CN108451957A - 3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸在制备治疗假体周围骨溶解药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种3‑乙酰基‑11‑酮基‑β‑乳香酸在制备治疗假体周围骨溶解药物中的用途，涉及药物应用技术领域。本发明3‑乙酰基‑11‑酮基‑β‑乳香酸通过调控ERK信号通路抑制RANKL诱导的破骨细胞活化，减少TNF‑α、IL‑1β和IL‑6炎症因子的释放，减轻了磨损颗粒引起的假体周围骨溶解。

Description

3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸在制备治疗假体周围骨溶解药 物中的用途

技术领域

本发明涉及药物应用技术领域，特别是涉及一种3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸在制备治疗假体周围骨溶解药物中的用途。

背景技术

人工关节置换术被《Lacent》杂志称为“世纪性的手术”。在美国，每年有超过70万左右的患者接受人工关节置换术，预计到2030年，每年接受人工关节置换术的人数可能超过400万以上。然而，随着该手术方式的推广普及以及假体使用时间的延长，在关节置换术的中后期，假体的无菌性松动(aseptic loosening，AL)问题不断地显现出来。Dobzyniak等学者发现，由无菌性松动所引起的人工关节假体失效占到了翻修手术总量的75％左右。

无菌性松动(AL)的发生机制比较复杂，许多因素都可以导致其发生和发展。目前研究认为：磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解(PIO)是引起无菌性松动(AL)的主要病理基础，也是术后假体失效和进行翻修手术的重要原因。大量文献研究显示磨损颗粒所诱导的慢性炎症反应和破骨细胞的过度活化在这一过程中的作用尤为重要。而且，由于翻修手术的技术难度较高，创伤较大，且费用很高，给国家和患者都带来了巨大的痛苦和经济负担。因此，是否能够通过药理学的干预措施来阻断磨损颗粒所诱导的假体周围骨溶解反应仍是目前研究的热点。

3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸(Acetyl-11-keto-β-boswellic acid，AKBA)是从Boswellia serrata植物树胶中提取的乳香酸类有效成分，其分子式为C₃₂H₄₈0₅，分子量为512.72g/mol，结构式如下：

乳香酸常被用在方剂佐剂中用于治疗某些慢性炎症性疾病，具有很好的抗炎效果。然而，3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸是否可以抑制磨损颗粒引起的炎症性骨溶解，目前尚未见相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸在制备治疗假体周围骨溶解药物中的用途，以解决上述现有技术存在的问题，使磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解得到了有效的抑制。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸在制备治疗假体周围骨溶解药物中的用途。

优选的，所述治疗假体周围骨溶解为人工关节置换术后发生的假体周围骨溶解。

优选的，所述3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸用于制备抑制破骨细胞活化过程中ERK信号通路活化的药物。

优选的，所述药物包括活性成分3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸和药学上可接受的载体。

优选的，所述3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸在药物中的质量分数为1～99％。

优选的，将所述3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸制备成适用于胃肠道或非胃肠道给药的药物制剂。

优选的，将所述3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸制备成适用于胃肠道的药物制剂，所述药物制剂为常规片剂或胶囊剂或控释、缓释制剂。

优选的，将所述3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸制备成适用于非胃肠道的药物制剂，所述药物制剂为针剂。

本发明中药物的制备方法没有限制，给药剂量根据给药对象、给药途径或药物的制剂形式不同可以进行适当的变化，但以保证该药物组合物在哺乳动物体内能够达到有效的血药浓度为前提。

本发明公开了以下技术效果：

(1)采用本发明的AKBA治疗假体周围骨溶解时，颅骨表面陷窝数、陷窝面积和陷窝数明显减少，骨密度、骨体积分数明显增加，骨溶解程度明显减轻，骨膜增厚程度减轻，颅骨厚度增加，成熟破骨细胞数量减少；

(2)本发明的AKBA能够抑制RANKL诱导的破骨细胞活化，且抑制作用呈浓度依赖性；

(3)本发明的AKBA能明显抑制ERK信号通路的活化；抑制ERK下游因子c-Fos和NFATc1的表达，而对ERK上游因子MEK的磷酸化水平无影响。

(4)本发明AKBA通过调控ERK信号通路抑制RANKL诱导的破骨细胞活化，减少TNF-α、IL-1β和IL-6炎症因子的释放，减轻了磨损颗粒引起的假体周围骨溶解。

附图说明

图1为本发明实施例4中小鼠颅骨三维图及小鼠颅骨表面陷窝数、表面陷窝面积、骨密度、骨体积分数检测值分析图；

图2为本发明实施例5中小鼠颅骨H&E染色图及骨溶解面积、颅骨厚度检测值分析图；

图3为本发明实施例5中小鼠颅骨TRAP染色图及破骨细胞的数量、破骨细胞/骨表面积百分比检测值分析图；

图4为本发明实施例6中AKBA对小鼠BMMs细胞活性检测分析图；

图5为本发明实施例7中AKBA的浓度对RANKL诱导的破骨细胞分化影响分析图；

图6为本发明实施例7中AKBA对破骨细胞骨吸收能力的影响分析图；

图7为本发明实施例7中鬼笔环肽染色图；

图8为本发明实施例8中ERK信号通路关键蛋白Western blot检测结果图；

图9为本发明实施例8中ERK信号通路关键蛋白Western blot检测结果图；

图10为本发明实施例8中AKBA对ERK信号通路的影响分析图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

本发明实施例中RAW264.7是小鼠单核/巨噬细胞系，在RANKL的诱导下可分化为成熟的破骨细胞；小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMMs)来源于小鼠骨髓，其在RANKL和M-CSF诱导下可分化为成熟的破骨细胞。

实施例1小鼠颅骨骨溶解模型的建立

(1)动物分组

雄性C57BL/J6小鼠共56只，采用随机数字表法分为4组：空白对照组(Control)，Ti颗粒组(Ti)，AKBA低剂量治疗组(L-AKBA)和AKBA高剂量治疗组(H-AKBA)，每组各14只小鼠；每只小鼠皮下注射4mg/kg的6-氯-α-甲基咔唑-2-乙酸。

(2)骨溶解模型的建立

将上述4组小鼠用4％的水合氯醛将小鼠麻醉：

空白对照组(Control)，仅接受手术，在小鼠颅骨正中做一矢状切口约1cm切口，暴露1cm×1cm的骨膜，随后缝合，术后每天向小鼠腹腔内注射0.1mL的无菌PBS溶液，6天/周，持续2周；

Ti颗粒组(Ti)，在小鼠颅骨表面植入20mg Ti颗粒，术后每天向小鼠腹腔内注射0.1mL的无菌PBS溶液，6天/周，持续2周；

L-AKBA组，在小鼠颅骨表面植入20mg Ti颗粒，术后每天向小鼠腹腔内注射7.5mg/kg的AKBA，6天/周，持续2周；

H-AKBA组，在小鼠颅骨表面植入20mg Ti颗粒，术后每天向小鼠腹腔内注射15mg/kg的AKBA，6天/周，持续2周。

术后使用日光灯照射加温复苏小鼠，各组小鼠均在术后30～60min内苏醒，能够正常进食，可在笼内自由活动，精神状态无明显变化。伤口均一起愈合，周围无红肿和渗液等炎性反应表现；在饲养过程中，在饮用水中加入100mg/mL恩诺沙星，持续3天，各组小鼠生长状态良好，反应敏捷，毛色黑而光亮；药物治疗组小鼠对AKBA的耐受性良好，体重增加明显；在整个实验过程中，各组无1例小鼠死亡。

(3)标本收集

给药2周后，每组取7只小鼠采用心脏穿刺法取血1.0mL，取0.4mL加入紫色的EDTA-K2真空管，另外0.6mL加入黄色促凝管，放置于冰上，分别进行小鼠血常规和血生化指标检测。然后，采用脱颈处死小鼠，整体分离小鼠颅骨及颅下脑组织，剔除表面的皮肤和软组织，获取小鼠颅骨。

将每组小鼠颅骨分为3组：每组有7只小鼠的颅骨置于6孔板中，每孔加入2mL含有1％青链霉素的无血清DMEM培养基，在细胞培养箱中培养24h后，以2000rpm离心5min，收集上清液并置于-80℃冰箱中冻存，用于分子生物学检测，并保留颅骨。

每组有4只小鼠的颅骨在去除表面的钛颗粒后，用10％多聚甲醛固定48h后，进行Micro-CT扫描。

每组有3只小鼠的颅骨冲洗干净后，进行组织标本的处理：(1)固定：将冲洗干净的颅骨，放置于10％多聚甲醛溶液中浸泡48h；(2)脱钙：使用10％EDTA脱钙液(pH7.4)在常温下脱钙，每3天更换脱钙液，脱钙3周(以注射器的针头无阻力穿过颅骨即为脱钙成功)；(3)冲洗：脱钙成功后将颅骨置于流水下持续冲洗2h以彻底去除残留的脱钙液成分；(4)脱水：将冲洗干净的颅骨在室温下使用50％乙醇、60％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、95％乙醇Ⅰ、95％乙醇Ⅱ、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ分别处理1h进行脱水；(5)透明：在室温下将颅骨分别浸泡于二甲苯无水乙醇混合液(1：1)30min，二甲苯Ⅰ20min，二甲苯Ⅱ20min，待颅骨完全透明后即可；(6)浸蜡：选用无色透明石蜡在融蜡箱中融化，保持温度在58-60℃，将颅骨依次经过纯蜡/二甲苯(1/2)，纯蜡/二甲苯(1/1)，纯蜡/二甲苯(2/1)，石蜡Ⅰ，石蜡Ⅱ，分别1.5h；(7)包埋：将融化的石蜡倒入准备好的包埋盒内，将颅骨冠状位切面朝下按于包埋盒底部，待石蜡凝固后推出蜡块，制成固体蜡块；(8)切片、展片和烤片：将蜡块修整成梯形，用石蜡切片机将蜡块切成厚度为5μm的连续切片，将正面放入43±2℃水浴中展片，用经过防脱片处理的载玻片捞片，在常温下放置24h后将玻片放入60℃烤箱内烘烤4h，然后进行组织学染色。

实施例2血常规及血生化指标检测

取出血常规管和生化管中保存的血样标本，每7管血样标本为1组，分别在全自动血液分析仪上检测白细胞(WBC)、血红蛋白(Hb)和血小板(PLT)；在全自动生化分析仪上检测天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、血尿素氮(BUN)和血肌酐(Cr)。经统计分析以评估使用AKBA干预以后对小鼠的肝肾毒性。

血常规结果显示：在使用AKBA治疗2周以后，小鼠的血红蛋白、白细胞数量以及血小板数量与Ti颗粒组比较无明显变化，差异无统计学意义(p>0.05)；而且血生化指标中的丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酸、血尿素氮和血肌酐与Ti颗粒组比较也没有显著变化，结果见下表1。结果表明：采用AKBA治疗小鼠后没有对小鼠肝、肾功能产生毒性作用。

表1AKBA对小鼠肝、肾功能的影响(n＝7)

实施例3AKBA抑制小鼠颅骨体外培养体系中炎症因子的表达

采用ELISA方法检测小鼠颅骨体外培养上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，具体操作步骤如下：

(1)配制标准品：根据ELISA试剂盒说明书，以标准品稀释液稀释标准品，室温放置10min；

(2)酶标板上共有10个标准品孔，在每孔中分别加入标准品和待测样品各50μL，增加一个孔作为空白孔添加50μL标准品，每个样品重复测量3次；

(3)在每孔中加入50μL酶标记溶液，将酶标板充分混匀，并用膜密封，放到37℃恒温箱中孵育30min；

(4)弃去反应液，加入100μL洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，用吸水纸拍干水分；

(5)吸取50μL显色剂A加入到各孔，再吸取50μL显示剂B加入到各孔(空白孔除外)，用手轻柔拍打酶标板摇匀液体，放在37℃恒温箱温育15min；

(6)加入100μL洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，用吸水纸拍干水分；

(7)在每孔中加入50μL终止液(此时可见液体由蓝色立转为黄色)；

(8)加终止液15min以内，在酶标仪450nm处测定吸光度(OD₄₅₀值)；

(9)最后依据OD₄₅₀值，计算样品中相应物质TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，每个指标重复测3次，取平均值。

ELISA检测结果显示：与空白对照组(control)相比，Ti颗粒组上清液中的炎症细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达均有明显升高，差异有统计学意义(*p<0.05，**p<0.01)。使用AKBA治疗后，L-AKBA组和H-AKBA组的炎症因子表达水平均有所下降，L-AKBA组上清液中的炎症因子TNF-α、IL-1β分别比Ti颗粒组下降了31.4％和26.0％，差异有统计学意义(*p<0.05，**p<0.01)；H-AKBA组上清液中的炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6分别比Ti颗粒组下降了31.4％、46.9％和27.5％，差异有统计学意义(*p<0.05，**p<0.01)，结果见下表2。结果表明：AKBA能有效抑制小鼠颅骨体外培养体系中炎症因子的表达，且H-AKBA组的抑制作用最为明显。

表2AKBA对颅骨体外培养上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6表达的影响(n＝4)

实施例4AKBA对小鼠骨密度、骨体积分数、颅骨表面陷窝数和颅骨表面陷窝面积的影响

使用比利时SkyScan公司生产的高分辨显微CT SkyScan 1076对小鼠颅骨进行扫描分析。扫描前将小鼠颅骨标本从10％多聚甲醛固定液中取出并晾干，将每个颅骨放在Micro-CT测试试管杯中，试管杯中每次放4个小鼠颅骨，每个颅骨间用泡沫塑料片隔开，颅骨摆放整齐，避免触碰试管杯壁。使用高分辨率Micro-CT扫描进行分析，扫描参数设置为：扫描分辨率18μm，旋转角度180°，旋转角度量增0.9°；X射线能量设定如下：电压80kV，电流100μA，曝光时间100ms。扫描结束后，采用SkyScan 1076自带软件进行颅骨三维重建。按照Wedemeyer建立的方法，使用CT分析软件，在小鼠颅骨表面以冠状缝和矢状缝交汇处为中心，选定一圆柱形感兴趣区域(Region of interest，ROI；3×3×1mm)，分析以下参数：骨密度(Bone mineral density，BMD)，以mg/mm²表示；骨体积分数(Bone volume to tissuevolume ratio，BV/TV；％)；ROI区域内颅骨表面陷窝数(Number of pores)和颅骨表面陷窝面积(Area of pores；％)。

结果如图1所示，三维重建结果显示，与空白对照组(Control)相比，在Ti颗粒组中清楚地观察到在颅盖的矢状线处出现了Ti颗粒诱导的骨溶解现象，小鼠颅骨变薄，虫蚀样破坏明显(图1A)。统计结果表明，Ti颗粒组的颅骨表面陷窝数和陷窝面积与对照组相比较显著增加，差异有统计学意(**p<0.01)(图1B和C)；同时，Ti颗粒组的骨密度(BMD)和骨体积分数(BV/TV)显著低于对照组(**p<0.01)(图1D和E)。

当小鼠腹腔内注射AKBA(7.5mg/kg/d和15mg/kg/d)治疗2周后，可以看到在小鼠颅盖骨中的骨溶解面积明显减小了，并且减小的幅度具有剂量依赖性。统计结果表明，L-AKBA和H-AKBA治疗组颅骨表面陷窝数与Ti颗粒组比较分别减少了31.4％和44.3％，差异有统计学意义(*p<0.05，**p<0.01)，相应的颅骨陷窝面积也比Ti颗粒组明显减少(图1B和C)；L-AKBA和H-AKBA治疗组的骨密度(BMD)和骨体积分数(BV/TV)与Ti颗粒组比较，分别增加了：BMD：44.1％，60.2％；BV/TV：64.3％，114.3％，差异有统计学意义(*p<0.05,**p<0.01)(图1D和E)。

以上结果表明，AKBA可明显抑制Ti颗粒诱导的骨溶解的发生程度，并且这种抑制具有剂量依赖性。

实施例5AKBA对小鼠颅骨厚度、骨溶解面积和破骨细胞的数量的影响

将烘烤后的切片进行组织学染色

1.苏木素-伊红染色(Hematoxylin and eosin staining,H&E)

采用H&E染色来观察颅骨表面的大体变化，分析炎性细胞的浸润和骨质的破坏程度，具体操作步骤如下：

(1)从每组小鼠颅骨切片中选择5张连续的切片放入烤箱内在60℃下烘烤30min；

(2)烘烤后的切片经二甲苯(15min×2次)脱蜡后，依次使用无水乙醇，无水乙醇，95％乙醇，95％乙醇，90％乙醇、80％乙醇、75％乙醇梯度脱水分别5min，然后用去离子水冲洗；

(3)使用苏木素染色3-5min，用去离子水冲洗2min；

(4)使用1％盐酸酒精分化20s，1％氨水返蓝30s，用去离子水冲洗1min；

(5)使用l％伊红溶液复染5min，自来水冲洗5min，用去离子水冲洗1min；

(6)使用75％乙醇，90％乙醇，95％乙醇和无水乙醇分别脱水5min，二甲苯透明(10min×2次)；

(7)用吸水纸擦去切片周围多余的二甲苯，在保持切片湿润的情况下滴加中性树胶，加盖玻片封片。

使用Axio imager.M1正置显微镜观察颅骨的形态学变化，颅骨的ROI区域位于拍摄的中央，于10×条件下摄片。使用显微镜计算机图像分析系统(Image-Proplus 6.0)，计算颅骨厚度(Bone thickness，BT；mm)以及骨溶解面积(Bone eroded surface，BES；mm²)。

H&E染色结果如图2所示：Ti颗粒组在植入Ti颗粒后发生了明显的炎症反应，有大量的炎症细胞浸润，骨的连续性中断，骨膜厚度明显增厚并有明显骨膜反应。而使用AKBA治疗后骨膜变薄，骨膜反应减轻，炎性细胞明显减少，炎症反应减轻，颅骨破坏程度得到明显改善，且作用呈剂量依赖性(图2A)。说明AKBA可以明显减轻Ti颗粒所诱导的慢性炎性反应，且抑制作用呈剂量依赖性。

骨组织计量学统计结果显示：矢状缝骨溶解面积(BES)在Ti颗粒组为(0.16±0.02)mm²，在空白对照组、L-AKBA和H-AKBA组分别为(0.03±0.01)mm²、(0.12±0.02)mm²和(0.05±0.01)mm²，与Ti颗粒组比较，差异有统计学意义(*p<0.05，**p<0.01)(图2B)。

在Ti颗粒植入2周后，Ti颗粒可明显地侵蚀小鼠颅骨，导致其厚度明显变薄，使用Image-Proplus 6.0软件检测结果显示：Ti颗粒组颅骨厚度(BT)为(0.08±0.02)mm，与空白对照组(0.31±0.08)mm相比较，差异有统计学意义(**p<0.01)；而使用AKBA治疗后，颅骨厚度(BT)都明显增加，分别为L-AKBA组(0.18±0.05)mm，H-AKBA组(0.24±0.06)mm，与Ti颗粒组比较，差异有统计学意义(*p<0.05，**p<0.01)(图2C)。

以上结果表明，AKBA可以抑制Ti颗粒所诱导的慢性炎症反应，达到预防骨侵蚀作用，且抑制作用呈剂量依赖性。

2.抗酒石酸酸性磷酸酶染色(Tartrate-Resistant Acid PhosphataseStaining，TRAP)

抗酒石酸酸性磷酸酶是破骨细胞所特有的一种酶，该酶可以通过分泌酸性物质和特异性的蛋白而达到溶解骨质的作用。采用TRAP染色试剂盒(387A)染色后，成熟的破骨细胞会呈现出紫红色，具体染色方法如下：

(1)染色液的配制

按照说明书指导的步骤配制TRAP染色液，按需配制，具体配方如下表3。

表3TRAP染色液

(2)染色步骤

a.从每组小鼠颅骨切片中选择5张连续的切片放入烤箱内在60℃下烘烤30min；

b.烘烤后的切片经二甲苯(15min×2次)脱蜡后，依次使用无水乙醇，无水乙醇，95％乙醇，95％乙醇，90％乙醇、80％乙醇、75％乙醇梯度脱水分别5min，然后用双蒸水冲洗；

c.用吸水纸小心地擦干切片周围的水渍，再将切片用丙酮溶液固定30s，双蒸水冲洗2min；

d.将切片放入暗盒内，并放入配制的TRAP染液，至完全覆盖切片为止，在37℃水浴锅中避光孵育1h，使用双蒸水反复冲洗2min×3次；

e.苏木素复染2min，用自来水冲洗后晾干，滴加中性树胶，加盖玻片封片；

使用Axio imager.M1正置显微镜观察，颅骨的ROI区域位于拍摄的中央，于20×条件下摄片。参照Sawyer建立的方法，使用显微镜计算机图像分析系统(Image-Proplus 6.0)计算ROI区域内成熟破骨细胞的数量和破骨细胞/骨表面积百分比(percentage ofosteoclast surface per bone surface，OcS/BS，％)。

TRAP染色结果如图3所示，空白对照组(Control)仅有少量、散在点状阳性改变；而在Ti颗粒组中，存在大量沿着颅骨溶解侧及骨髓腔排列的大片连续的紫红色深染区域(TRAP阳性细胞)。而在AKBA治疗组中，TRAP阳性细胞明显减少，L-AKBA组仅在颅骨溶解边缘有少量阳性区域(图3A)。

采用骨组织计量学分析结果表明，Ti颗粒组TRAP阳性细胞为(62.2±6.4)个，与空白对照组(7.2±1.2)个比较，差异有统计学意义(**p<0.01)；而L-AKBA和H-AKBA组TRAP阳性细胞数分别为(45.3±5.4)个和(19.2±3.1)个，与Ti颗粒组比较，差异有统计学意义(*p<0.05，**p<0.01)(图3B)。通过Image-Proplus 6.0软件测量结果表明：Ti颗粒加入后OcS/BS明显增加，与空白对照组比较，差异有统计学意义(**p<0.01)；而在L-AKBA和H-AKBA组，OcS/BS分别比Ti颗粒组降低了35.3％和70.6％，差异有统计学意义(*p<0.05，**p<0.01)(图3C)。

以上结果表明，AKBA可以明显地减少Ti颗粒诱导的破骨细胞形成。

实施例6AKBA对小鼠巨噬细胞(BMMs)活性的影响

CCK-8试剂常被用来进行细胞增殖和毒性分析，其基本原理为：该试剂中含有的2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐在1-甲氧基5甲基吩嗪硫酸二甲酯的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲染料。细胞增殖越多，越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。

用0.25％胰蛋白酶消化BMMs细胞，在显微镜下细胞计数。将细胞密度调整为20万/mL,并在96孔细胞培养板(DMEM培养基，30ng/mL M-CSF，50ng/mL RANKL)中每孔接种1.5万个细胞，培养过夜后，更换含有不同浓度AKBA(0，0.1，1，10，20，30，50，100μM)的DMEM培养基(30ng/mL M-CSF，50ng/mL RANKL)一起培养48h或72h。然后去除原有的培养基，每孔加入新的DMEM培养基100μL和CCK-8溶液10μL。轻轻摇晃96孔细胞培养板混匀后，继续放在37℃恒温培养箱中孵育2小时后，将96孔细胞培养板放入酶标仪中测定吸光度为450nm的细胞的光密度，检测细胞活力。

CCK-8结果如图4所示，使用不同浓度的AKBA与BMMs细胞共同培养48h或72h，当AKBA的浓度小于30μM时，对BMMs细胞的增殖无明显影响。

实施例7破骨细胞骨吸收能力

1.骨吸收培养板检测破骨细胞的骨吸收能力

(1)将BMMs细胞调整细胞密度为100万/mL，在24孔骨吸收培养板(OAP，美国)中每孔加入1万个细胞；

(2)先用不同浓度的AKBA(0，0.1，1，15μM)预处理细胞4h，再逐渐加入RANKL来诱导BMMs细胞分化成破骨细胞，RANKL的最终浓度为50ng/mL，共培养5d；

(3)待破骨细胞成熟后，去除原有的培养基，用PBS溶液反复冲洗三次，然后用超声清洗仪反复冲洗贴附在OAP板表面上的破骨细胞至所有的细胞被清除干净；

(4)在倒置显微镜下观察OAP板表面的侵蚀程度并截取每组骨吸收陷窝图像；

(5)运用显微镜计算机图像分析系统(Image-Proplus 6.0)进行分析计算每组骨吸收陷窝面积比[骨吸收陷窝面积比＝骨吸收陷窝面积/培养孔面积]。

RANKL诱导的破骨细胞分化结果如图5所示，AKBA对RANKL诱导的破骨细胞分化具有明显的抑制作用，采用不同浓度的AKBA(0，0.1，1，15μM)预处理细胞，RANKL诱导的破骨细胞形成明显受到抑制(图5A)。随着AKBA浓度的增加，TRAP阳性细胞数量明显减少以及TRAP阳性细胞面积明显减小(图5B和C)。统计结果显示，AKBA组(0，0.1，1，15μM)TRAP阳性细胞数量以及TRAP阳性细胞面积与对照组比较，差异有统计学意义(*p<0.05，**p<0.01)。

OAP板培养结果如图6所示，对照组可看见明显骨吸收陷窝形成，显微镜下可见骨吸收陷窝边界清晰，呈圆形、椭圆形或不规则形；当加入不同浓度AKBA(0，0.1，1，15μM)处理后，骨吸收陷窝的面积随着AKBA浓度增加而逐渐减少，且差异越来越明显，具有浓度依赖性(图6A)。AKBA(1μM)组和AKBA(15μM)组骨吸收陷窝面积比(％)与对照组比较，差异有统计学意义(*p<0.05，**p<0.01)(图6B)。

2.鬼笔环肽染色

鬼笔环肽溶液的配制：

(1)鬼笔环肽试剂溶解：参照说明书，取500μL无水乙醇将鬼笔环肽固定粉末溶解成浓度为14μM的溶液。

(2)鬼笔环肽染液配制：参照说明书，取3.5μL鬼笔环肽溶液加入到500μL PBS中，配制成鬼笔环肽染液；每次都按照实验所需的染液量等比例配制。

(3)0.1％Triton X-100试剂配制：吸取10μL Triton X-100试剂加入到10mL PBS中，充分混匀，即配成0.1％Triton X-100试剂。

染色的具体实验步骤：

(1)破骨细胞的诱导及相关的药物处理参照上述1.骨吸收培养板检测破骨细胞的骨吸收能力的步骤(1)～(3)；

(2)将去除培养基用PBS反复清洗三次后的成熟破骨细胞，以4％多聚甲醛固定10min，然后用PBS反复清洗3次；

(3)再加入0.1％Triton X-100室温破膜3-5分钟后，用PBS反复清洗细胞3次；

(4)加入鬼笔环肽染液，以完全覆盖细胞为标准，在室温下避光孵育30min；

(5)反复用PBS清洗3次后，加入DAPI染液复染细胞核10min；

(6)再次反复用PBS清洗3次后，用荧光显微镜下观察并截取相应的图片。

鬼笔环肽染色结果如图7所示，从对照组中可以清楚地观察到破骨细胞分化良好的F-肌动蛋白环，而AKBA可以抑制破骨细胞F-肌动蛋白环的形成，与AKBA的浓度成正相关，且抑制作用呈浓度依赖性。

实施例8AKBA对相关蛋白的影响

蛋白电泳实验(Western blot)

1.试剂配制

(1)30％丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺29g，N,N’-亚甲丙烯酰胺1g，融于50mLddH₂O中，加热至37℃充分搅拌溶解，补足总体积至100mL，微孔滤膜过滤除菌，严格控制pH值不大于7.0，置于棕色瓶，4℃避光保存；

(2)2×SDS上样缓冲液：含有100mM Tris-HCl(pH 6.8)，200mM DTT，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油，4℃保存；

(3)1×电泳缓冲液：含25mM Tris-HCl(pH 8.8)，192mM甘氨酸，0.1％SDS，加ddH₂O稀释至1000mL，4℃保存；

(4)抗体稀释液(PBST)：20×PBS 50mL加ddH₂O稀释至1000mL，再加入1mL Tween-20；

(5)转膜缓冲液：取3.03g Tris碱，14.2g甘氨酸，加入150mL甲醇溶解，加ddH₂O水稀释至1000mL，4℃保存；

(6)封闭液：1.25g脱脂奶粉，1.25g BSA加PBST稀释至50mL，现配现用；

(7)抗体洗脱缓冲液：Tris-HCl 62.5mol/L(pH 6.8)，SDS 2％，β-巯基乙醇100mol/L，4℃保存；

(8)考马斯亮蓝染液：考马斯亮蓝-R2501.0g，10％冰醋酸100mL，异丙醇250mL，加ddH₂O稀释至1000mL，搅拌均匀，滤纸过滤，室温保存；

(9)考马斯亮蓝R-250脱色液：10％冰醋酸100mL，甲醇450mL,加ddH₂O稀释至1000mL，搅拌均匀，室温保存；

(10)TBST缓冲液：每2L体积中含：100mL Tris-HCL(1.0mol/L，pH7.5)，16g NaCl，0.4g KCL，1mL吐温。

2.细胞中蛋白上清液的制备和浓度测定

(1)将RAW264.7以5×10⁵个细胞/孔接种在6孔板上，当细胞完全长满后，用15μMAKBA预处理细胞4h，再加入50ng/mL RANKL分别刺激细胞0、5、15、30和60min，收集细胞。

(2)融解冻存的RIPA裂解液，混匀；取适量的裂解液，并且在使用前数分钟内从酶抑制剂三联装内吸取一定量的酶抑制剂，与裂解液混匀。

(3)按照细胞压积加入50μL裂解液，在振荡器上充分震荡数次，在12000rpm下离心5分钟，取上清液。

(4)吸取部分上清蛋白，并按照BCA蛋白浓度测定试剂盒中说明书指导，以测定蛋白浓度，具体步骤如下：

①将试剂盒中A液和B液以50：1的比例配制成工作液；

②取2000μg/mL的BSA蛋白标准品，用PBS(pH 7.4)稀释成浓度为2000μg/mL、1500μg/mL、1000μg/mL、750μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、25μg/mL、0μg/mL，共9个浓度梯度；

③取蛋白提取液10μL，用PBS稀释5倍；

④按照不同的浓度在试管中加入25μL蛋白标准品，在试管中加入25μL稀释后的组织蛋白提取液，并加入200μL步骤①中的工作液，于37℃恒温箱中温育30min，然后，用酶标仪测定蛋白标准品和稀释后的组织蛋白提取液于562nm处的吸光度，记录OD值；

⑤根据所测定的OD值及蛋白标准品浓度绘制相应的标准曲线，并计算出组织蛋白提取液中所含总蛋白的浓度。

3.配制12％的SDS-PAGE胶

(1)用蒸馏水清洗玻璃板，晾干，固定于制胶板上；

(2)在两块玻璃板之间加入10mL 12％分离胶，并加入TEMED 10μL、10％过硫酸铵100μL混匀，在分离胶上加入异丙醇封闭液以达到去除气泡和隔绝空气的目的，室温下静置45分钟，分离胶完全聚合后，用滤纸将多余的水吸干；

(3)在分离胶上层灌注5％浓缩胶5mL，并加入TEMED 5μL、10％APS 50μL混匀，待浓缩胶灌至顶部后，垂直插入Teflon齿梳(浓缩胶灌至平面以距离齿梳下缘2～3mm为宜，提前做好标记)，室温下静置20分钟，直至胶完全聚合；

(4)胶完全聚合后，小心拔出梳子，将分离胶置于电泳槽中，并用电泳缓冲液冲洗上样孔以去除气泡；

12％分离胶的配制：分离胶配比(5mL)：1.0mL ddH₂O，2.0mL 30％丙烯酰胺溶液，1.9mL Tris-HCL(1.5mol/L,pH 8.8)，0.05mL 10％SDS，0.05mL 10％过硫酸胺，0.002mLTEMED；

2.5％浓缩胶的配制：浓缩胶配比(1mL)：0.7mL ddH₂O，0.17mL 30％丙烯酰胺溶液，0.13mL Tris-HCL(1.0mol/L,pH 8.8)，0.01mL 10％SDS，0.01mL10％过硫酸胺，0.001mLTEMED；

(5)电泳：

①配制上样液：各组取相同质量(体积×蛋白质浓度)的蛋白提取液与等体积2×SDS上样缓冲液混合，配制成上样液；

②变性：将上样液用100℃沸水中煮沸5min，然后将装有上样液的离心管埋在冰块里，骤冷后，置于高速离心机中，3000转/min，离心1min；

③加样及电泳：取20μg步骤②的上样液加入到玻璃板的孔中，并留出一孔以加入10μL预染的Marker，用1×电泳缓冲液加满孔，槽盖盖上，接通电源，70V恒压电泳30min，当观察到溴酚蓝指示剂进入分离胶后改用90V恒压电泳，当发现指示剂到达距凝胶下缘约0.5cm处时关闭电源，并取出胶板；

④转膜：准备2张与分离胶同样大小的滤纸、2块海绵和PVDF膜，将PVDF膜预先浸泡在甲醇中15s，然后用去离子水漂洗PVDF膜2min，最后与转膜用的夹子、2块海绵一起浸泡在转膜缓冲液中浸泡5min后，备用；撬开玻璃板剥胶，做好标记，区分正、反面，将分离胶浸泡于转移缓冲液中15min；在转膜仪的阳极和阴极之间，按黑面(负极)→海绵→滤纸→分离胶→PVDF膜→滤纸→海绵→红面(正极)的顺序，每加一层均要用玻璃棒小心除去层间气泡，避免气泡影响转膜的过程；将转膜塑料板黑面对黑面(负极对负极)插入转膜槽中并向转膜槽中倾倒满预冷的转膜缓冲液，接上正负极，将转膜仪埋于冰中，恒流200mA转移70min；

⑤封闭：待转膜结束后，快速将PVDF膜取出，并浸泡于封闭液中，放在摇床上，在室温条件下封闭2h；随后将PVDF膜浸泡于TBST缓冲液中，放于摇床上洗膜3次，每次5min；

⑥加一抗：将PVDF膜浸泡于封闭液稀释的相应的抗体(GADPH 1:1000，IκBα1:1000，p-IκBα1:1000，p651:1000，p-p651:1000，ERK 1:1000，P-ERK 1:2000，JNK 1:1000,p-JNK 1:1000，p381:1000，p-p381:1000(Cell Signaling Technology，MA，USA)AKT 1:1000，p-AKT 1:5000，NFATc11:2000，c-Fos 1:5000)，4℃孵育过夜；

⑦洗膜：随后将与一抗共同孵育的PVDF膜浸泡于TBST缓冲液中，放于摇床上洗膜3次，每次5min；

⑧加二抗：将PVDF膜浸泡于辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1：2000)中，并于室温条件下孵育2h；

⑨洗膜：用TBST缓冲液洗膜15min×5次，将PVDF膜浸泡于化学发光检测试剂(试剂A：试剂B＝1：1)中约2min，随后取出PVDF膜，并吸去多余的液体，用保鲜膜将PVDF膜包紧，在暗室中用X胶片感光，并用显影液和定影液以显影和定影，最后用扫描仪将胶片上显示的条带扫描，并用Image J 6.0软件分析条带的相对灰度值。

Western blot结果如图8和图9所示，RANKL处理后，MAPK(ERK、P38、JNK)信号通路的活性明显增强；AKBA(15μM)预处理细胞4h后再加入RANKL诱导不同时间后，ERK的磷酸化水平明显降低，而p-AKT、p-p65、p-IκBa、p-p38和p-JNK的表达水平无明显差异。结果表明：AKBA能够抑制RANKL诱导的ERK信号通路活化。

为了进一步了解不同浓度AKBA是否对ERK信号通路有影响，使用不同浓度的AKBA(0、0.1、1、15μM)预处理RAW264.7细胞4小时，然后再用50ng/mL RANKL诱导细胞15分钟。Western blot实验结果如图10所示，ERK的磷酸化水平随着AKBA浓度的升高而逐渐降低，且这种抑制作用越来越明显，到浓度达到15μM时，ERK的磷酸化水平几乎完全被抑制了，说明AKBA抑制ERK信号通路的活化具有浓度依赖性(图10A)。

为了进一步探讨AKBA通过ERK信号通路起作用的环节，使用15μM的AKBA预处理RAW264.7细胞4h后，再使用50ng/mL RANKL分别诱导细胞0、5、15、30和60min。Western blot实验结果如图10所示，ERK上游因子MEK的磷酸化水平没有被AKBA抑制。RANKL诱导培养1、3d后，ERK下游因子c-Fos和NFATc1蛋白表达水平明显降低(图10B和C)。

本发明AKBA通过调控ERK信号通路抑制RANKL诱导的破骨细胞活化，减少TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子的释放，减轻了磨损颗粒引起的假体周围骨溶解。

本发明统计分析应用SPSS11.0统计软件(SPSS，Chicago，IL，USA)，数据以均数±标准差(x±s)表示，多样本间比较采用单因素方差分析，组间比较采用Tukey post-hocpairwise分析。统计运算前所有数据先用Bartlett检验方法进行方差齐性检验；若资料不符合方差分析的条件，采用Kruskal-Wallis秩和检验进行统计分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸在制备治疗假体周围骨溶解药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸在制备治疗假体周围骨溶解药物中的用途，其特征在于：所述治疗假体周围骨溶解为人工关节置换术后发生的假体周围骨溶解。

3.根据权利要求1所述的3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸在制备治疗假体周围骨溶解药物中的用途，其特征在于：所述3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸用于制备抑制破骨细胞活化过程中ERK信号通路活化的药物。

4.根据权利要求1所述的3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸在制备治疗假体周围骨溶解药物中的用途，其特征在于：所述药物包括活性成分3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸和药学上可接受的载体。

5.根据权利要求1所述的3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸在制备治疗假体周围骨溶解药物中的用途，其特征在于：所述3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸在药物中的质量分数为1～99％。

6.根据权利要求1所述的3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸在制备治疗假体周围骨溶解药物中的用途，其特征在于：将所述3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸制备成适用于胃肠道或非胃肠道给药的药物制剂。

7.根据权利要求6所述的3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸在制备治疗假体周围骨溶解药物中的用途，其特征在于：将所述3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸制备成适用于胃肠道的药物制剂，所述药物制剂为常规片剂或胶囊剂或控释、缓释制剂。

8.根据权利要求6所述的3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸在制备治疗假体周围骨溶解药物中的用途，其特征在于：将所述3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸制备成适用于非胃肠道的药物制剂，所述药物制剂为针剂。