常温储藏30天后粒径增加50～80nm，具有较好乳化性及乳化稳定性，同时具有良好的生物包埋性和活性物质靶向递送、缓释作用。
本发明制备pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液的机理可能在于：本发明以乳化稳定性较好的酪蛋白多肽、马来酸酐为原料，制得酰化改性酪蛋白多肽作为乳化剂，通过高压均质和高压微射流技术，制备酰化改性酪蛋白多肽、稳定的水包油型纳米乳液及载体系统，酪蛋白通过马来酸酐改性后，酪蛋白多肽溶解度增加，乳化性及乳化稳定性增强，抗氧化性能提高，抗菌能力有一定程度的改善。
本发明制备的水包油型纳米乳液具有纳米级粒径，具有抗沉降和乳析的动力学稳定特性，其小液滴尺寸具有允许高效递送特性，易转运吸收，可提高疏水性生物活性物质吸收效率，具备较好pH响应性、抗氧化活性、抗菌性、较好的乳化性及乳化稳定性等优点，在pH值为2.5～3.9条件下较为稳定，作为递送载体在胃肠道环境中可保持相对稳定，其良好的生物包埋性和活性物质高效递送作用，在营养物质的递送、药物的控释、生物活性物质的稳定等领域具有广泛用途。
以下通过若干实施例并进一步详细说明本发明的技术方案。然而，所选的实施例仅用于说明本发明，而不限制本发明的范围。
实施例1
称取10g酪蛋白，用磷酸缓冲液溶解，调节pH至7.5，底物浓度为5％，在试管中以50U/g的添加量加入胰蛋白酶(13000-20000个BAEE单位mg-1蛋白)，置于55℃水浴中进行酶解反应，同时采用超声波辅助(温度64℃，功率460W，时间50min)水解反应，在水解过程中检测pH变化并用1mol/L的NaOH调节，反应时间为2h。反应结束后，添加胰蛋白酶抑制剂灭活胰蛋白酶，得到水解度为10％的酪蛋白多肽，将其冻干保存。称取一定量的酪蛋白多肽分散于蒸馏水中，用1mol/L的NaOH溶液调pH至10，转移至装有温度计、搅拌器、恒压滴液漏斗的三口烧瓶中，于50℃下孵化30min。马来酸酐的添加量为酪蛋白质量的20％，添加方式采用分批滴加。先称取一半质量的马来酸酐将其配制成水溶液(以减少马来酸酐水解作用，下同)，滴加至体系中，在50℃条件下搅拌反应1.5h后，将余下的马来酸酐配制成水溶液滴加至体系中，再反应1.5h，反应过程中控制体系pH为9-10，最终体系pH调至6.0，得到酰化度为60-70％的酰化改性酪蛋白多肽，得到的样品等电点降低、乳化性及乳化稳定性增强。
将马来酸酐改性的酪蛋白多肽(2.0％，w/w)溶于磷酸盐缓冲液(pH7.0，10mmol/L)中，磁力搅拌3h以上，使蛋白充分溶胀，形成水相溶液；将一定量的β-胡萝卜素溶于玉米油中，浓度为0.1％(w/w)，磁力搅拌机充分搅拌至完全溶解，制成乳化油相组分。将乳化油相组分与水相溶液按1：9的质量比通过高速剪切机剪切2min形成粗乳液，而后通过高压微射流仪在103.4MPa下将粗乳液进一步均质6次，均质化期间使用碎冰保持温度低于15℃。所得纳米乳液粒径为150-200nm，与仅由酪蛋白稳定的纳米乳液相比，具有更好的乳化性和储藏稳定性，同时具有pH响应性，是一种功能特性良好的生物活性物质载体。
实施例2
称取10g酪蛋白，用磷酸缓冲液溶解，调节pH至7.5，底物浓度为5％，在试管中以50U/g的添加量加入胰蛋白酶(13000-20000个BAEE单位mg-1蛋白)，置于55℃水浴中进行酶解反应，同时采用超声波辅助(温度64℃，功率460W，时间60min)水解反应，在水解过程中检测pH变化并用1mol/L的NaOH调节，反应时间为100min。反应结束后，添加胰蛋白酶抑制剂灭活胰蛋白酶，得到水解度为10％的酪蛋白多肽，将其冻干保存。称取一定量的酪蛋白多肽分散于蒸馏水中，用1mol/L的NaOH溶液调pH至9，转移至装有温度计、搅拌器、恒压滴液漏斗的三口烧瓶中，于60℃下孵化30min。马来酸酐的添加量为酪蛋白质量的40％，添加方式采用分批滴加。先称取一半质量的马来酸酐将其配制成水溶液(以减少马来酸酐水解作用，下同)，滴加至体系中，在60℃条件下搅拌反应2h后，将余下的马来酸酐配制成水溶液滴加至体系中，再反应1h，反应过程中控制体系pH为8-9，最终体系pH调至6.0，得到酰化度为70-80％的改性酪蛋白多肽，得到的样品等电点降低、乳化性及乳化稳定性增强。
将改性的酪蛋白多肽(2.0％，w/w)溶于磷酸盐缓冲液(pH7.0，10mmol/L)中，磁力搅拌3h以上，使蛋白充分溶胀，形成水相溶液；将一定量的β-胡萝卜素溶于玉米油中，浓度为0.1％(w/w)，磁力搅拌机充分搅拌至完全溶解，制成乳化油相组分。将乳化油相组分与水相溶液按1：9的质量比通过高速剪切机剪切2min形成粗乳液，而后通过高压微射流仪在103.4MPa下将粗乳液进一步均质8次，均质化期间使用碎冰保持温度低于15℃。所得纳米乳液粒径为120-178nm，与仅由酪蛋白稳定的纳米乳液相比，具有更好的乳化性和储藏稳定性，同时具有pH响应性，是一种功能特性良好的生物活性物质载体。
实施例3
称取10g酪蛋白，用磷酸缓冲液溶解，调节pH至7.0，底物浓度为5％，在试管中以60U/g的添加量加入胰蛋白酶(13000-20000个BAEE单位mg-1蛋白)，置于60℃水浴中进行酶解反应，同时采用超声波辅助(温度60℃，功率450W，时间60min)水解反应，在水解过程中检测pH变化并用1mol/L的NaOH调节，反应时间为120min。反应结束后，添加胰蛋白酶抑制剂灭活胰蛋白酶，得到水解度为10％的酪蛋白多肽，将其冻干保存。称取一定量的酪蛋白多肽分散于蒸馏水中，用1mol/L的NaOH溶液调pH至8，转移至装有温度计、搅拌器、恒压滴液漏斗的三口烧瓶中，于60℃下孵化30min。马来酸酐的添加量为酪蛋白质量的40％，添加方式采用分批滴加。先称取一半质量的马来酸酐将其配制成水溶液(以减少马来酸酐水解作用，下同)，滴加至体系中，在60℃条件下搅拌反应1h后，将余下的马来酸酐配制成水溶液滴加至体系中，再反应1.5h，反应过程中控制体系pH为8-9，最终体系pH调至6.0，得到酰化度为75-80％的改性酪蛋白多肽，得到的样品等电点降低、乳化性及乳化稳定性增强。
将改性的酪蛋白多肽(2.0％，w/w)溶于磷酸盐缓冲液(pH7.0，10mmol/L)中，磁力搅拌3h以上，使蛋白充分溶胀，形成水相溶液；将一定量的β-胡萝卜素溶于玉米油中，浓度为0.1％(w/w)，磁力搅拌机充分搅拌至完全溶解，制成乳化油相组分。将乳化油相组分与水相溶液按1：10的质量比通过高速剪切机剪切4min形成粗乳液，而后通过高压微射流仪在100MPa下将粗乳液进一步均质5次，均质化期间使用碎冰保持温度低于15℃。所得纳米乳液粒径为150-200nm，与仅由酪蛋白稳定的纳米乳液相比，具有更好的乳化性和储藏稳定性，同时具有pH响应性，是一种功能特性良好的生物活性物质载体。
实施例4
称取10g酪蛋白，用磷酸缓冲液溶解，调节pH至7.5，底物浓度为5％，在试管中以50U/g的添加量加入胰蛋白酶(13000-20000个BAEE单位mg-1蛋白)，置于50℃水浴中进行酶解反应，同时采用超声波辅助(温度68℃，功率500W，时间40min)水解反应，在水解过程中检测pH变化并用1mol/L的NaOH调节，反应时间为90min。反应结束后，添加胰蛋白酶抑制剂灭活胰蛋白酶，得到水解度为16％的酪蛋白多肽，将其冻干保存。称取一定量的酪蛋白多肽分散于蒸馏水中，用1mol/L的NaOH溶液调pH至10，转移至装有温度计、搅拌器、恒压滴液漏斗的三口烧瓶中，于60℃下孵化20min。马来酸酐的添加量为酪蛋白质量的20％，添加方式采用分批滴加。先称取一半质量的马来酸酐将其配制成水溶液(以减少马来酸酐水解作用，下同)，滴加至体系中，在60℃条件下搅拌反应1.5h后，将余下的马来酸酐配制成水溶液滴加至体系中，再反应1.5h，反应过程中控制体系pH为9-10，最终体系pH调至6.0，得到酰化度为55-70％的改性酪蛋白多肽，得到的样品等电点降低、乳化性及乳化稳定性增强。
将马来酸酐改性的酪蛋白多肽(2.0％，w/w)溶于磷酸盐缓冲液(pH7.0，10mmol/L)中，磁力搅拌3h以上，使蛋白充分溶胀，形成水相溶液；将一定量的β-胡萝卜素溶于玉米油中，浓度为0.1％(w/w)，磁力搅拌机充分搅拌至完全溶解，制成乳化油相组分。将乳化油相组分与水相溶液按1：9的质量比通过高速剪切机剪切4min形成粗乳液，而后通过高压微射流仪在120MPa下将粗乳液进一步均质4次，均质化期间使用碎冰保持温度低于15℃。所得纳米乳液粒径为80-130nm，与仅由酪蛋白稳定的纳米乳液相比，具有更好的乳化性和储藏稳定性，同时具有pH响应性，是一种功能特性良好的生物活性物质载体。
实施例5
称取10g酪蛋白，用磷酸缓冲液溶解，调节pH至6.8，底物浓度为5％，在试管中以55U/g的添加量加入胰蛋白酶(13000-20000个BAEE单位mg-1蛋白)，置于40℃水浴中进行酶解反应，同时采用超声波辅助(温度70℃，功率460W，时间50min)水解反应，在水解过程中检测pH变化并用1mol/L的NaOH调节，反应时间为120min。反应结束后，添加胰蛋白酶抑制剂灭活胰蛋白酶，得到水解度为20％的酪蛋白多肽，将其冻干保存。称取一定量的酪蛋白多肽分散于蒸馏水中，用1mol/L的NaOH溶液调pH至10，转移至装有温度计、搅拌器、恒压滴液漏斗的三口烧瓶中，于40℃下孵化30min。马来酸酐的添加量为酪蛋白质量的60％，添加方式采用分批滴加。先称取一半质量的马来酸酐将其配制成水溶液(以减少马来酸酐水解作用，下同)，滴加至体系中，在40℃条件下搅拌反应1.5h后，将余下的马来酸酐配制成水溶液滴加至体系中，再反应1.5h，反应过程中控制体系pH为9-10，最终体系pH调至6.0，得到酰化度为65-80％的改性酪蛋白多肽，得到的样品等电点降低、乳化性及乳化稳定性增强。
将马来酸酐改性的酪蛋白多肽(2.0％，w/w)溶于磷酸盐缓冲液(pH7.0，10mmol/L)中，磁力搅拌3h以上，使蛋白充分溶胀，形成水相溶液；将一定量的β-胡萝卜素溶于玉米油中，浓度为0.1％(w/w)，磁力搅拌机充分搅拌至完全溶解，制成乳化油相组分。将乳化油相组分与水相溶液按1：8的质量比通过高速剪切机剪切5min形成粗乳液，而后通过高压微射流仪在120MPa下将粗乳液进一步均质4次，均质化期间使用碎冰保持温度低于15℃。所得纳米乳液粒径为90-148nm，与仅由酪蛋白稳定的纳米乳液相比，具有更好的乳化性和储藏稳定性，同时具有pH响应性，是一种功能特性良好的生物活性物质载体。
实施例6
称取10g酪蛋白，用磷酸缓冲液溶解，调节pH至7.5，底物浓度为5％，在试管中以50U/g的添加量加入胰蛋白酶(13000-20000个BAEE单位mg-1蛋白)，置于60℃水浴中进行酶解反应，同时采用超声波辅助(温度68℃，功率500W，时间40min)水解反应，在水解过程中检测pH变化并用1mol/L的NaOH调节，反应时间为120min。反应结束后，添加胰蛋白酶抑制剂灭活胰蛋白酶，得到水解度为18％的酪蛋白多肽，将其冻干保存。称取一定量的酪蛋白多肽分散于蒸馏水中，用1mol/L的NaOH溶液调pH至10，转移至装有温度计、搅拌器、恒压滴液漏斗的三口烧瓶中，于60℃下孵化30min。马来酸酐的添加量为酪蛋白质量的20％，添加方式采用分批滴加。先称取一半质量的马来酸酐将其配制成水溶液(以减少马来酸酐水解作用，下同)，滴加至体系中，在60℃条件下搅拌反应2.5h后，将余下的马来酸酐配制成水溶液滴加至体系中，再反应1h，反应过程中控制体系pH为9-10，最终体系pH调至6.0，得到酰化度为50-68％的改性酪蛋白多肽，得到的样品等电点降低、乳化性及乳化稳定性增强。
将马来酸酐改性的酪蛋白多肽(2.0％，w/w)溶于磷酸盐缓冲液(pH7.0，10mmol/L)中，磁力搅拌3h以上，使蛋白充分溶胀，形成水相溶液；将一定量的β-胡萝卜素溶于玉米油中，浓度为0.1％(w/w)，磁力搅拌机充分搅拌至完全溶解，制成乳化油相组分。将乳化油相组分与水相溶液按1：10的质量比通过高速剪切机剪切3min形成粗乳液，而后通过高压微射流仪在120MPa下将粗乳液进一步均质6次，均质化期间使用碎冰保持温度低于15℃。所得纳米乳液粒径为80-130nm，与仅由酪蛋白稳定的纳米乳液相比，具有更好的乳化性和储藏稳定性，同时具有pH响应性，是一种功能特性良好的生物活性物质载体。
综上所述，藉由本发明的上述技术方案获得的水包油型纳米乳液具有纳米级粒径，具有抗沉降和乳析的动力学稳定特性，其小液滴尺寸具有允许高效递送特性，易转运吸收，可提高疏水性生物活性物质吸收效率，具备较好pH响应性、抗氧化活性、抗菌性、较好的乳化性及乳化稳定性等优点，在pH值为2.5-3.9条件下较为稳定，作为递送载体在胃肠道环境中可保持相对稳定，其良好的生物包埋性和活性物质高效递送作用，在营养物质的递送、药物的控释、生物活性物质的稳定等领域具有广泛用途。
此外，本案发明人还参照实施例1-6的方式，以本说明书中列出的其它原料和条件等进行了试验，并同样制得了具备较好pH响应性、抗氧化活性、抗菌性、较好的乳化性及乳化稳定性等优点的pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液。
应当理解的是，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种酰化改性酪蛋白多肽的制备方法，其特征在于包括：
提供酪蛋白多肽；
以马来酸酐对酪蛋白多肽进行酰化改性，在酪蛋白多肽中引入羧基，获得酰化改性酪蛋白多肽，其中，所述酰化改性的反应液pH值为8～10，温度为40～60℃，时间为3～3.5h。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述马来酸酐与酪蛋白多肽的质量比为1：5～3：5；优选的，所述制备方法包括：将所述马来酸酐分批加入反应体系中，对所述酪蛋白多肽进行酰化改性；优选的，所述酰化改性酪蛋白多肽的酰化度为50～80％。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于包括：在pH值为6.8～7.5的条件下，采用超声辅助处理，使酪蛋白和胰蛋白酶于40～60℃进行酶水解反应90～120min，获得酪蛋白多肽；优选的，所述酪蛋白多肽的水解度为10～20％；优选的，所述酪蛋白包括酪蛋白含量为5～15wt％的酪蛋白水溶液；优选的，所述胰蛋白酶的添加量为50～60U/g；优选的，所述超声辅助处理采用的温度为60～70℃，功率为450～500W，时间为40～60min；优选的，所述制备方法还包括：在所述酶水解反应完成后，向所述酶水解反应的反应液中加入抑制剂灭活胰蛋白酶终止反应；优选的，所述酪蛋白多肽具有裸露的氨基酸侧链氨基。
4.由权利要求1-3中任一项所述方法制备的酰化改性酪蛋白多肽。
5.一种pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液的制备方法，其特征在于包括：
按照权利要求1-3中任一项所述方法制备酰化改性酪蛋白多肽；
采用高压均质和微射流技术，使所述酰化改性酪蛋白多肽的水相溶液与乳化油相组分均匀混合，获得水包油型的pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于包括：采用高压均质技术，对所述乳化油相组分和水相溶液的混合液于15℃以下进行剪切2～5min，形成粗乳液，之后采用高压微射流技术，在100～120MPa下将所述粗乳液进一步进行均化处理，获得pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液，之后于2～6℃下储存；优选的，所述乳化油相组分与水相溶液的质量比为1：8～10。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于包括：使疏水性生物活性物质溶于油相溶剂中，并避光50～60℃搅拌10～12min，之后于20～25℃下搅拌1～1.5小时，制得所述乳化油相组分；优选的，所述油相溶剂包括玉米油。
8.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于包括：将所述酰化改性酪蛋白多肽溶于磷酸盐缓冲液中，并搅拌3h以上，形成所述的水相溶液。
9.由权利要求5-8中任一项所述方法制备的pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液；优选的，所述pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液的形态结构为球形，粒径分布为80～200nm；优选的，所述pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液具备pH响应性，且在pH值为2.5～3.9的条件下性质稳定。
10.权利要求9所述的pH响应型酪蛋白多肽基纳米乳液于营养物质的递送、药物的控释、生物活性物质的稳定领域中的用途。
CN201810296442.3A 2018-03-30 2018-03-30 酰化改性酪蛋白多肽、纳米乳液、其制备方法及应用 Active CN108486200B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810296442.3A CN108486200B (zh) 2018-03-30 2018-03-30 酰化改性酪蛋白多肽、纳米乳液、其制备方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810296442.3A CN108486200B (zh) 2018-03-30 2018-03-30 酰化改性酪蛋白多肽、纳米乳液、其制备方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108486200A true CN108486200A (zh) 2018-09-04
CN108486200B CN108486200B (zh) 2021-08-24

Family

ID=63318119

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810296442.3A Active CN108486200B (zh) 2018-03-30 2018-03-30 酰化改性酪蛋白多肽、纳米乳液、其制备方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108486200B (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109526873A (zh) * 2018-10-19 2019-03-29 江南大学 一种喂食秀丽线虫油脂或脂溶性物质的方法
CN110272471A (zh) * 2019-08-02 2019-09-24 潍坊医学院 一种多肽、多肽制成的肿瘤药物及肿瘤药物的制备方法
CN110423266A (zh) * 2019-08-02 2019-11-08 潍坊医学院 一种多肽、多肽纳米载药载体及两者的制备方法
CN110498931A (zh) * 2019-09-04 2019-11-26 合肥工业大学 果胶-大豆分离蛋白-咖啡酸三元复合物、其制法及应用
CN110498932A (zh) * 2019-09-04 2019-11-26 合肥工业大学 酪蛋白-果胶-原儿茶酸三元复合物、其制备方法及应用
CN113209005A (zh) * 2021-05-08 2021-08-06 华中农业大学 高稳定性的蛋白纳米凝胶递送载体的制备方法及应用
CN115501181A (zh) * 2021-06-07 2022-12-23 武汉科福新药有限责任公司 一种纳多洛尔柔性纳米凝胶乳剂及其制备方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5926130A (ja) * 1982-08-06 1984-02-10 Shiseido Co Ltd 乳化組成物
JPS59155396A (ja) * 1983-02-22 1984-09-04 Nippon Shinyaku Co Ltd 脂肪酸アシル化カゼイン及びその製法
CN103160559A (zh) * 2013-01-23 2013-06-19 重庆大学 改性玉米醇溶蛋白肽的制备方法
CN104531059A (zh) * 2014-12-24 2015-04-22 甘肃农业大学 一种天然环保型改性酪蛋白胶及其制备工艺
CN105734103A (zh) * 2016-05-11 2016-07-06 上海艾苛密进出口有限公司 酪蛋白水解肽的制备方法
CN106072623A (zh) * 2016-07-09 2016-11-09 东北农业大学 一种复合纳米乳液的制备方法
CN107446218A (zh) * 2017-09-25 2017-12-08 安徽依采妮纤维材料科技有限公司 一种马来酰化木质素磺酸钠填充塑料复合材料的制备方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5926130A (ja) * 1982-08-06 1984-02-10 Shiseido Co Ltd 乳化組成物
JPS59155396A (ja) * 1983-02-22 1984-09-04 Nippon Shinyaku Co Ltd 脂肪酸アシル化カゼイン及びその製法
CN103160559A (zh) * 2013-01-23 2013-06-19 重庆大学 改性玉米醇溶蛋白肽的制备方法
CN104531059A (zh) * 2014-12-24 2015-04-22 甘肃农业大学 一种天然环保型改性酪蛋白胶及其制备工艺
CN105734103A (zh) * 2016-05-11 2016-07-06 上海艾苛密进出口有限公司 酪蛋白水解肽的制备方法
CN106072623A (zh) * 2016-07-09 2016-11-09 东北农业大学 一种复合纳米乳液的制备方法
CN107446218A (zh) * 2017-09-25 2017-12-08 安徽依采妮纤维材料科技有限公司 一种马来酰化木质素磺酸钠填充塑料复合材料的制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CORNELLY VAN DER VEN等: ""Emulsion Properties of Casein and Whey Protein Hydrolysates and the Relation with Other Hydrolysate Characteristics"", 《J. AGRIC. FOOD CHEM》 *
刘程等: "《食品添加剂实用大全 修订版》", 31 January 2004, 北京工业大学出版社 *
由耀辉等: ""马来酸酐酰化改性对大豆分离蛋白功能性质的影响"", 《中国油脂》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109526873A (zh) * 2018-10-19 2019-03-29 江南大学 一种喂食秀丽线虫油脂或脂溶性物质的方法
CN110272471A (zh) * 2019-08-02 2019-09-24 潍坊医学院 一种多肽、多肽制成的肿瘤药物及肿瘤药物的制备方法
CN110423266A (zh) * 2019-08-02 2019-11-08 潍坊医学院 一种多肽、多肽纳米载药载体及两者的制备方法
CN110498931A (zh) * 2019-09-04 2019-11-26 合肥工业大学 果胶-大豆分离蛋白-咖啡酸三元复合物、其制法及应用
CN110498932A (zh) * 2019-09-04 2019-11-26 合肥工业大学 酪蛋白-果胶-原儿茶酸三元复合物、其制备方法及应用
CN110498931B (zh) * 2019-09-04 2021-09-24 合肥工业大学 果胶-大豆分离蛋白-咖啡酸三元复合物、其制法及应用
CN113209005A (zh) * 2021-05-08 2021-08-06 华中农业大学 高稳定性的蛋白纳米凝胶递送载体的制备方法及应用
CN115501181A (zh) * 2021-06-07 2022-12-23 武汉科福新药有限责任公司 一种纳多洛尔柔性纳米凝胶乳剂及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN108486200B (zh) 2021-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108486200A (zh) 酰化改性酪蛋白多肽、纳米乳液、其制备方法及应用
Wu et al. Biological and conventional food processing modifications on food proteins: Structure, functionality, and bioactivity
JP3524096B2 (ja) 水性媒体において膜をゲル化粒子の少なくとも表面に形成するためのエステル化多糖とポリアミンとの間のアシル交換反応の使用、それにより生成した粒子、それらの製造方法及び前記粒子を含有する組成物
Xia et al. Linear and non-linear rheology of heat-set soy protein gels: Effects of selective proteolysis of β-conglycinin and glycinin
Dalgleish Bovine milk protein properties and the manufacturing quality of milk
JPH07121206B2 (ja) 腸内吸収栄養製剤
CN108208834A (zh) 一种负载姜黄素的大豆蛋白基纳米颗粒及其制法和用途
CN108452314A (zh) Osa改性小麦醇溶蛋白纳米颗粒及其制备方法与应用
CN108606952A (zh) 一种玉米醇溶蛋白负载植物甾醇的纳米乳液的制备方法
CN108451924A (zh) 一步吸附法制备蛋白质微胶囊的方法
CN108467487A (zh) 淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物、其制备方法及应用
Wang et al. Improved encapsulation capacity of casein micelles with modified structure
CN106124758B (zh) 一种水溶性微球的制备方法及其应用
KR20170020307A (ko) 배지 재수화 시스템, 방법 및 장치
CN105770903A (zh) 一种温控药物释放聚合物微球材料的制备方法
CN109247425A (zh) 一种具有双壳结构的卵白蛋白乳液的制备方法
CN108157585A (zh) 一种负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒及其制法和用途
CN106990250A (zh) 一种还原自组装蛋白质包裹磁性微球的制备方法及应用
JP2003508482A (ja) 標的動物に対する水分布システムを通す水−不溶性薬品の投与のための獣医学的調合物
CN110498931A (zh) 果胶-大豆分离蛋白-咖啡酸三元复合物、其制法及应用
Dong et al. Dispersible biopolymer particles loaded with lactase as a potential delivery system to control lactose hydrolysis in milk
Cases et al. Interfacial properties of acidified skim milk
Sari et al. ICAM-1 targeted catalase encapsulated PLGA-b-PEG nanoparticles against vascular oxidative stress
Hou et al. Effects of hydrodynamic cavitation at different pH values on the physicochemical properties and aggregation behavior of soybean glycinin
CN110498932A (zh) 酪蛋白-果胶-原儿茶酸三元复合物、其制备方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant