CN108410981B - 一种检测flt3-d835基因的试剂盒与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测FLT3‑D835基因的试剂盒，包括：针对EcoRV内切核酸酶识别位点GATATC设计的正向引物、针对EcoRV内切核酸酶识别位点GATATC设计的反向引物、PCR反应液Mix、纯水、EcoRV内切核酸酶及内切核酸酶缓冲液；相较于传统的D835酶切方法，本发明在自行设计引物的基础上，通过设计和调整酶切反应体系中酶活力单位与扩增产物的比例，可以提高内切酶对特异性序列的识别度；通过将酶切产物进行适当的预处理，可以降低检出结果模棱两可的现象。通过本发明所提供的在D835酶切过程中进行适当设计和改进，可以有效降低甚至消除D835野生型序列的阳性检出率，并且使检出结果更加明晰，同时为临床标本检测时常出现的假阳性问题和结果不明问题提供了解决方案。

Description

一种检测FLT3-D835基因的试剂盒与应用

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂领域，具体涉及一种检测FLT3-D835基因的试剂盒与应用。

背景技术

D835基因点突变是急性髓系白血病FLT3基因最重要的突变形式，突变频率占7％。野生型D835保留了EcoRV(一种限制性内切核酸酶)的酶切识别位点，可以被EcoRV识别并切开，电泳后产生短片段；突变型D835基因由于丧失了EcoRV特异性识别位点，所以不能被EcoRV酶切掉，电泳后产生长片段。在酶切反应中，需要对过程进行质控，所以要在引物区域的任意一点设计被EcoRV识别的内标序列，在D835基因野生/突变当中，内标序列总是被EcoRV识别并被切开。

用于检测FLT3-D835基因野生型位点的常规的检测方法，是在酶切后产生弱阳性结果，具体表现在所扩增的D835基因片段，有一部分不包含内标序列的识别序列总不被EcoRV识别并被切开。作为一种用于体外诊断的试剂盒，在检测临床标本中出现的假阳性过程中会降低试剂盒使用的准确性，对临床检测结果产生负面影响，特别对于D835基因突变丰度极低的标本来说，不能准确的判读实验结果，协助临床医生给出明确的治疗方案。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供FLT3-D835基因酶切反应体系的设计与应用的技术方法。该技术方法是采用了改进的酶切反应方法，包括针对EcoRV内切核酸酶识别位点GATATC引物的设计，包含有EcoRV内切核酸酶识别序列的FLT3-D835基因扩增产物酶切反应体系的改进，酶切产物电泳检测前的预处理三个过程。经过设计与改进，本发明可以消除野生型D835基因酶切后产生的假阳性质控结果，为临床标本提供更加明确的检出结果，更好对发生低丰度D835基因突变的患者进行用药指导，临床应用价值潜力巨大。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

一种检测FLT3-D835基因的试剂盒，包括：针对EcoRV内切核酸酶识别位点GATATC设计的正向引物、针对EcoRV内切核酸酶识别位点GATATC设计的反向引物、PCR反应液Mix、纯水、EcoRV内切核酸酶及内切核酸酶缓冲液；

所述针对EcoRV内切核酸酶识别位点GATATC设计正向引物的核苷酸序列如SEQ.ID.No1：

5’-CAGGAAACAGCTATGACCAGGAACGTGCTTGTCACCC-3’

所述针对EcoRV内切核酸酶识别位点GATATC设计反向引物的核苷酸序列如SEQ.ID.No2：

5’-ACGACGGCCAGTGATATCATAGCAGCCTCACATTGCCC-3’；

经EcoRV内切核酸酶识别位点的正向引物SEQ.ID.No1和反向引物SEQ.ID.No2PCR扩增后的D835扩增产物用于设计酶切反应体系进行酶切反应，酶切产物经处理过程预处理后用于电泳检测。

在上述方案的基础上，扩增后的FLT3-D835产物序列均包含EcoRV内切核酸酶识别位点GATATC。

在上述方案的基础上，所述针对EcoRV内切核酸酶识别位点GATATC设计的正向引物的核苷酸序列SEQ.ID.No1，包括一段与人类基因组序列非同源的接头序列；针对EcoRV内切核酸酶识别位点GATATC设计的反向引物的核苷酸序列SEQ.ID.No2，包括一段与人类基因组序列非同源的接头序列和内标序列。

在上述方案的基础上，所述酶切反应体系成分包括D835扩增产物、EcoRV内切核酸酶、内切核酸酶缓冲液以及纯水，将以上4种成分按照一定比例进行配制，将酶切反应体系置于37℃±1℃进行充分的酶切反应。

常规方法推荐的酶切反应体系成分包括文献已经公开的引物序列扩增后的D835扩增产物、EcoRV内切核酸酶、内切核酸酶缓冲液以及纯水，将以上4种成分按照常规方法推荐的使用量进行配制，将酶切反应体系置于37℃±1℃进行3h的酶切反应。

在上述方案的基础上，本发明所设计的酶切反应体系的各组分配制如下：

酶切反应体系组分	用量
		EcoRV内切核酸酶	0.0005ml
内切核酸酶缓冲液	0.0015ml
		纯水	0.010ml
D835扩增产物	0.003ml

所述的常规方法推荐的酶切反应体系的各组分配制如下：

酶切反应体系组分	用量
		EcoRV内切核酸酶	0.0010ml
内切核酸酶缓冲液	0.0010ml
		纯水	0.008ml
D835扩增产物	0.005ml

经文献已经公开的引物序列PCR扩增后的D835产物应用于常规方法推荐的酶切反应体系进行酶切反应，将酶切产物按照处理过程进行预处理，然后进行电泳。

在上述方案的基础上，所述处理过程的具体过程为：取出经SEQ.ID.No1和SEQ.ID.No2所示的引物序列扩增后的酶切产物，往反应体系中加入一定量的补充液，然后与上样缓冲液进行1:3的比例混合，使总体系达到0.004ml，经混合物充分振荡混匀，离心后得到预处理液。

常规方法推荐的处理过程，经文献已经公开的引物序列PCR扩增后的酶切产物与预处理液、分子量内标进行充分混合后，95℃变性5min，4℃冷却3min，然后进行电泳。

在上述方案的基础上，所述电泳检测体系的总体积为0.010ml，其中，预处理液、分子量内标与酶切产物按照8.9:0.1:1的比例进行配制。

在上述方案的基础上，所述的电泳检测体系配制如下：

电泳检测体系	用量
		预处理液	0.0089ml
分子量内标	0.0001ml
		50×D835酶切产物	0.001ml

所述的常规方法推荐的电泳检测体系配制如下：

电泳检测体系	用量
		预处理液	0.0085ml
分子量内标	0.0005ml
		D835酶切产物	0.001ml

本发明所述的一种FLT3-D835酶切反应体系的设计与应用，具有如下优点：相较于传统的D835酶切方法，本发明在自行设计引物的基础上，通过设计和调整酶切反应体系中酶活力单位与扩增产物的比例，可以提高内切酶对特异性序列的识别度；通过将酶切产物进行适当的预处理，可以降低检出结果模棱两可的现象。通过本发明所提供的在D835酶切过程中进行适当设计和改进，可以有效降低甚至消除D835野生型序列的阳性检出率，并且使检出结果更加明晰，同时为临床标本检测时常出现的假阳性问题和结果不明问题提供了解决方案。

附图说明

本发明有如下附图：

图1为同一份D835野生型标本常规处理后普通凝胶电泳图。

图2为不同D835野生型标本常规处理后的普通凝胶电泳图。

图3为同一份D835野生型标本按照酶切产物处理过程预处理后的普通凝胶电泳图。

图4为不同D835野生型标本按照酶切产物处理过程预处理后的普通凝胶电泳图。

图5为同一份D835野生型标本常规处理后普通凝胶电泳峰谱图。

图6为不同D835野生型标本常规处理后的普通凝胶电泳峰谱图。

图7为同一份D835野生型标本按照酶切产物处理过程预处理后的普通凝胶峰谱图。

图8为不同D835野生型标本按照酶切产物处理过程预处理后的普通凝胶峰谱图。

具体实施方式

以下结合附图1-8对本发明作进一步详细说明。

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明的一个因素。

实施例1：D835扩增反应体系A的配制

具体操作为：用于扩增的PCR反应体系为0.025ml，并且所设计的引物针对EcoRV内切核酸酶识别位点GATATC的情况，包括正向引物序列SEQ.ID.No1和反向引物序列SEQ.ID.No2，2×PCR反应液Mix以及纯化水，其中正、反向引物序列浓度0.4uM，2×PCR反应液Mix用量12.5uL，纯水8.5uL，将上述反应组分充分混合后加入2uL阴性标本DNA溶液，充分混匀离心后置于基因扩增仪进行PCR反应，注意在离心过程中不要产生气泡。

实施例2：经设计优化后的D835酶切反应体系

具体操作为：经SEQ.ID.No1-2所示的引物序列PCR扩增后的D835产物用于酶切反应。所用的酶切反应总体系为0.015ml，将实施例1的D835扩增产物取0.003ml于PCR反应管中，然后加入内切核酸酶缓冲液、EcoRV内切核酸酶与纯水，其中所用的内切核酸酶缓冲液是0.0015ml，内切核酸酶酶活单位10U，然后用纯水将酶切反应体系补足至总体系为0.015ml，用移液枪吸打混匀数秒以充分将每个组分混匀，注意不要产生气泡。然后置于恒温37℃±1℃充分反应60min。

实施例3：常规方法的D835酶切反应体系

具体操作为：经文献已经公开的引物序列PCR扩增后的D835产物用于酶切反应。所用的酶切反应总体系为0.015ml，将扩增产物取0.005ml于PCR反应管中，然后加入内切核酸酶缓冲液、EcoRV内切核酸酶与纯水，其中所用的内切核酸酶缓冲液是0.0010ml，EcoRV内切核酸酶酶活单位20U，然后用纯水将酶切反应体系补足至总体系为0.015ml，用移液枪吸打混匀数秒以充分将每个组分混匀，注意不要产生气泡。然后置于恒温37℃±1℃充分反应180min。

实施例4：经SEQ.ID.No1和SEQ.ID.No2所示的引物序列PCR扩增后酶切产物的处理过程

具体操作为：取出经SEQ.ID.No1和SEQ.ID.No2所示的引物序列扩增后的酶切反应产物，往反应体系中加入一定量的补充液，然后与上样缓冲液进行1:3的比例混合，使总体系达到0.004ml，经混合物充分振荡混匀，离心后得到预处理液。

实施例5：经文献已经公开的引物序列PCR扩增后D835酶切产物的处理过程

具体操作为：取出经文献已经公开的引物序列PCR扩增后酶切反应产物，然后与上样缓冲液进行1:3的比例混合，使总体系达到0.004ml，经混合物充分振荡混匀，离心后得到预处理液。

实施例6：一种FLT3-D835酶切反应体系的设计与应用的质量评价标准。

具体操作为：检测前酶切产物的预处理过程的电泳检测结果为D835野生型酶切片段谱峰位于46bp±3bp，80bp±4bp，没有128bp±10bp的阳性片段谱峰或者整合峰面积≤10％。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施方式只局限于这些说明。对于本发明所述技术领域的普通人员来说，在不脱离不发明构思的前提下，可以做出若干简单推演或替换，都应视为本发明的保护范围。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

Claims (3)

1.一种检测FLT3-D835基因的试剂盒，其特征在于：包括：针对EcoRV内切核酸酶识别位点GATATC设计的正向引物、针对EcoRV内切核酸酶识别位点GATATC设计的反向引物、PCR反应液Mix、纯水、EcoRV内切核酸酶及内切核酸酶缓冲液；

所述针对EcoRV内切核酸酶识别位点GATATC设计正向引物的核苷酸序列如SEQ.ID.No1：

5’-CAGGAAACAGCTATGACCAGGAACGTGCTTGTCACCC-3’

所述针对EcoRV内切核酸酶识别位点GATATC设计反向引物的核苷酸序列如SEQ.ID.No2：

5’-ACGACGGCCAGTGATATCATAGCAGCCTCACATTGCCC-3’；

经EcoRV内切核酸酶识别位点的正向引物SEQ.ID.No1和反向引物SEQ.ID.No2 PCR扩增后的D835扩增产物用于设计酶切反应体系进行酶切反应，酶切产物经处理过程预处理后用于电泳检测；

所述酶切反应体系成分包括D835扩增产物、EcoRV内切核酸酶、内切核酸酶缓冲液以及纯水，将以上4种成分按照一定比例进行配制，将酶切反应体系置于37℃±1℃进行充分的酶切反应；

所述酶切反应体系的总体积为0.015ml，其中，EcoRV内切核酸酶用量为0.0010ml，内切核酸酶缓冲液为0.0010ml，纯水为0.008ml，D835扩增产物0.003ml；

所述处理过程的具体过程为：取出经SEQ.ID.No1和SEQ.ID.No2所示的引物序列扩增后的酶切产物，往反应体系中加入一定量的补充液，然后与上样缓冲液进行1:3的比例混合，使总体系达到0.004ml，经混合物充分振荡混匀，离心后得到预处理液。

2.如权利要求1所述的检测FLT3-D835基因的试剂盒，其特征在于：扩增后的FLT3-D835产物序列均包含EcoRV内切核酸酶识别位点GATATC。

3.如权利要求1所述的检测FLT3-D835基因的试剂盒，其特征在于：所述针对EcoRV内切核酸酶识别位点GATATC设计的正向引物的核苷酸序列SEQ.ID.No1，包括一段与人类基因组序列非同源的接头序列；针对EcoRV内切核酸酶识别位点GATATC设计的反向引物的核苷酸序列SEQ.ID.No2，包括一段与人类基因组序列非同源的接头序列和内标序列。

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