CN108478526A - 双重响应两亲性聚膦腈靶向药物载体材料及其制备方法 - Google Patents

双重响应两亲性聚膦腈靶向药物载体材料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料上接枝亲水链段MPEG和酶敏感的疏水链段肽链，并在疏水侧链上键合酸敏感型药物，在水中易于自组装形成胶束，静脉注射进入人体中，通过EPR效应在肿瘤部位聚集，进入细胞内部，肿瘤细胞内的生理环境的酸性比较强，pH值约在4.5‑5.5之间而人体正常生理pH值为7.4；且细胞内包含大量的溶酶体酶，在低pH和溶酶体酶的双重作用下载药聚合物的胶束结构发生解离，释放出游离的阿霉素，阿霉素作用于DNA，阻止了DNA的复制，而使肿瘤细胞死亡，最终达到靶向治疗、无毒副作用的目的。

Description

双重响应两亲性聚膦腈靶向药物载体材料及其制备方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种双重响应两亲性聚膦腈靶向药物载体材料及其制备方法。
背景技术
聚膦腈是一种有机-无机功能高分子材料，其主链是由氮原子和磷原子交替排列组成的，通过侧链衍生化可以引入不同性能的基团，侧链的多样性赋予了其特殊的物理化学性能，如降解性、生物相容性良好，无致癌性、亲水性或疏水性等。由于聚膦腈侧基的可控性，多样性，聚膦腈衍生物的功能也多样化，可以作为药物控制系统应用于药物学和医学研究领域。
大多数的化疗药物对肿瘤细胞有杀伤力的同时也对正常细胞存在杀伤力，即这些抗肿瘤药物在肿瘤组织和正常组织之间缺乏特异性，并且在治疗过程中对人体有严重的毒副作用。
因此，聚膦腈因其功能可多样化和合成灵活性，一直是定向治疗肿瘤疾病类药物载体材料研究的热门课题。
发明内容
基于以上问题，本发明的其一目的是提供一种可以将药物定向输送至病变部位，治疗效率高且对人体无毒副作用的双重响应两亲性聚膦腈靶向药物载体材料。
其二目的是提供一种所述双重响应两亲性聚膦腈靶向药物载体材料的制备方法。
本发明的技术方案为：
本发明提供一种双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料，包含酶响应和pH响应的双重响应型两亲性聚膦腈和至少一种疏水性药物；
所述双重响应型两亲性聚膦腈以式(1)所示的聚膦腈链段为骨架，并在磷原子上连接有亲水性链段和疏水性链段；
所述亲水性链段为聚乙二醇单甲醚，分子量为2000-3000，所述疏水性链段为肽链；
得到的所述双重响应型两亲性聚膦腈的化学式为：
其中，A为聚乙二醇单甲醚，B为肽链；
所述疏水性链段上共价键键合所述疏水性药物。
所述疏水性药物为酸敏感型阿霉素和/或酸敏感型紫杉醇等。
所述的载药聚合物材料在水中易于自组装形成胶束，静脉注射进入人体中，通过EPR效应在肿瘤部位聚集，肿瘤细胞内的生理环境的酸性比较强，pH值约在4.5-5.5之间而人体正常生理pH值为7.4；且细胞内包含大量的溶酶体酶，在低pH和溶酶体酶的双重作用下胶束结构发生解离，释放出游离的疏水性药物，并作用于DNA，阻止了DNA的复制，而使肿瘤细胞死亡，最终达到靶向治疗、无毒副作用的目的。
优选的，所述双重性响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料中，所述酸敏感型阿霉素为酸敏感型阿霉素-顺式乌头酸酐，其化学式为
优选的，所述双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料，所述疏水性链段为酶响应五肽或七肽，所述五肽的化学式为gly-phe-leu-gly-lys-OEt，所述七肽的化学式为gly-phe-leu-gly-asp-(lys-OEt)-lys-OEt。
根据本发明的双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料，所述疏水性链段上还键合疏水性荧光标记化合物和/或叶酸。叶酸受体可以在肿瘤细胞表面的特异性表达，聚合物侧链上键合的靶向分子叶酸与肿瘤细胞表面介体受导作用进入到细胞内部。
根据本发明的双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料，所述疏水性药物的质量百分含量为13-22％。
根据本发明的双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料，所述亲水性链段和疏水性链段的摩尔比为0.9-3.7：1。
优选的，所述亲水性链段和疏水性链段的摩尔比为0.9-1.2：1。
根据本发明的双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料，所述载药聚合物材料的胶束平均粒径为87-130nm。
本发明提供所述的双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成双重响应两亲性聚膦腈：
a.将聚膦腈溶解于四氢呋喃溶液中，制得聚膦腈溶液；
b.将MPEG-ONa溶液滴加入所述聚膦腈溶液中，在常温下反应，键合所述亲水性链段，得到聚膦腈-MPEG反应液；
c.向上述聚膦腈-MPEG反应液中滴加含有所述疏水性链段肽链和三乙胺的四氢呋喃溶液，在常温下反应，然后在45-55℃进行油浴加热，继续反应，得到聚膦腈-MPEG-肽链反应液；
d.反应结束后，将所述聚膦腈-MPEG-肽链反应液旋干，再以甲醇溶解，然后完成过滤、浓缩、透析纯化，最后进行冷冻干燥，得到所述双重响应两亲性聚膦腈；
(2)合成双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料：
a.将所述疏水性药物同NHS(N-羟基丁二酰亚胺)一起加DMF溶解完全，滴加含DCC的DMF溶液，避光搅拌混合，得到所述疏水性药物反应液；
b.将所述双重响应两亲性聚膦腈溶解于DMF中，再加入TEA，常温反应完全后，得到聚合物反应液；
c.将所述聚合物反应液加至所述疏水性药物反应液中，常温避光搅拌，静置反应；
d.反应结束后，加水，离心，将得到的上清液加进行蒸馏水透析，冷冻干燥得双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料。
所述的双重响应两亲性聚膦腈的合成路线如下：
根据本发明的双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料的制备方法，在步骤(1)中，b步骤中，常温反应时间为2-3h，c步骤中，常温反应时间为2-32h，油浴加热反应时间为40-50h，d步骤中先MWCO＝500-1000KDa的透析袋进行甲醇透析3-5次，每次4-5h，然后将透析袋内溶液旋干，以去离子水溶解，再次以去离子水透析3-5次，每次4-5h。
根据本发明的双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料的制备方法，在步骤(2)中，a步骤中，搅拌时间为2-3h，b步骤中，常温反应时间为2-3h，c步骤中，静置反应时间为10-15h，d步骤中，离心转速为10000-12000r/min，时间为3-5min，透析的截留分子量为4-5KDa，透析3-5次，每隔4-5h更换一次，完成透析。
在进行制备的过程中，设计MPEG和肽链的摩尔比为1-3.5:1。
本发明中的化学试剂名称对应如下：
DCC—二环己基碳二亚胺；
TEA—三乙胺；
DMF—N，N-二甲基甲酰胺；
THF—四氢呋喃；
MPEG—聚乙二醇单甲醚；
EA—乙酸乙酯；
HOBt—1-羟基苯并三唑；
CAD—酸敏感型阿霉素-顺式乌头酸酐；
SAD—酸不敏感型阿霉素-丁二酸酐。
绝大部分肿瘤组织周围的环境pH值(6.15-7.4)都比正常组织周围的生理pH值(7.0-7.4)低，而且细胞中的内涵体与溶酶体中pH值(5.0-6.5)更低。本发明提供的抗癌药物载体利用该特征，具有合适的pH敏感度，可以在肿瘤部位定点释放药物。
本发明的有益效果为：
本发明提供的双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料上接枝亲水链段MPEG和酶敏感的疏水链段肽链，并在疏水侧链上键合酸敏感型药物，在水中易于自组装形成胶束，静脉注射进入人体中，通过EPR效应在肿瘤部位聚集，进入细胞内部，肿瘤细胞内的生理环境的酸性比较强，pH值约在4.5-5.5之间而人体正常生理pH值为7.4；且细胞内包含大量的溶酶体酶，在低pH和溶酶体酶的双重作用下载药聚合物的胶束结构发生解离，释放出游离的阿霉素，阿霉素作用于DNA，阻止了DNA的复制，而使肿瘤细胞死亡，最终达到靶向治疗、无毒副作用的目的。
所述制备方法根据所述载药聚合物材料的酶响应、pH响应的双重响应合成原料，制定合成路线与工艺，得到的载药聚合物材料载药含量达到13-22％，胶束粒径在87-130nm，更易于在肿瘤部位富积，提高了药物浓度，增强治疗的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是五肽GFLGK和共聚物MPEG/PN/PP的核磁谱图；
图2是共聚物MPEG/PN/PP-1、MPEG/PN/HP-1、与MPEG以及五肽和七肽的傅里叶红外光谱图；
图3是MPEG/PN/HP/CAD-1、MPEG/PN/HP/SAD-1的核磁图谱；
图4是双重响应两亲性聚膦腈MPEG/PN/PP分别在D2O和CDCl3中的核磁谱图；
图5是双重响应两亲性聚膦腈MPEG/PN/HP分别在D2O和CDCl3中的核磁谱图；
图6是本发明实施例1-3的载药聚合物与对比例1-3键合SAD的核磁图谱。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
具体实施例中，设计所述疏水性链段为五肽时，MPEG和肽链的摩尔比为1:1、1.5:1和2.5:1，对应所述双重响应两亲性聚膦腈分别为MPEG/PN/PP-1、MPEG/PN/PP-2和MPEG/PN/PP-3；设计所述疏水性链段为七肽时，MPEG和肽链的摩尔比为2:1、2.5:1和3.5:1，对应所述双重响应两亲性聚膦腈分别为MPEG/PN/HP-1、MPEG/PN/HP-2和MPEG/PN/HP-3，如表1所示。
表1
亲疏水链摩尔比 载药类型
实施例1 MPEG/五肽＝1:1 CAD
实施例2 MPEG/五肽＝1.5:1 CAD
实施例3 MPEG/五肽＝2.5:1 CAD
实施例4 MPEG/七肽＝2:1 CAD
实施例5 MPEG/七肽＝2.5:1 CAD
实施例6 MPEG/七肽＝3.5:1 CAD
对比例1 MPEG/五肽＝1:1 SAD
对比例2 MPEG/五肽＝1.5:1 SAD
对比例3 MPEG/五肽＝2.5:1 SAD
实施例1
本发明提供一种双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料，包含酶响应和pH响应的双重响应型两亲性聚膦腈和至少一种疏水性药物；
所述双重响应型两亲性聚膦腈以式(1)所示的聚膦腈链段为骨架，并在磷原子上连接有亲水性链段和疏水性链段；所述亲水性链段为聚乙二醇单甲醚，所述疏水性链段为酶响应五肽H2N-GFLGK-OEt，化学式为gly-phe-leu-gly-lys-OEt；
得到的所述双重响应型两亲性聚膦腈的化学式为：
其中，A为聚乙二醇单甲醚，B为酶响应五肽；
所述疏水性链段上共价键键合所述疏水性药物，所述疏水性药物为酸敏感阿霉素-顺式乌头酸酐。
所述双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料的结构式为：
所述疏水性链段上键合靶向分子叶酸后，所述双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料的结构式为：
上述所述疏水性链段上只共价键键合所述疏水性药物的双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料的制备方法：设计所述疏水性链段为五肽，MPEG和五肽的摩尔比为1:1；
(1)合成双重响应两亲性聚膦腈：
采用热开环聚合法合成聚膦腈：称取1.0000g六氯环三聚磷腈(8.62mmol)，添加六氯环三聚磷腈3％(0.0300g)的三氯化铝作催化剂，于安瓿瓶中，真空下封管；温度控制在250℃下热开环聚合，产物粘度无明显变化时停止反应，冷却至室温，得到所述聚膦腈，整个反应过程确保在无水无氧条件下进行；
a.将所述1.5g聚膦腈溶解于四氢呋喃溶液中，常温搅拌6h进行溶解，制得聚膦腈溶液；
b.按照亲水性链段MPEG和五肽的摩尔比为1:1，量取MPEG-ONa溶液滴加入所述聚膦腈溶液中，在常温下反应3h，键合所述亲水性链段，得到聚膦腈-MPEG反应液；
c.按照亲水性链段MPEG和五肽的摩尔比为1:1，称取经真空干燥后的五肽H2N-GFLGK-OEt，向上述聚膦腈-MPEG反应液中滴加含有所述五肽和三乙胺的四氢呋喃溶液，在常温下反应2h，然后在45℃进行油浴加热，继续反应40h，得到聚膦腈-MPEG-肽链反应液；
d.反应结束后，撤去油浴，冷却至室温，将所述聚膦腈-MPEG-肽链反应液旋干，再以甲醇溶解，用硅藻土过滤，以10000r/min的转速离心5min除去不溶物，然后将获得的上清液浓缩、再转移至透析袋(MWCO＝500Da)透析纯化，内，甲醇透析3次，每次间隔5h，透析结束后，透析袋内溶液旋干，再以少量去离子水溶解，移至透析袋(MWCO＝20KDa)，去离子水透析3次，每次5h，透析结束后，透析袋内溶液冷冻干燥，得到所述双重响应两亲性聚膦腈MPEG/PN/PP-1；
(2)合成双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料：
称取150mg盐酸阿霉素(0.2586mmol)溶于10mL蒸馏水中，用0.5M的NaOH溶液调节pH值至8.5-8.7；然后，称取201.9mg顺势乌头酸酐(1.293mmol)溶于4mL 1,4-二氧六环中，在冰水浴条件下逐滴滴加至盐酸阿霉素溶液中，滴加的同时用0.5M的NaOH溶液调节反应液的pH值，使其在滴加的整个过程中保持在8.5-8.7范围内，滴加完毕后，常温避光搅拌，过夜。反应结束后，在冰水浴下，用1M HCl调节PH至2-3，会出现大量絮状物，EA萃取三次，旋蒸，用PH＝3的盐酸水溶液洗涤并离心三次，水洗并离心一次，去除上清液，不溶物冷冻干燥，得酸敏感阿霉素-顺式乌头酸酐，即CAD；其合成路线如下：
a.将33.7mgCAD同5.8mgNHS一起加至1.2mLDMF溶解完全，滴加含8.9mgDCC的DMF溶液，避光搅拌混合2h，得到CAD反应液；
b.将所述双重响应两亲性聚膦腈60mg溶解于1.6mLDMF中，再加入3.7μL TEA，常温反应2h至反应完全后，得到聚合物反应液；
c.将所述聚合物反应液加至所述CAD反应液中，常温避光搅拌，静置反应10h；
d.反应结束后，加2.8mL水，以10000r/min的转速离心5min，将得到的上清液加入透析袋(MWCO＝5KDa)，蒸馏水透析4次，每间隔5h更换一次，冷冻干燥得双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料。
实施例2
依照实施例1的制备方法，设计所述疏水性链段为五肽，按照MPEG和五肽的摩尔比为1.5:1，修改其中各原料组分的用量；
在步骤(1)中，b步骤中，常温反应时间为2h，c步骤中，按照亲水性链段MPEG和五肽的摩尔比为1.5:1，称取经真空干燥后的五肽H2N-GFLGK-OEt，向上述聚膦腈-MPEG反应液中滴加含有所述五肽和三乙胺的四氢呋喃溶液，在常温下反应3h，然后在55℃进行油浴加热，继续反应50h，d步骤中，反应结束后，撤去油浴，冷却至室温，将所述聚膦腈-MPEG-肽链反应液旋干，再以甲醇溶解，用硅藻土过滤，以12000r/min的转速离心5min除去不溶物，然后将获得的上清液浓缩、再转移至透析袋(MWCO＝1000Da)透析纯化，内，甲醇透析5次，每次间隔4h，透析结束后，透析袋内溶液旋干，再以少量去离子水溶解，移至透析袋(MWCO＝20KDa)，去离子水透析5次，每次4h，透析结束后，透析袋内溶液冷冻干燥，得到所述双重响应两亲性聚膦腈MPEG/PN/PP-2；
在步骤(2)中，a步骤中，搅拌时间为3h，b步骤中，常温反应时间为3h，c步骤中，静置反应时间为15h，d步骤中，离心转速为12000r/min，时间为3min，透析的截留分子量为4KDa，透析3次，每隔4h更换一次，完成透析。
实施例3
依照实施例1的制备方法，设计所述疏水性链段为五肽，按照MPEG和五肽的摩尔比为2.5:1，修改其中各原料组分的用量；
在步骤(1)中，b步骤中，常温反应时间为2h，c步骤中，按照亲水性链段MPEG和五肽的摩尔比为1.5:1，称取经真空干燥后的五肽H2N-GFLGK-OEt，向上述聚膦腈-MPEG反应液中滴加含有所述五肽和三乙胺的四氢呋喃溶液，在常温下反应3h，然后在50℃进行油浴加热，继续反应48h，d步骤中，反应结束后，撤去油浴，冷却至室温，将所述聚膦腈-MPEG-肽链反应液旋干，再以甲醇溶解，用硅藻土过滤，以11000r/min的转速离心5min除去不溶物，然后将获得的上清液浓缩、再转移至透析袋(MWCO＝800Da)透析纯化，内，甲醇透析4次，每次间隔5h，透析结束后，透析袋内溶液旋干，再以少量去离子水溶解，移至透析袋(MWCO＝20KDa)，去离子水透析4次，每次5h，透析结束后，透析袋内溶液冷冻干燥，得到所述双重响应两亲性聚膦腈MPEG/PN/PP-3；
在步骤(2)中，a步骤中，搅拌时间为3h，b步骤中，常温反应时间为3h，c步骤中，静置反应时间为12h，d步骤中，离心转速为11000r/min，时间为4min，透析的截留分子量为4KDa，透析5次，每隔5h更换一次，完成透析。
根据需求，以上实施例1-3中通过以上制备工艺在所述疏水性链段上键合荧光标记化合物Cy5、Cy3等。
实施例4
本发明提供一种双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料，包含酶响应和pH响应的双重响应型两亲性聚膦腈和至少一种疏水性药物；
所述双重响应型两亲性聚膦腈以式(1)所示的聚膦腈链段为骨架，并在磷原子上连接有亲水性链段和疏水性链段；所述亲水性链段为聚乙二醇单甲醚，所述疏水性链段为酶响应七肽H2N-GFLGDKK-OEt，化学式可表达为gly-phe-leu-gly-asp-(lys-OEt)-lys-OEt；
得到的所述双重响应型两亲性聚膦腈的化学式为：
其中，A为聚乙二醇单甲醚，B为所述酶响应七肽；
所述疏水性链段上共价键键合所述疏水性药物，所述疏水性药物为酸敏感阿霉素-顺式乌头酸酐。
所述双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料的结构式为：
所述疏水性链段上还共价键键合叶酸，得到的所述双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料的结构式为：
所述疏水性链段上只键合所述疏水性药物，制备所述双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料。依照实施例1的制备方法，设计所述疏水性链段为七肽，按照MPEG和五肽的摩尔比为2:1，修改其中各原料组分的用量，在步骤(2)a中将叶酸与所述疏水性药物一同进行溶解反应，得到所述疏水性药物反应液，其他制备原料与工艺参数与实施例1相同。
实施例5
依照实施例4的制备方法，设计所述疏水性链段为七肽，按照MPEG和七肽的摩尔比为2.5:1，修改其中各原料组分的用量，其他制备原料与工艺参数与实施例4相同。
实施例6
依照实施例4的制备方法，设计所述疏水性链段为七肽，按照MPEG和七肽的摩尔比为3.5:1，修改其中各原料组分的用量，其他制备原料与工艺参数与实施例4相同。
对比例1
参照实施例1，改变所述疏水性链段上键合的药物类型为SAD，即酸不敏感的阿霉素-丁二酸酐，SAD的合成路线如下：
其制备方法参考实施例1。
对比例2
参照实施例1，改变所述疏水性链段上键合的药物类型为SAD，即酸不敏感的阿霉素-丁二酸酐。
对比例3
参照实施例1，改变所述疏水性链段上键合的药物类型为SAD，即酸不敏感的阿霉素-丁二酸酐。
图1显示MPEG/PN/PP-1、MPEG/PN/PP-2和MPEG/PN/PP-3两亲性聚膦腈与五肽GFLGK在氘代氯仿中的核磁谱图。由该谱图可以很明确的看出，三组聚合物中亲水性基团MPEG在3.54-3.87ppm处的特征峰；以及疏水基团五肽亮氨酸上异丙基在0.88ppm处的两个甲基峰，酯基上1.16ppm处的甲基峰，赖氨酸1.17-1.2ppm处的亚甲基峰，赖氨酸上ω位氨基的保护基Boc上1.37ppm处的叔丁基峰，亮氨酸上1.42-1.46ppm处的亚甲基峰，苯丙氨酸在7.22-7.35ppm处的单取代苯环峰等特征峰。
图2为MPEG/PN/PP-1、MPEG/PN/HP-1、聚乙二醇单甲醚MPEG2000、五肽Z-GFLGK和七肽Z-GFLGDKK的傅里叶红外光谱图，发现聚乙二醇单甲醚上亚甲基在2889cm-1处的伸缩振动吸收峰、1468cm-1处变形振动吸收峰和1107cm-1处醚键的伸缩振动吸收峰，多肽链段中1533cm-1处酰胺键面内弯曲振动的特征吸收峰，1664cm-1处仲酰胺羰基的特征吸收峰，696cm-1和752cm-1处苯丙氨酸上单取代苯环的特征吸收峰。图1和图2结合说明在聚膦腈侧链上接枝MPEG和五肽GFLGK链段，得到酶响应型两亲性聚膦腈共聚物。
图3是键合CAD和SAD的共聚物MPEG/PN/HP/CAD-1和MPEG/PN/HP/SAD-1的核磁谱图，可以明显看到，MPEG/PN/HP/CAD-1在6.37ppm处显现出了CAD分子的特征峰，2.63ppm和2.34ppm处显现出了SAD分子的特征峰，酶响应型两亲性聚膦腈的侧链上键合了CAD和SAD分子，制得PH和酶双重响应型载药聚膦腈共聚物。
图4中显示的A、B组分别为MPEG/PN/PP-1和MPEG/PN/PP-2在CDCl3中的谱图，(C)和(D)分别为MPEG/PN/PP-1和MPEG/PN/PP-2在D2O中的谱图。通过谱图(A)和(C)的对比及(B)和(D)的对比，可以很明显地看出，在D2O中3.54-3.87ppm处亲水性链段MPEG的特征峰仍然存在，峰强也无变化；而疏水性五肽在0.5-2.0ppm低场处和4.0-8.0ppm高场处的特征峰消失，说明制得的双重响应型两亲性聚膦腈在水中存在自组装行为，形成的聚集体将疏水性的五肽包裹在聚集体的内核，导致在水中测定时不能显现出其特征峰。
图5中显示(A)和(B)分别为MPEG/PN/HP-1和MPEG/PN/HP-2在CDCl3中的谱图，(C)和(D)分别为MPEG/PN/HP-1和MPEG/PN/HP-2在D2O中的谱图。同样的，通过对比(A)和(C)、(B)和(D)很明显地看出，这两组聚合物在D2O中亲水性链段MPEG在3.54-3.87ppm处的特征峰也依旧存在，强度也无明显变化；而疏水性七肽在0.5-3.0ppm低场处及4.0-8.0ppm高场处的特征峰消失，表明制得的双重响应型两亲性聚膦腈在水中自发地自组装，形成的聚集体将七肽链段包裹在内核中，导致在水中测定时显现不出其特征峰。
图6所示是实施例1-3的载药聚合物MPEG/PN/PP/CAD和对比例1-3的载药聚合物MPEG/PN/PP/SAD在D2O中的核磁谱图。该谱图仅仅显示出了载药聚合物中亲水性链段MPEG的特征峰，而疏水性的多肽链段和键合的药物小分子CAD、SAD的特征峰都消失了。与之前酶响应型两亲性聚合物在氘代水中的核磁谱图相似，说明键合药物小分子CAD和SAD后，聚合物的疏水性增强，在水中更易于自组装，并且将疏水性的多肽和阿霉素完全包裹在胶束内核中，从而导致在D2O中无法检测到它们的特征峰。
表2是双重响应型两亲性聚膦腈在水中的CMC值
CMC(mg/mL) 平均粒径(nm) Zeta电位(mV)
MPEG/PN/PP-1 0.0417 24 -17.8
MPEG/PN/PP-2 0.0904 34 -15.2
MPEG/PN/PP-3 0.1552 43 -13.1
MPEG/PN/HP-1 0.0625 28 -16.9
MPEG/PN/HP-2 0.0726 29 -14.8
MPEG/PN/HP-3 0.0834 34 -12.5
设计双重响应型两亲性聚膦腈的疏水性链段为五肽时，三个聚合物MPEG和肽链的设计摩尔比由1:1增到2.5:1，CMC值也由0.0417逐渐变大到0.1552，表明随着亲水性比例的增大聚合物的CMC逐渐增大，说明亲水性基团的增多不太利于聚合物胶束的形成，所以自组装成胶束的最低浓度较大。
设计双重响应型两亲性聚膦腈的疏水性链段为七肽时，三个聚合物MPEG和肽链的设计摩尔比由2:1增到3.5:1，三组的CMC值也由0.0625逐渐增到0.0834，自组装性能与前三组聚合物相似。
说明不论疏水链段是五肽，还是七肽，疏水性基团肽链比例的增大都利于胶束的形成。
表2中zeta电位的数据变化表示，疏水性链段的比例增加同样有利于增强胶束的稳定的，且以上六组双重响应型两亲性聚膦腈的zeta电位绝对值都大于10，说明得到的双重响应型两亲性聚膦腈不仅易于在水中自组装，而且形成的胶束在水中也能够稳定存在。
表3不同实施例的载药聚合物材料胶束性质
表3为得到的载药聚合物的载药量、胶束平均粒径以及zeta电位值，表明随着载药量的增加，胶束粒径较原双重响应型两亲性聚膦腈明显增大，这是由于键合药物后，在水溶液中CAD和多肽都是成为载药胶束的疏水性内核，而使胶束粒径明显增大，同时体系的疏水性增加，亦更利于胶束的形成与稳定。
同时，以上所述的载药聚合物胶束的粒径显示其属于大分子，通过静脉注射进入人体后，不仅在人体内循环时不易被排出体外，延长了体内循环时间，而且由于肿瘤的属性排列和缺陷的淋巴回流系统，会使大分子更易于在肿瘤部位富积，提高了药物浓度，最终可以增强治疗的效果。
表4和表5分别对比了键合酸敏感的CAD和SAD分子后的载药聚合物在不同pH下72h内的累积释放百分率。从表4和表5中可以看出，键合酸敏感的CAD分子的载药胶束对释放环境的pH有响应性。对于多肽链段为五肽的载药聚合物MPEG/PN/PP/CAD-1来说72h内的累积释放百分率，在pH＝7.4时为35.6％，而pH＝5.0时高达80.9％，说明CAD分子确实对酸很敏感，在低pH下结构发生解离，快速释放出游离的包裹在内核的阿霉素。同样，对于多肽链段为七肽的载药聚合物MPEG/PN/HP/CAD-1来说，72h内的累积释放百分率在pH＝7.4时为36.7％，而pH＝5.0时是86.9％，也证明了CAD具有酸响应性。累积释放百分率之所以增幅这么高，是由于在较低pH值下，CAD的解离，提高了溶解度，进一步促进了药物的释放。
对比键合酸不敏感的SAD载药聚合物，pH对键合酸不敏感的阿霉素-丁二酸酐(SAD)分子的载药胶束几乎没有任何影响。多肽链段为五肽的MPEG/PN/PP/SAD-1和多肽链段为七肽MPEG/PN/HP/SAD-1在72h内的累积释放百分率，在pH＝7.4时分别为16.8％和13.7％，在pH＝5.0时分别为20.7％和18.8％，累积释放百分率增幅很小，可以忽略，说明pH对SAD确实影响不大，而且键合SAD的六组载药聚合物在72h内的累积释放百分率都没超过20％。
表4载药聚合物在不同pH值下72h内的累积释放百分率比较
(MPEG/PN/PP/SAD-1表示载药聚合物材料双重响应两亲性聚膦腈接枝的亲水性链段与疏水性链段MPEG/五肽摩尔比为1：1，结合载药物质为SAD；MPEG/PN/PP/SAD-2表示载药聚合物材料双重响应两亲性聚膦腈接枝的亲水性链段与疏水性链段MPEG/五肽摩尔比为1.5：1，结合载药物质为SAD；MPEG/PN/HP/SAD-3表示载药聚合物材料双重响应两亲性聚膦腈接枝的亲水性链段与疏水性链段MPEG/五肽摩尔比为2.5：1，结合载药物质为SAD。)
表5载药聚合物在不同pH值下72h内的累积释放百分率
(MPEG/PN/HP/SAD-1表示载药聚合物材料双重响应两亲性聚膦腈接枝的亲水性链段与疏水性链段MPEG/七肽摩尔比为2：1，结合载药物质为SAD；MPEG/PN/HP/SAD-2表示载药聚合物材料双重响应两亲性聚膦腈接枝的亲水性链段与疏水性链段MPEG/七肽摩尔比为2.5：1，结合载药物质为SAD；MPEG/PN/HP/SAD-3表示载药聚合物材料双重响应两亲性聚膦腈接枝的亲水性链段与疏水性链段MPEG/七肽摩尔比为3.5：1，结合载药物质为SAD。)
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料，其特征在于，包含酶响应和pH响应的双重响应型两亲性聚膦腈和至少一种疏水性药物；
所述双重响应型两亲性聚膦腈以式(1)所示的聚膦腈链段为骨架，并在磷原子上连接有亲水性链段和疏水性链段；所述亲水性链段为聚乙二醇单甲醚，所述疏水性链段为肽链；
得到的所述双重响应型两亲性聚膦腈的化学式为：
其中，A为聚乙二醇单甲醚，B为肽链；
所述疏水性链段上共价键键合所述疏水性药物。
2.根据权利要求1所述的双重性响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料，其特征在于，所述疏水性药物为酸敏感型阿霉素-顺式乌头酸酐，化学式为
3.根据权利要求1所述的双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料，其特征在于，所述疏水性链段为酶响应五肽或七肽，所述酶响应五肽的化学式为gly-phe-leu-gly-lys-OEt，所述酶响应七肽的化学式为gly-phe-leu-gly-asp-(lys-OEt)-lys-OEt。
4.根据权利要求1所述的双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料，其特征在于，所述疏水性链段上还键合疏水性荧光标记化合物和/或叶酸。
5.根据权利要求1所述的双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料，其特征在于，所述疏水性药物的质量百分含量为13-22％。
6.根据权利要求1所述的双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料，其特征在于，所述亲水性链段和疏水性链段的摩尔比为0.9-3.7：1。
7.根据权利要求1所述的双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料，其特征在于，所述载药聚合物材料的胶束平均粒径为87-130nm。
8.权利要求1-7任一所述的双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成双重响应两亲性聚膦腈：
a.将聚膦腈溶解于四氢呋喃溶液中，制得聚膦腈溶液；
b.将MPEG-ONa溶液滴加入所述聚膦腈溶液中，在常温下反应，键合所述亲水性链段，得到聚膦腈-MPEG反应液；
c.向上述聚膦腈-MPEG反应液中滴加含有所述疏水性链段肽链和三乙胺的四氢呋喃溶液，在常温下反应，然后在45-55℃进行油浴加热，继续反应，得到聚膦腈-MPEG-肽链反应液；
d.反应结束后，将所述聚膦腈-MPEG-肽链反应液旋干，再以甲醇溶解，然后完成过滤、浓缩、透析纯化，最后进行冷冻干燥，得到所述双重响应两亲性聚膦腈；
(2)合成双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料：
a.将所述疏水性药物同NHS一起加DMF溶解完全，滴加含DCC的DMF溶液，避光搅拌混合，得到所述疏水性药物反应液；
b.将所述双重响应两亲性聚膦腈溶解于DMF中，再加入TEA，常温反应完全后，得到聚合物反应液；
c.将所述聚合物反应液加至所述疏水性药物反应液中，常温避光搅拌，静置反应；
d.反应结束后，加水，离心，将得到的上清液加进行蒸馏水透析，冷冻干燥得双重响应两亲性聚膦腈靶向载药聚合物材料。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，b步骤中，常温反应时间为2-3h，c步骤中，常温反应时间为2-3h，油浴加热反应时间为40-50h，d步骤中先MWCO＝500-1000KDa的透析袋进行甲醇透析3-5次，每次4-5h，然后将透析袋内溶液旋干，以去离子水溶解，再次以去离子水透析3-5次，每次4-5h。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，a步骤中，搅拌时间为2-3h，b步骤中，常温反应时间为2-3h，c步骤中，静置反应时间为10-15h，d步骤中，离心转速为10000-12000r/min，时间为3-5min，透析的截留分子量为4-5KDa，透析3-5次，每隔4-5h更换一次，完成透析。
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