CN108419607A - 一种糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法 - Google Patents

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李国庆
焦小雨
王燕
金青
张金云
聂凡
林毅
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Abstract

本发明公开了一种糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法。该种糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法包括制备PDA培养基;培养糙皮侧耳菌种;设置培养温度、料液比、秸秆粒度、表面活性剂剂量为实验因素,为每一个实验因素设置若干个水平;制备不同棉秸秆固体培养基,灭菌、接种、培养,测定棉秸秆固体培养基中木质素的含量,记录实验结果;依据上步实验结果,细化实验因素的水平,设计多组实验条件进行降解实验,测定各实验条件下剩余培养基的木质素含量,记录实验结果;根据分析结果,选择最佳水平组合,确定最佳的糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数。该种方法,合理设置实验条件,从而完成对木质素降解工艺参数的整体考量。

Description

一种糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法
技术领域
本发明涉及微生物降解技术领域,具体涉及一种糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法。
背景技术
农作物秸秆是农作物的副产品,农作物秸秆难以降解的主要原因是木质素的非水溶性和化学结构的复杂性,秸秆细胞壁中木质素与半纤维素以共价键形式结合,纤维素分子被包埋其中,使纤维素分子不易与酶接触,限制了消化酶对细胞壁及细胞内容物的分解功能。秸秆降解被限制的主要因素是木质素,棉秸秆中木质素含量较高,极大地限制了微生物的降解作用,也是棉秸秆难以利用的主要原因。
棉秸秆由于难以降解和利用,所以常被用来作加热燃料或者是直接遗弃。然而近年来,随着中国经济的发展和科技的进步,棉秸秆的燃料价值逐渐降低,与此同时,焚烧秸秆造成的环境污染问题也越来越引发人们的高度关注和重视。相对于传统的处理方法,生物降解法具有高效、环保、节约资源等多项优点。因此,研究糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法,对于改善生态环境,提高其产量具有一定的促进意义。
发明内容
为了解决上述背景中提到的问题,本发明目的在于提供一种糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法,包括以下步骤:
(1)制备PDA培养基;
(2)将贮存的糙皮侧耳菌种转接到PDA培养基上,在25℃、黑暗条件下培养7d,至菌丝长满平板;
(3)设置培养温度、料液比、秸秆粒度、表面活性剂剂量为实验因素,为每一个实验因素设置若干个水平;
(4)制备不同棉秸秆固体培养基,灭菌、接种、培养,测定棉秸秆固体培养基中木质素的含量,记录实验结果;
(5)依据实验结果,设置每一个实验因素的不同水平,设计实验因素及水平的多组实验条件;
(6)重复步骤(4);
(7)利用多因素方差分析方法对步骤(6)的实验结果进行分析;
(8)根据分析结果,选择最佳水平组合,确定最佳的糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数。
作为本发明进一步的方案:所述糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法,采用正交试验设计方法设置实验因素及水平的多组实验条件。
作为本发明进一步的方案:所述糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法,正交试验设计使用L9(34)正交表,具体包括培养温度、料液比、秸秆粒度、表面活性剂剂量四个实验因素,每个实验因素均设置三个水平。
本发明中棉秸秆固体培养基的制备方法包括以下步骤:称取5g过40目分样筛、粒径小于0.425mm的棉花秸秆干粉与250ml培养瓶中,加入22ml合成培养液,在121~125℃高温蒸汽下灭菌30min,即得。
本发明中合成培养液由酒石酸铵、大量元素、微量元素、VB1、水按照重量分数比1:15:15:3:16配置而成。
本发明中大量元素由以下按照重量份数的原料组成:KH2PO4 20份,MgSO4·7H2O13.8份,CaCl2 1份,NaCl 0.6份,MnSO4·H2O 0.35份,FeSO4·7H2O 60份和CoCl2·6H2O 110份。
本发明中微量元素由以下按照重量份数的原料组成:ZnSO4·7H2O 60份,CuSO4·5H2O 95份,AlK(SO4)2·12H2O 6份,H3BO3 6份和Na2MoO4·2H2O 6份。
本发明中 1升PDA培养基由200g去皮马铃薯、20g蔗糖、20g琼脂和1000ml水制成。
本发明中棉秸秆固体培养基中木质素含量采用Van Soest方法结合海能F800纤维测定仪测定,包括以下步骤:
(1)洗涤剂和样品准备,根据农业行业NY/T1459-2007标准,将酸性洗涤剂配好,待用,精确称取干燥样品0.5g(记为m),放入灰化好并带有硅藻土(使用前,将其用沸腾盐酸溶液[c(HCl)=4mol/L]处理,水洗至中性,在550℃下灰化1h)的坩埚内;
(2)酸性洗涤剂消煮,消煮管内添加100mL酸性洗涤剂,微沸状态下消煮60min,抽滤并洗涤数次至无气泡;
(3)洗涤,在冷浸提装置中先后加入丙酮和石油醚,洗涤,抽滤;
(4)二次洗涤,样品在冷浸提用12mol/L的硫酸溶液消解3h,并抽滤,洗涤至中性;
(5)干燥,放入真空干燥箱内,以130℃烘干2h,冷却称重m1;
(6)灰化,在550℃马弗炉中灰化2h,冷却称重为m2;
(7)计算结果:根据公式木质素含量(%) =
其中,m1──130℃烘干后坩埚及试样消煮后残渣重g;
m2──550℃灰化后坩埚及试样残渣重g;
m──试样(未脱脂)质量g;
本发明的糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法,合理设置实验条件,从而完成对木质素降解工艺参数的整体考量,不仅揭示了培养温度、料液比、秸秆粒度、表面活性剂剂量四个实验因素对糙皮侧耳降解木质素的影响,还揭示了各影响因素之间的相互作用关系,有效实现了工艺参数的优化,大幅提升了木质素降解的效率,对于改善生态环境,提高平菇产量具有一定的促进意义,也为糙皮侧耳处理棉秸秆的应用研究奠定了一定的基础。
附图说明
图1为本发明培养温度对糙皮侧耳降解棉秸秆木质素影响的示意图;
图2为本发明料液比对糙皮侧耳降解棉秸秆木质素影响的示意图;
图3为本发明秸秆粒度对糙皮侧耳降解棉秸秆木质素影响的示意图;
图4为本发明表面活性剂剂量对糙皮侧耳降解棉秸秆木质素影响的示意图;
图5为本发明多因素对糙皮侧耳降解棉秸秆木质素影响的示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实验菌种采用的糙皮侧耳苏平1号是由江苏省农科院蔬菜研究所提供的商品化菌株。
表面活性剂采用吐温80。
一、培养温度对糙皮侧耳降解棉秸秆木质素的影响
实施例1
本发明实施例中,一种糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法,用打孔器从已培养7d的PDA培养基上取3块直径为1cm的菌块接种到棉秸秆固体培养基上,在20℃黑暗条件下培养20天后测定剩余培养基的木质素含量。
实施例2
本发明实施例中,一种糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法,用打孔器从已培养7d的PDA培养基上取3块直径为1cm的菌块接种到棉秸秆固体培养基上,在25℃黑暗条件下培养20天后测定剩余培养基的木质素含量。
实施例3
本发明实施例中,一种糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法,用打孔器从已培养7d的PDA培养基上取3块直径为1cm的菌块接种到棉秸秆固体培养基上,在27℃黑暗条件下培养20天后测定剩余培养基的木质素含量。
实施例1~3中剩余木质素含量如表1和图1所示。
表1培养温度对糙皮侧耳降解木质素的影响
组别 木质素含量(%)
实施例1 16.60±0.01a
实施例2 15.05±0.55b
实施例3 14.70±0.13b
注:同列标不同字母的表示差异显著(P<0.05),同列标相同字母的标志之间差异不显著(P>0.05)
由表1和图1数据可以看出,实施例2仅与实施例1差异显著(P<0.05),与实施例3差异不显著(P>0.05),且在27℃时,棉秸秆固体培养基中的木质素含量最低,且随着温度降低,木质素的含量逐渐升高,说明在一定温度范围内,糙皮侧耳降解木质素的能力随着温度升高而升高,即糙皮侧耳菌的活力随着温度的升高而升高。
二、料液比对糙皮侧耳降解棉秸秆木质素的影响
实施例4
本发明实施例中,一种糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法,称取5g过40目分样筛的棉秸秆粉末置于培养瓶中,之后加入合成培养液10ml使得料液比(w/v)为1:2,125℃高温蒸汽灭菌30min。之后从已培养7d的PDA培养基上取3块直径1cm的菌块接种于培养基上,在25℃黑暗条件下培养20天后测定剩余培养基的木质素含量。
实施例5
本发明实施例中,一种糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法,称取5g过40目分样筛的棉秸秆粉末置于培养瓶中,之后加入合成培养液15ml使得料液比(w/v)为1:3,125℃高温蒸汽灭菌30min。之后从已培养7d的PDA培养基上取3块直径1cm的菌块接种于培养基上,在25℃黑暗条件下培养20天后测定剩余培养基的木质素含量。
实施例6
本发明实施例中,一种糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法,称取5g过40目分样筛的棉秸秆粉末置于培养瓶中,之后加入合成培养液20ml使得料液比(w/v)为1:4,125℃高温蒸汽灭菌30min。之后从已培养7d的PDA培养基上取3块直径1cm的菌块接种于培养基上,在25℃黑暗条件下培养20天后测定剩余培养基的木质素含量。
实施例7
本发明实施例中,一种糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法,称取5g过40目分样筛的棉秸秆粉末置于培养瓶中,之后加入合成培养液25ml使得料液比(w/v)为1:5,125℃高温蒸汽灭菌30min。之后从已培养7d的PDA培养基上取3块直径1cm的菌块接种于培养基上,在25℃黑暗条件下培养20天后测定剩余培养基的木质素含量。
实施例4~7中剩余木质素含量如表2和图2所示。
表2料液比对糙皮侧耳降解木质素的影响
组别 木质素含量(%)
实施例4 15.57±1.31a
实施例5 13.88±0.01a
实施例6 15.20±0.17a
实施例7 14.47±0.13a
注:同列标不同字母的表示差异显著(P<0.05),同列标相同字母的标志之间差异不显著(P>0.05)
由图2和表2可以看出,料液比对于木质素降解率差异不显著(P>0.05)在料液比为1:2、1:3、1:4以及1:5四种实验数据中,当料液比为1:3时,棉秸秆中木质素的含量最低,即此时糙皮侧耳降解木质素的能力最强,此时糙皮侧耳菌的活力最高。
三、秸秆粒度对糙皮侧耳降解棉秸秆木质素的影响
实施例8
本发明实施例中,一种糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法,称取秸秆粒度为5mm的棉花秸秆于培养瓶中,加入22mL合成培养液,125℃高温蒸汽灭菌30min。从已培养7d的PDA培养基上取3块直径1cm的菌块接种于培养基上,在25℃黑暗条件下培养20天后测定剩余培养基的木质素含量。
实施例9
本发明实施例中,一种糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法,称取秸秆粒度为0.75mm的棉花秸秆于培养瓶中,加入22mL合成培养液,125℃高温蒸汽灭菌30min。从已培养7d的PDA培养基上取3块直径1cm的菌块接种于培养基上,在25℃黑暗条件下培养20天后测定剩余培养基的木质素含量。
实施例10
本发明实施例中,一种糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法,称取秸秆粒度为0.425mm的棉花秸秆于培养瓶中,加入22mL合成培养液,125℃高温蒸汽灭菌30min。从已培养7d的PDA培养基上取3块直径1cm的菌块接种于培养基上,在25℃黑暗条件下培养20天后测定剩余培养基的木质素含量。
实施例11
本发明实施例中,一种糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法,称取秸秆粒度为0.25mm的棉花秸秆于培养瓶中,加入22mL合成培养液,125℃高温蒸汽灭菌30min。从已培养7d的PDA培养基上取3块直径1cm的菌块接种于培养基上,在25℃黑暗条件下培养20天后测定剩余培养基的木质素含量。
实施例8~11中剩余木质素含量如表3和图3所示。
表3秸秆粒度对糙皮侧耳降解木质素的影响
组别 木质素含量(%)
实施例8 17.79±0.06a
实施例9 12.95±0.18d
实施例10 14.41±0.14c
实施例11 14.92±0.07b
注:同列标不同字母的表示差异显著(P<0.05),同列标相同字母的标志之间差异不显著(P>0.05)
由表3和图3可知,实施例8~11之间差异性显著,且在秸秆粒度为0.75mm时,棉秸秆固体培养基中木质素的含量最低,即此时糙皮侧耳降解木质素的力度最强。
四、表面活性剂剂量对糙皮侧耳降解棉秸秆木质素的影响
实施例12
本发明实施例中,一种糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法,在棉秸秆固体培养基中加入2.07μl吐温80,125℃高温蒸汽灭菌30min。从已培养7d的PDA培养基上取3块直径1cm的菌块接种于培养基上,在25℃黑暗条件下培养20天后测定剩余培养基的木质素含量。
实施例13
本发明实施例中,一种糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法,在棉秸秆固体培养基中加入4.14μl吐温80,125℃高温蒸汽灭菌30min。从已培养7d的PDA培养基上取3块直径1cm的菌块接种于培养基上,在25℃黑暗条件下培养20天后测定剩余培养基的木质素含量。
实施例14
本发明实施例中,一种糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法,在棉秸秆固体培养基中加入6.21μl吐温80,125℃高温蒸汽灭菌30min。从已培养7d的PDA培养基上取3块直径1cm的菌块接种于培养基上,在25℃黑暗条件下培养20天后测定剩余培养基的木质素含量。
实施例15
本发明实施例中,一种糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法,在棉秸秆固体培养基中加入8.28μl吐温80,125℃高温蒸汽灭菌30min。从已培养7d的PDA培养基上取3块直径1cm的菌块接种于培养基上,在25℃黑暗条件下培养20天后测定剩余培养基的木质素含量。
实施例16
本发明实施例中,一种糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法,在棉秸秆固体培养基中加入10.35μl吐温80,125℃高温蒸汽灭菌30min。从已培养7d的PDA培养基上取3块直径1cm的菌块接种于培养基上,在25℃黑暗条件下培养20天后测定剩余培养基的木质素含量。
实施例12~16中剩余木质素含量如表4和图4所示。
表4表面活性剂剂量对糙皮侧耳降解木质素的影响
组别 木质素含量(%)
实施例12 14.80±0.08a
实施例13 13.19±0.03d
实施例14 14.57±0.11b
实施例15 14.05±0.04c
实施例16 13.85±0.10c
注:同列标不同字母的表示差异显著(P<0.05),同列标相同字母的标志之间差异不显著(P>0.05)
由表4和图4可以看出,在表面活性剂剂量为0.4和0.5时,差异不显著(P>0.05),其它实施例差异显著(P<0.05),在表面活性剂剂量为0.2 g/L时,木质素的含量最低,说明此时糙皮侧耳菌的活力最强,降解木质素的能力最强。
五、多因素对糙皮侧耳降解棉秸秆木质素的影响
选取秸秆粒度、料液比、培养温度、表面活性剂剂量作为影响糙皮侧耳降解棉秸秆木质素的因素,进行4因素3水平的正交试验设计,见表5。多因素对糙皮侧耳降解棉秸秆木质素的影响,如表6和图5所示。
表5 正交试验因素水平
水平 A:秸秆粒度(mm) B:料液比(w/v) C:培养温度(℃) D:表面活性剂剂量(g/L)
1 0.50 1∶2 26 0.15
2 0.75 1∶3 27 0.20
3 1.00 1∶4 28 0.25
表6 多因素对糙皮侧耳降解木质素的影响
试验号 A B C D 木质素含量(%)
空白对照 24.4
1 3 3 2 3 18.04
2 2 1 2 2 23.17
3 1 3 1 2 12.62
4 3 1 1 1 19.47
5 2 2 1 3 17.85
6 3 2 3 2 17.87
7 1 1 3 3 14.86
8 1 2 2 1 14.62
9 2 3 3 1 21.50
由表6和图5可以看出,实验组3的木质素含量最低,即在表面活性剂剂量为0.2 g/L、料液比为1:4,秸秆粒度为0.5mm、培养温度在26℃的多因素条件下,糙皮侧耳降解木质素的能力最强,即此条件下糙皮侧耳菌活力最强,相反,在表面活性剂剂量为0.2g/L、料液比为1:2、秸秆粒度为0.75mm、培养温度为27的条件下,糙皮侧耳菌的活力最弱,降解木质素的能力最弱。
棉秸秆固体培养基中木质素含量的正交试验数据分析如表7所示。
表7棉秸秆固体培养基中木质素含量的正交实验数据分析
因素水平(K) A(秸秆粒度)mm B(料液比)w/v C(培养温度)℃ D(吐温含量)g/L
K1 42.10±0.09 57.49±0.43 49.96±0.61 55.58±0.55
K2 62.64±0.87 50.34±0.67 55.83±0.25 53.54±0.47
K3 55.61±0.88 52.15±0.36 54.23±0.51 50.75±0.51
R 20.55±0.92 7.15±0.52 5.89±0.42 4.83±0.11
由表7可知,棉秸秆木质素的降解率,影响最大的因素是秸秆粒度,其次是料液比,即A>B>C>D,当A1B2C1D3时,棉秸秆固体培养基中木质素的含量最低,即在秸秆粒度为0.5mm,料液比为1:3,培养温度为26℃,表面活性剂剂量为0.25g/L时,棉秸秆中木质素的降解率最高。
六、优化的工艺参数对糙皮侧耳降解棉秸秆木质素的影响
实施例17
本发明实施例中,一种糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法,称取秸秆粒度为0.5mm的棉秸秆5g于培养瓶中,后加入合成培养液15ml使得料液比(w/v)为1:3,再加入10.35μl吐温80,125℃高温蒸汽灭菌30min。从已培养7d的PDA培养基上取3块直径1cm的菌块接种于培养基上,在26℃黑暗条件下培养20天后测定剩余培养基的木质素含量。
表8 优化方法与常规方法对糙皮侧耳降解棉秸秆木质素的影响比较
组别 木质素含量(%)
实施例17 11.26±0.04a
实施例10 14.41±0.14b
注:同列标不同字母的表示差异显著(P<0.05),同列标相同字母的标志之间差异不显著(P>0.05)。
由表8可见,工艺参数优化方法(实施例17)实施后,培养基中木质素含量显著低于常规方法(实施例10),较常规方法,其木质素降解率提高了31.53%。
本发明研究了秸秆粒度、培养温度、料液比以及表面活性剂剂量对糙皮侧耳菌降解棉秸秆中木质素最佳条件的优化。通过正交试验得出了棉秸秆固体培养基中糙皮侧耳菌降解木质素的最佳条件,即在秸秆粒度为0.5mm,料液比为1:3,培养温度为26℃,吐温含量为0.25g/L时,棉秸秆中木质素的降解率最高,达53.85%。
对于本领域技术人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的细节,而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此,无论从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外,应当理解,虽然本说明书按照实施方式加以描述,但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案,说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见,本领域技术人员应当将说明书作为一个整体,各实施例中的技术方案也可以经适当组合,形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (3)

1.一种糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)制备PDA培养基;
(2)将贮存的糙皮侧耳菌种转接到PDA培养基上,在25℃、黑暗条件下培养7d,至菌丝长满平板;
(3)设置培养温度、料液比、秸秆粒度、表面活性剂剂量为实验因素,为每一个实验因素设置若干个水平;
(4)制备不同棉秸秆固体培养基,灭菌、接种、培养,测定棉秸秆固体培养基中木质素的含量,记录实验结果;
(5)依据实验结果,设置每一个实验因素的不同水平,设计实验因素及水平的多组实验条件;
(6)重复步骤(4);
(7)利用多因素方差分析方法对步骤(6)的实验结果进行分析;
(8)根据分析结果,选择最佳水平组合,确定最佳的糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数。
2.根据权利要求1所述的糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法,其特征在于:采用正交试验设计方法设置实验因素及水平的多组实验条件。
3.根据权利要求2所述的糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法,其特征在于:正交试验设计使用L9(34)正交表,具体包括培养温度、料液比、秸秆粒度、表面活性剂剂量四个实验因素,每个实验因素均设置三个水平。
CN201810186277.6A 2018-03-07 2018-03-07 一种糙皮侧耳降解棉秸秆的工艺参数优化方法 Pending CN108419607A (zh)

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