CN108456649B

CN108456649B - 还原粘土矿物中Fe(III)的变形杆菌及其抑制粘土膨胀性应用

Info

Publication number: CN108456649B
Application number: CN201810209269.9A
Authority: CN
Inventors: 崔凯; 孙珊珊; 张忠智; 徐全数; 沙特; 刘小楠; 罗一菁; 张志勇
Original assignee: China University of Petroleum Beijing
Current assignee: China University of Petroleum Beijing
Priority date: 2018-03-14
Filing date: 2018-03-14
Publication date: 2021-10-29
Anticipated expiration: 2038-03-14
Also published as: CN108456649A

Abstract

本发明提供了一种还原粘土矿物中Fe(III)的变形杆菌及其抑制粘土膨胀性应用。本发明的变形杆菌的保藏号为CGMCC No.15331，该菌株具有铁还原活性、兼性厌氧、电子供体利用比较广泛，可以高效还原柠檬酸铁和蒙脱石中的Fe(III)，不仅可以用于低渗透油藏中粘土矿物的溶蚀，而且还可以通过菌种自身及其代谢产物还原油藏中易水化膨胀粘土矿物中三价铁离子，进行晶格结构改变和物相转化从而达到提高渗透率以及通道减阻提高原油采收率的目的。

Description

还原粘土矿物中Fe(III)的变形杆菌及其抑制粘土膨胀性应用

技术领域

本发明是关于一种变形杆菌及其抑制粘土膨胀性应用，具体是关于一种产酸产气且高效还原粘土矿物中Fe(III)的变形杆菌，以及该菌在还原柠檬酸铁和蒙脱石矿物质中Fe(III)、抑制粘土膨胀性等方面的应用，属于生物工程技术在微生物溶蚀矿物中的应用，涉及油藏中粘土矿物的溶蚀、抑制粘土矿物水化膨胀性以及改善储层渗流和通道减阻技术领域。

背景技术

铁是地球上丰度最高及地壳含量第四的元素，其以Fe(II)及Fe(III)为主要价态广泛分布于地表沉积环境中。据统计，沉积环境中铁元素平均含量可达3.9％，其中Fe(III)/Fe(II)比例约为1.35。铁在自然环境中通常以难溶性Fe(III)氧化物的形式存在。铁的氧化还原过程不仅是地表能量流的重要途径之一，更是直接调控沉积环境有机碳矿化、有机污染物及有害重金属的迁移转化及生源元素的运移等过程。

微生物是地表铁循环的核心参与者，其作用过程主要体现为同化代谢及异化反应两类方式。其中，以细胞体外发生铁氧化或还原反应为特征的异化作用是铁循环的重要驱动力。在铁还原反应中，自然界沉积环境中广泛分布的铁氧化物及含铁粘土矿物是Fe(III)的主要赋存形式。在微生物还原Fe(III)矿物的过程中，往往伴随着不同类型的次生矿物的产生，这些次生矿物被认为蕴含着微生物代谢活动的信息，可以作为追溯地质时期微生物介导铁还原过程的有效标记。同时，微生物通过产酸产气和还原矿物质中Fe(III)的作用对油藏中粘土矿物进行溶蚀、抑制水化膨胀性以及改善储层渗流和道减阻，最终达到增加油藏原油采收率的目的。

异化铁还原菌(Dissimilatory Iron Reduction)是指一类能够以Fe(III)作为唯一电子受体、Fe(III)被还原和同时氧化有机碳源，并从中获取能量供自身生长的一类微生物的统称。铁还原菌是指能通过氧化电子供体偶联还原Fe(III)，并从中获取能量的微生物。早在，1927年Starkey和Halvorson就观察到细菌能介导铁矿物上发生的铁还原过程，随后1987年Semple等首次从油藏产出液中分离到铁还原菌Shewanella和Alteromonasputrefaciens。目前，已经有100多株铁还原细菌被分离纯化，主要发布于地杆菌属(Geobacter sp.)、希瓦氏菌属(Shewanella sp.)、脱硫杆菌属(Desulfitobacteriumsp.)、铁杆菌(Ferribacterium sp.)等几个属。但这些具有铁还原活性的菌株尚存在以下缺陷：1)大多数菌株只能在严格厌氧环境中生存，不利于大规模生产与实际应用；2)菌株的电子供体利用比较窄，只能利用乙酸、乳酸等小分子量有机物作为电子供体，不能利用葡萄糖、蔗糖等分子量较大的有机物，对实际应用的环境要求相对较高。例如，CN101096645A公开了一株产气肠杆菌及其应用，该菌仅是在常温(30℃)、严格厌氧条件下进行富铁矿物的Fe(III)还原且还原率低，不能在较高温度、兼性厌氧的条件下对粘土矿物中Fe(III)进行高效还原且不产生物有机酸。CN104974964A公开了一株异化铁还原菌及其应用，虽然该菌可在常温(30℃)、严格厌氧条件下对蒙脱石中Fe(III)进行还原，但还原率仅为16.25％且需要在添加铁还原催化剂(AQDS)存在的情况下还原反应30天才可以达到。

变形杆菌是自然界中普遍存在的菌株，但至今仍未发现具有铁还原活性的产酸产气变形杆菌的报道。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种新的Fe(III)还原功能菌。

本发明的另一目的在于提供所述Fe(III)还原功能菌的相关应用。

根据本发明的具体实施方案，本发明提供的Fe(III)还原功能菌，是一种产酸产气且高效还原粘土矿物质中Fe(III)的变形杆菌。

本案发明人从大港油田采集的采出液中筛选得到的一株产酸产气Fe(III)还原功能菌，本发明中命名为CA128菌。该CA128菌已于2018年2月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，保藏编号为CGMCC No.15331，分类命名：豪氏变形杆菌(Proteushauseri)。

本发明的CA128菌，经分子生物学鉴定，分析其16sRNA基因序列并在NCBI数据库中进行比对，结果显示该菌属于变形杆菌，相似度为98％。该菌生长温度范围为30-55℃，最适生长温度范围为30-40℃，最优的生长温度为35℃并且在该温度下可以产生大量的代谢有机酸和气体；生长pH值范围为5-10，最佳生长pH值范围为7-10；该菌具有较高的耐盐性可在矿化度为90000mg/L的条件下生存并产生相当数量的菌体；革兰氏阴性菌；能代谢蔗糖产酸产气；具备运动性；此菌株具有铁还原活性、兼性厌氧、电子供体利用比较广泛。可以在好氧和厌氧环境下生存，厌氧条件下能氧化的电子供体有：葡萄糖、蔗糖、柠檬酸和乙酸等有机物。

本发明的CA128菌，可高效的还原柠檬酸铁和蒙脱石中Fe(III)为Fe(II)。在本发明的一具体实施方案中，利用本发明的CA128菌还原柠檬酸铁和蒙脱石中Fe(III)为Fe(II)，其中，柠檬酸铁中Fe(II)的生成量为455.2mg/L，Fe(III)还原率可达86.62％；蒙脱石中Fe(II)的生成量为190.2mg/L，Fe(III)还原率可达47.1％。

本发明的CA128菌，在发酵培养基中可产气产生物有机酸。在本发明的一具体实施方案中，对CA128菌在发酵培养基中产气产生物有机酸进行测定，其中产气量为4.7mL，气体的主要成分为CO₂(39.6％)和H₂(15.2 4％)；pH由初始值7下降至5左右。

本发明的CA128菌，对蒙脱石矿物质进行还原，有新的伊利石及次生矿物生成。在本发明的一具体实施方案中，利用所述CA128菌对蒙脱石矿物质中Fe(III)的还原并利用FTIR和XRD分别对CA128菌还原前后的蒙脱石矿物质中化学价键、官能团以及物相的变化进行分析，经CA128菌还原蒙脱石矿物质中Fe(III)后，在FTIR中3750cm^-1处的νM-OH伸缩振动峰强度急剧减弱；νM-OH变形振动带中924cm^-1，845cm^-1，812cm^-1和746cm^-1处的伸缩振动峰明显减弱。在XRD中，d₍₀₀₁₎衍射峰从

偏移至

且半峰宽数值增加；

(2θ＝8.627°)、

(2θ＝8.906°)和

(2θ＝9.652°)处出现一些新的衍射峰，说明有新的伊利石及次生矿物生成。

本发明的CA128菌，对蒙脱石矿物质进行还原，可改变蒙脱石表面形貌，降低Fe(III)元素的含量。在本发明的一具体实施方案中，利用所述CA128菌对蒙脱石矿物质中Fe(III)的还原并利用SEM和EDS分别对CA128菌还原前后的蒙脱石矿物质形貌特征和化学元素组分变化进行分析，经CA128菌还原蒙脱石矿物质中Fe(III)后，在SEM中空白组蒙脱石表面形貌由均匀片层结构变为溶蚀、多孔及片层结构坍塌形状；在EDS中，蒙脱石矿物质中Fe(III)元素的含量由空白组的2.29％下降至1.17％。

本发明的CA128菌，可以有效的抑制蒙脱石矿物的水化膨胀性。在本发明的一具体实施方案中，利用所述CA128菌对蒙脱石矿物质中Fe(III)的还原并对CA128菌还原前后的蒙脱石矿物质的水化膨胀性进行测试，CA128菌可以有效的抑制蒙脱石矿物的水化膨胀性，在水中和煤油中抑制率分别可达到47.4％和35.5％。

本发明的CA128菌，可用于油藏中粘土矿物的溶蚀，通过菌种自身及其代谢产物还原油藏中易水化膨胀粘土矿物中的三价铁离子，进行晶格结构改变和物相转化从而达到提高渗透率以及通道减阻提高原油采收率的目的。

从而，一方面，本发明提供了一种变形杆菌，其保藏编号为CGMCC No.15331。

另一方面，本发明还提供了一种变形杆菌菌制剂，该菌制剂中含有保藏编号为CGMCC No.15331的变形杆菌，为固态或液态菌制剂。

另一方面，本发明还提供了培养所述的变形杆菌或所述的变形杆菌菌制剂的方法，该方法包括：将所述的变形杆菌或所述的变形杆菌菌制剂在发酵培养基中培养。

根据本发明的具体实施方案，所述发酵培养基的组分包括：蔗糖8-15g/L；NaCl 3-8g/L；NH₄Cl 1-5g/L；KH₂PO₄ 1-2g/L；K₂HPO₄ 2-5g/L；MgSO₄·7H₂O 0.1-1.0g/L；CaCl₂ 0.01-0.1g/L；CH₃COONa 8-15mM；酵母浸粉0.01-0.5g/L。

根据本发明的具体实施方案，所述培养条件为：温度30-55℃；pH值5-10；优选地，矿化度90000mg/L以下。

另一方面，本发明还提供了一种变形杆菌的代谢产物，其是将本发明的变形杆菌或所述的变形杆菌菌制剂在所述发酵培养基中培养而得到的代谢产物。

另一方面，本发明还提供了所述的变形杆菌、或所述的变形杆菌菌制剂、或所述的代谢产物，在还原粘土和/或矿物质中Fe(III)中的应用；优选地，所述矿物质包括柠檬酸铁矿物质和/或蒙脱石矿物质。通过菌种自身及其代谢产物还原油藏中易水化膨胀粘土矿物中三价铁离子，进行晶格结构改变和物相转化，从而可达到提高渗透率以及通道减阻提高原油采收率的目的。本发明还为微生物抑制粘土水化膨胀所用菌株适用范围的扩大提供了有效的方法。

另一方面，本发明还提供了所述的变形杆菌、或所述的变形杆菌菌制剂、或所述的代谢产物，在抑制油藏储层粘土和/或矿物质水化膨胀性中的应用。

另一方面，本发明还提供了所述的变形杆菌、或所述的变形杆菌菌制剂、或所述的代谢产物，在油藏中粘土和/或矿物质的溶蚀、和/或改善孔道渗流从而提高油藏采收率中的应用。

根据本发明的具体实施方案，本发明在应用所述的变形杆菌、或所述的变形杆菌菌制剂、或所述的代谢产物进行上述应用时，其中包括将所述的变形杆菌、或所述的变形杆菌菌制剂、或所述的代谢产物与所述粘土和/或矿物质接触进行作用的过程。根据需要，还可包括添加发酵培养基对所述变形杆菌进行培养的过程。

综上所述，本发明提供了一种产酸产气且高效还原粘土矿物质中Fe(III)的变形杆菌CA128及其抑制粘土膨胀性应用，本发明的CA128菌具有铁还原活性、兼性厌氧、电子供体利用比较广泛，可以在好氧和厌氧环境下生存，可以高效地还原柠檬酸铁和和蒙脱石中的Fe(III)。不仅可以用于低渗透油藏中粘土矿物的溶蚀，而且还可以通过菌种自身及其代谢产物还原油藏中易水化膨胀粘土矿物中三价铁离子，进行晶格结构改变和物相转化从而达到提高渗透率以及通道减阻提高原油采收率的目的。因此该菌为微生物抑制油藏储层粘土膨胀改善渗流和通道减阻提供了新的方法。本发明拓宽人们对变形杆菌(Proteushauseri)在其功能方面的应用思路研究，为Fe(III)还原功能菌在抑制油藏储层粘土水化膨胀及改善孔道渗流从而提高油藏采收率方面提供了一种新的方法，具有较强的应用实际价值。

附图说明

图1A为显示Fe(III)还原功能菌CA128的平板菌落示意图。

图1B为Fe(III)还原功能菌CA128的革兰氏染色图。

图1C为Fe(III)还原功能菌CA128的菌体SEM图。

图2A为Fe(III)还原功能菌CA128在LB培养基中生长情况曲线图。

图2B为Fe(III)还原功能菌CA128在LB培养基中生长的pH变化曲线图。

图3A为Fe(III)还原功能菌CA128在不同pH值条件下的生长曲线图。

图3B为Fe(III)还原功能菌CA128在不同矿化度条件下的生长曲线图。

图3C为Fe(III)还原功能菌CA128在不同温度条件下的生长曲线图。

图4A为Fe(III)还原功能菌CA128还原柠檬酸铁体系中Fe(II)浓度曲线图。

图4B为Fe(III)还原功能菌CA128还原柠檬酸铁体系中Fe(III)还原率曲线图。

图5A为Fe(III)还原功能菌CA128还原蒙脱石体系中pH变化曲线图。

图5B为Fe(III)还原功能菌CA128还原蒙脱石体系中Fe(II)浓度曲线图。

图5C为Fe(III)还原功能菌CA128还原蒙脱石体系中Fe(III)还原率曲线图。

图6A-图6D为Fe(III)还原功能菌CA128还原蒙脱石前后矿物质的SEM和EDS谱图。其中，图6A：空白组蒙脱石SEM；图6B：空白组蒙脱石EDS；图6C：CA128菌作用后蒙脱石SEM；图6D：CA128菌作用后蒙脱石EDS。

图7A为Fe(III)还原功能菌CA128还原蒙脱石前后矿物质的FTIR谱图。

图7B为Fe(III)还原功能菌CA128还原蒙脱石前后矿物质的XRD谱图。

用于专利程序的微生物保存：

保藏日期：2018年2月1日；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；

保藏编号：CGMCC No.15331；

分类命名：豪氏变形杆菌(Proteus hauseri)。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步详细说明本发明的产酸产气Fe(III)还原功能菌CA128的特点以及应用中所具有的技术效果，但本发明并不因此而受到任何限制。

实施例1、本发明的Fe(III)还原功能菌CA128的筛选与驯化、分离和鉴定

一、Fe(III)还原功能菌CA128的分离筛选与驯化

Fe(III)还原功能菌CA128的筛选与驯化方法：按照改良的铁还原菌富集培养基(C₆H₁₂O₆·H₂O 10g/L；NH₄Cl 1.0g/L；KH₂PO₄ 0.27g/L；CaCl₂ 0.05g/L；NaHCO₃ 0.25g/L；FeCl₃·6H₂O 9.6g/L；pH＝7.0-7.2)的配方配制培养基。

实验步骤如下：

(1)将配制好的培养基封装入100mL的兼性厌氧瓶中，每个厌氧瓶中装液量为80mL，将分装完毕的厌氧瓶氮气驱氧10min后密封，将其置于高温高压灭菌锅中灭菌，控制灭菌条件为121℃、15min；

(2)待灭菌后将厌氧瓶取出在超净台中冷却降温，后接入10％的油藏采出液，每个样品做2-3个平行组；然后将接种后的培养基放置在恒温暗箱摇床中培养，培养条件控制为35℃、150rpm；

(3)培养5-7天后，待富集培养基溶液颜色由棕黄色变成淡黄色或无色时，取10％厌氧瓶中菌悬液加入新鲜富集培养基中进行转接富集，如此进行3轮富集。

二、Fe(III)还原功能菌CA128的分离与纯化

多轮富集培养后取溶液颜色固定由棕黄色变成淡黄色或无色的培养基采用稀释平板法分离单菌。

实验步骤如下：

(1)取上述最终富集所得菌液在柠檬酸铁(柠檬酸铁3.3g/L；NH₄Cl 1.0g/L；KH₂PO₄0.25g/L；K ₂HPO₄ 0.72g/L；MgSO₄·7H₂O 0.5g/L；CaCl₂·2H₂O 0.1g/L；蔗糖10g/L；琼脂粉加量2％；pH＝7.0-7.2)固体培养基上进行平板划线和涂布，待柠檬酸铁固体培养基上长出有菌落大小相仿、长势好的菌落后挑选并接种到柠檬酸铁液体培养基中；

(2)将液体培养基中菌液划线和涂布，连续3次，选取固体培养基上长势最好的菌株。制得菌液，转入2.0mL离心管中，4000r/min离心5min，弃上清液，分离得到的菌液于4℃保存备用。

三、Fe(III)还原功能菌CA128的鉴定

(1)通过划线法分离得到单菌落，本发明中命名为CA128菌，将分离得到的CA128菌株用LB培养基活化后送至上海生工公司进行基因测序分析。然后将返回的16sRNA的基因序列与NCBI的数据库中进行同源性比对，结果如表1所示。初步鉴定该Fe(III)还原功能菌CA128为变形杆菌。

表1 CA128菌株16sRNA基因鉴定结果

菌株代码	菌株种属	相似度
			CA128	变形杆菌	98％

(2)菌落形态特征：该菌能在平板上形成较小菌落，菌落直径为0.5mm；菌落为扁平状，中间呈白色，并伴有丝状隆起，在菌落的外围部分有较小颗粒状隆起，菌落部分比较光滑，呈现湿润性状，菌落总体上较粘稠、易于挑起，菌落的正反面颜色差异不大(见图1A)。革兰氏染色阴性(见图1B)、无芽胞、无荚膜、运动活泼、两端钝圆的小杆菌。菌体大小约0.6-2.0微米(见图1C)。

实施例2、Fe(III)还原功能菌CA128在LB培养基中生长曲线和pH测定

Fe(III)还原功能菌CA128通过绘制间歇培养的生长曲线和培养基pH变化来了解该菌的生长过程及各个时期出现的时间和产酸能力。

实验步骤如下：

(1)配制LB液体培养基，分装于100mL兼性厌氧瓶中，每个厌氧瓶装液80mL；

(2)在完成高温高压灭菌后，于超净台中接种5％的种子液，置于35℃、150rpm的摇床中培养；

(3)在培养过程中每隔6h经由无菌操作取出4mL培养液进行离心分离，除去上清液并用缓冲液悬浮菌体，而后于紫外分光光度计中波长为600nm的条件下测量其吸光度和pH值并绘制曲线图，如图2A和2B所示。由图2A可知，由于接种为对数生长期的种子液，因此细菌在进行间歇培养的过程中其延滞期很短甚至不可见，因此在图2A中直接表现为对数生长期。对数生长期细菌快速增值，生长速率常数达到最大值，经过12-18h后生长曲线开始变得平缓，细菌的生长进入稳定期，在稳定期维持18h后细菌的总体浓度开始下降，细菌的生长开始进入衰亡期。由图2B可知，在培养期前6h内，菌液的pH急剧下降，6h后pH缓慢降低，培养48h后pH接近最低值，pH稳定在4.8左右。

实施例3、不同pH值、温度及矿化度对Fe(III)还原功能菌CA128的生长影响

(1)pH值对该菌的生长影响：

①配制铁还原菌发酵培养基(蔗糖10g/L；NaCl 5g/L；NH₄Cl 2g/L；KH₂PO₄ 1.4g/L；K₂HPO₄ 3.7g/L；MgSO₄·7H₂O 0.5g/L；CaCl₂ 0.07g/L；CH₃COONa,10mM；酵母浸粉,0.05g/L；微量元素溶液1.0mL；pH＝7.0-7.2)，分装在100mL兼性厌氧中，每瓶装液量为80mL。用1mol/L的盐酸和1mol/L的氢氧化钠调节各瓶中pH值分别为5、6、7、8和9；

②在高温高压灭菌锅中灭菌，按5％的接种量接入种子液，然后在35℃、150rpm条件下培养36h；

③在培养过程中每隔6h经由无菌操作取4mL培养液于离心管中，离心洗涤沉淀并用等体积蒸馏水悬浮菌体，于紫外分光光度计中600nm条件下测量其吸光度并绘制生长曲线，观察其菌浓的变化情况。

(2)矿化度对该菌生长的影响：

①配制铁还原菌发酵培养基，分装在100mL兼性厌氧瓶中，每瓶装液量为80mL。然后往厌氧中添加氯化钠改变其矿化度，因发酵培养基自身带有5000mg/L的矿化度，所以往培养基中分别添加0.5-10.5g/100mL不等的氯化钠，调节矿化度分别为1万、3万、5万、7万、9万和11万；

(3)温度对该菌生长的影响：

①配制铁还原菌发酵培养基，分装在100mL兼性厌氧瓶中，每瓶装液量为80mL；②在高温高压灭菌锅中灭菌完成后，按5％的接种量接种种子液，然后于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和55℃、150rpm条件下培养36h；

Fe(III)还原功能菌CA128在不同pH值、温度及矿化度的生长影响如图3A、图3B、图3C所示，酸性环境对其负面影响较大，其在pH值为7至9的的范围内均能较好的生长，最佳的生长pH值为9；该菌种在矿化度为90000mg/L的条件下依旧能够生存并产生相当数量的菌体，最佳的生长矿化度为10000-30000mg/L之间；该菌种的最佳生长温度为35℃，温度超出50-60℃范围其生长受到明显抑制。

实施例4、Fe(III)还原功能菌CA128在发酵培养基中产气及成分的测定

采用排水测体积和排水取气法来测量和分析Fe(III)还原功能菌CA128在发酵培养基中产气量及气体组成成分。

实验步骤如下：

①配制铁还原菌发酵培养基，分装在120mL厌氧血清中，每瓶装液量为90mL；

②压橡胶塞，铝帽密封，然后用N₂置换瓶中的空气10min；

③在高温高压灭菌锅中灭菌，用针管注射器按5％的接种量接入种子液，然后连接排水集气体装置在35℃、恒温暗箱条件下培养5天并对功能菌产生气体体积进行测量和采集；

④收集的气体用气相色谱仪测定气体组分及相对含量。

Fe(III)还原功能菌CA128在发酵培养基中产生的气体量和组分如表2所示，CA128菌发酵培养5天后，收集到气体产量为4.7mL。在表2中，CA128菌产生的气体组分主要是CO₂和H₂，N₂源自置换空气注入的。

表2 Fe(III)还原功能菌CA128产生气体成分分析

气体成分	含量(％)	气体成分	含量(％)
				CO<sub>2</sub>	39.06	CH<sub>4</sub>	0.12
H<sub>2</sub>	15.24	O<sub>2</sub>	—
				N<sub>2</sub>	45.58

实施例5、Fe(III)还原功能菌CA128还原柠檬酸铁体系中Fe(II)浓度和Fe(III)还原率的分析

实验以柠檬酸铁为铁源，在柠檬酸铁液体培养基中进行Fe(III)还原功能菌CA128对Fe(III)还原性评价。

实验步骤如下：

(1)配制柠檬酸铁液体培养基，分装于100mL兼性厌氧瓶中，每个厌氧瓶装液80mL；

(2)在完成高温高压灭菌后，于超净台中接种5％的种子液，置于35℃、150rpm的摇床中培养，实验周期为10天；

(3)在超净台中，每天用针管注射器取0.5mL反应液于离心管中，然后加入1.0mL浓硫酸(10％)和0.1mL氢氟酸(40％)充分反应，6000rpm离心10min，最后取0.2mL上清液使用改进的邻菲罗啉分光光度法测定Fe(II)浓度并绘制Fe(II)浓度和Fe(III)还原率曲线图。

Fe(III)还原功能菌CA128在柠檬酸铁体系中还原的Fe(II)浓度和Fe(III)还原率如图4A和4B所示。在图4A中，CA128菌在体系中还原的Fe(Ⅱ)浓度量在前5天逐渐增加并在第5天Fe(Ⅱ)浓度达到最大值455.2mg/L，之后Fe(Ⅱ)浓度开始缓慢降低。在图4B中，CA128菌在第5天达到Fe(III)还原率的最大值，其还原率为86.62％。

实施例6、Fe(III)还原功能菌CA128还原蒙脱石中Fe(III)的Fe(II)浓度和Fe(III)还原率的分析

实验以蒙脱石矿物质中Fe(III)为铁源，在铁还原菌发酵培养基中进行Fe(III)还原功能菌CA128对Fe(III)还原性评价。

实验步骤如下：

(1)配制铁还原菌发酵培养基，分装于120mL厌氧血清瓶中，每个血清瓶装液80mL和1.0g蒙脱石矿物(C_Fe(III)＝404mg/L)；

(3)在超净台中，每天用针管注射器取0.5mL反应悬浊液于离心管中，然后加入1.0mL浓硫酸(10％)和0.1mL氢氟酸(40％)充分反应，6000rpm离心10min，最后取0.2mL上清液使用改进的邻菲罗啉分光光度法测定Fe(II)浓度并绘制Fe(II)浓度和Fe(III)还原率曲线图。另外，取2mL反应悬浊液用pH计测量其pH值。

Fe(III)还原功能菌CA128作用蒙脱石体系中pH变化、Fe(II)浓度和Fe(III)还原率如图5A、5B和5C所示。在图5A中，CA128菌pH值随着反应时间的进行由初始6.9下降至约5.8，后达到稳定。图5B和5C中，添加了CA128菌的实验组中Fe(II)浓度和Fe(III)还原率的变化则呈现出先快速增加后平稳降低的两个阶段：第一阶段，实验组体系Fe(II)浓度和Fe(III)还原率由较低的初始浓度快速上升，CA128菌在第4天分别达到了还原蒙脱石中Fe(II)浓度最大值和Fe(III)还原率最大值，其Fe(II)浓度最大值为190.2mg/L，Fe(III)还原率最大值47.1％；第二阶段，Fe(II)浓度逐渐下降，最终稳定在103.8mg/L左右。

实施例7、Fe(III)还原功能菌CA128作用前后蒙脱石矿物的FTIR、XRD、SEM和EDS谱图分析

实验对Fe(III)还原功能菌CA128作用前后的蒙脱石矿物进行了FTIR、XRD、SEM和EDS的性能和形貌变化的表征。

实验步骤如下：

(1)对CA128菌与蒙脱石矿物质反应进行10天后的固体产物进行收集，60℃下烘干；

(2)取2mg固体产物与200mg KBr充分研磨均匀后压片上机测试，实验使用显微傅里叶转换红外光谱分析仪，扫描范围400-4000cm^-1，分辨率为4cm^-1。通过FTIR谱图分析对CA128菌还原蒙脱石中Fe(III)前后矿物结构内化学键振动发生的变化和官能团强弱的变化；

(3)采用定向涂片X射线衍射方法，取固体产物进行X射线衍射分析，在RIGAKU-RA型高功率旋转阳极X射线衍射仪(12KW)上测试，辐射源CuKα(λ＝0.15418)，步长0.02°，扫描范围5-50°(2θ)，管流100mA，扫描速度4°/min，常温下扫描。通过XRD谱图分析CA128菌还原蒙脱石中Fe(III)前后矿物的衍射峰位移变化和新生矿物形成的情况；

(4)采用德国Quorum/mitech K850临界点干燥仪对固体产物进行干燥和QuorumSC7620离子溅射镀膜仪对样品镀铂，采用Quanta 200FEG环境扫描电子显微镜观察样品的显微形貌(加速电压范围为5-15kV)，并且利用Oxford X射线能谱仪进行矿物化学组分分析。通过SEM和EDS对CA128菌还原蒙脱石中Fe(III)前后矿物形貌以及矿物学上的变化进行分析。

Fe(III)还原功能菌CA128作用前后蒙脱石矿物的FTIR、XRD、SEM和EDS谱图变化如图6A-图6D和图7A、图7B所示。在图6A和图6C中，蒙脱石矿物的形貌特征由空白组的均匀片层结构变为表面溶蚀和片层结构坍塌形状。图6B和图6D中，蒙脱石矿物质中Fe(III)的元素含量有空白组的2.29％下降至1.17％。在图7A中，3750cm^-1处的νM-OH伸缩振动峰CA128菌作用后强度急剧减弱，说明蒙脱石中结晶水流失；1120cm^-1和1043cm^-1处的Si-O峰基本消失，说明蒙脱石矿物晶体结构中硅氧四面体Si-O的平行层伸缩振动与垂直层伸缩振动相对位置和强度发生了变化；νM-OH变形振动带中924cm^-1，845cm^-1，812cm^-1，746cm^-1分别指示AlFe-OH，Al Mg-OH，Fe Fe-OH以及Fe Mg-OH振动峰，还原后该区的峰都明显减弱，说明蒙脱石矿物晶体结构中的晶格结构遭到破坏。图7B中，d₍₀₀₁₎衍射峰从

分别偏向

且半峰宽数值增加，说明蒙脱石晶体结构遭到破坏且晶体特性发生改变，结晶度降低，部分蒙脱石转化为伊蒙混层矿物，导致层间距缩小；

(2θ＝8.627°)、

(2θ＝8.906°)和

(2θ＝9.652°)处出现一些新的衍射峰，此层间距与伊利石

左右层间距相近，说明有少量的蒙脱石经过微生物作用后转变为伊利石矿物。

实施例8、Fe(III)还原功能菌CA128作用前后蒙脱石矿物在水和煤油中膨胀性的测定

实验通过对Fe(III)还原功能菌CA128作用前后蒙脱石矿物在水和煤油中的膨胀体积变化来评价功能菌对粘土矿物水化膨胀的抑制作用。

实验步骤如下：

(1)按照SY/T5971-94《油田注水用粘土稳定剂性能评价》中的离心法。取0.1gCA菌作用前后的蒙脱石矿物样品装入2mL离心管中；

(2)分别在含有矿物样品的离心管中加入1.5mL去离子水和1.5mL煤油，充分摇匀，在室温下静置存放24h；

(3)放入离心机，在转速为1500r/min条件下离心10min，读出蒙脱石矿物在去离子水中膨胀前后的体积并计算抑制率；

(4)重复步骤(3)，测定和计算蒙脱石矿物在煤油中的抑制率。

Fe(III)还原功能菌CA128作用前后蒙脱石矿物在水和煤油中的膨胀体积和抑制率如表3所示。

表3 Fe(III)还原功能菌CA128作用蒙脱石矿物在水和煤油中的膨胀体积和抑制率

在表3中，CA128菌对蒙脱石矿物的水化膨胀抑制率在去离子水和煤油中分别达到47.4％和35.5％。

Claims

1.一种变形杆菌(Proteus hauseri)，其保藏编号为CGMCC No.15331。

2.一种变形杆菌菌制剂，该菌制剂中含有保藏编号为CGMCC No.15331的变形杆菌，为固态或液态菌制剂。

3.培养权利要求1所述的变形杆菌或权利要求2所述的变形杆菌菌制剂的方法，该方法包括：将权利要求1所述的变形杆菌或权利要求2所述的变形杆菌菌制剂在发酵培养基中培养。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述发酵培养基的组分包括：蔗糖 8-15 g/L;NaCl 3-8 g/L; NH₄Cl 1-5 g/L; KH₂PO₄ 1-2 g/L; K₂HPO₄ 2-5 g/L; MgSO₄·7H₂O 0.1-1.0 g/L; CaCl₂ 0.01-0.1 g/L; CH₃COONa 8-15 mM; 酵母浸粉 0.01-0.5 g/L。

5.根据权利要求3所述的方法，其中，培养条件为：温度30-55℃；pH值5-10；矿化度90000 mg/L以下。

6.权利要求1所述的变形杆菌或权利要求2所述的变形杆菌菌制剂在还原粘土和/或矿物质中Fe(III)中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述矿物质包括柠檬酸铁矿物质和/或蒙脱石矿物质。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其中包括将权利要求1所述的变形杆菌或权利要求2所述的变形杆菌菌制剂与所述粘土和/或矿物质接触进行作用的过程。