CN108410753B - 一种降解秸秆的复合菌剂及其制备方法、降解秸秆的方法 - Google Patents

一种降解秸秆的复合菌剂及其制备方法、降解秸秆的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种降解秸秆的复合菌剂及其制备方法、降解秸秆的方法，利用长形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides)和杰米拉类芽孢杆菌(Paenibacillus barcinonensis)混合培养，即得降解秸秆的复合菌剂，能够产生较高活力的果胶酶、纤维素酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶等，酶系成分较多，相互协调，共同作用于稻秆，降解稻秆果胶质、纤维素、半纤维素、木质素等成分，实现稻秆快速充分降解。

Description

一种降解秸秆的复合菌剂及其制备方法、降解秸秆的方法
技术领域
本发明属于微生物菌剂领域，具体涉及一种降解秸秆的复合菌剂及其制备方法、降解秸秆的方法。
背景技术
农村庄稼收获后，秸秆数量巨大，除了部分用于饲料，其余大部分用作烧柴，有的不方便运回家就地焚烧，没有充分利用发挥其价值。其实农作物秸秆是个宝，它含有大量有机质、氮、磷、钾和作物所需要的微量元素，利用得好是一种非常好的肥料资源。
秸秆生物降解技术就是利用能够降解秸秆与对土壤有改良作用的微生物菌种配伍，将农作物秸秆转化为新一代植物可以直接利用的二氧化碳、有机质、微量元素，释放热量，实现营养有效循环，从而使农作物瓜、果、蔬菜改变品质，提高产量，显著提高经济效益，也改善了农村生态环境，一亩地大棚消耗4亩地秸秆，有效解决就地焚烧和乱堆乱放污染环境，实现了能源循环利用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种降解秸秆的复合菌剂及其制备方法，利用从环境土壤中分离获得并经分子鉴定的长形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides)和杰米拉类芽孢杆菌(Paenibacillus barcinonensis)混合培养，即得。
本发明还提供了一种降解秸秆的方法，利用所制备的复合菌剂，高效降解秸秆。
本发明提供的一种降解秸秆的复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
将长形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides)和杰米拉类芽孢杆菌(Paenibacillus barcinonensis)一同接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中混合培养，得到复合菌剂；
所述杰米拉类芽孢杆菌(Paenibacillus barcinonensis)已于2017年11月6日保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCC No.14862；所述长形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides)已于2017年11月6日保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCC No.14863。
进一步的每毫升菌剂中总菌数为1-9*109个。
进一步，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基制备方法为：
取牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g和水1000mL，pH为7.4-7.6，然后在121℃湿热灭菌30min，即可。
进一步的，所述混合培养条件为：在37℃±2℃温度条件下，180±10r/min摇床培养18～24h。
进一步的，长形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides)和杰米拉类芽孢杆菌(Paenibacillus barcinonensis)按照体积比例1:1接种。
本发明提供的一种降解秸秆的复合菌剂，采用上述方法制备得到。
本发明提供的一种降解秸秆的方法，包括以下步骤：
1)制备液体发酵产酶培养基，将复合菌剂接种到液体发酵产酶培养基上，培养，得到发酵液；
2)制备与步骤1)相同的液体发酵产酶培养基，加入秸秆和步骤1)制备的发酵液，降解秸秆。
进一步的，步骤1)中所述的液体发酵产酶培养基制备方法为：
取KH2PO4 1.00g、CaCl2 0.10g、MgSO4·7H2O 0.30g、NaCl 0.10g、FeCl3 0.01g和(NH4)2SO4 3.50g，混合，加水定容至1000ml，即可。
步骤1)中液体发酵产酶培养基接种3％的复合菌剂，以体积分数计。
步骤1)所述培养是指37℃±2℃条件下，180±10r/min摇床培养1天，得发酵液。
步骤2)中每100ml液体发酵产酶培养基中加入2.5g秸秆。所述秸秆干燥至恒重，长度为2-3cm。
步骤2)中加入的步骤1)制备的发酵液是液体发酵产酶培养基的体积的3％。
步骤2)中降解秸秆是指37℃±2℃温度下在180±10r/min摇床速度下降解。
降解的秸秆优选是稻秸。
本发明提供的采用长形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides XJA1)和杰米拉类芽孢杆菌(Paenibacillus barcinonensis XJH1)混合培养制备的菌剂降解秸秆，能够高效降解秸秆，尤其是稻秸。
与现有技术相比，本发明提供的复合菌剂能够产生较高活力的果胶酶、纤维素酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶等，酶系成分较多，相互协调，共同作用于稻秆，降解稻秆果胶质、纤维素、半纤维素、木质素等成分，实现稻秆快速充分降解。利用发酵液降解稻秆不仅降低了牛肉膏蛋白胨液体培养基的使用成本，而且能够帮助复合菌剂更快地适应在液体发酵产酶培养基中降解稻秆。本发明设计的培养条件可以加快菌种的繁殖促进稻秆的降解。
具体实施方式
实施例1
一种降解秸秆的复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
取安徽省芜湖市周边附近农田的富含稻秆的土壤样品30g加5g稻秆段及去离子水250ml摇瓶富集15天后，取土壤溶液稀释成10-1至10-6不同梯度，分别取0.1ml涂布到秸秆粉培养基、刚果红-纤维素培养基上37℃±2℃培养2～3d，挑选在秸秆粉培养基上长势好的且透明圈大的单菌落反复平板划线培养直至获得纯菌种。经分子鉴定XJA1和XJH1分别为长形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides)和杰米拉类芽孢杆菌(Paenibacillusbarcinonensis)。
将长形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides)和杰米拉类芽孢杆菌(Paenibacillus barcinonensis)按照1:1的比例一同接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在37℃±2℃温度条件下，180±10r/min摇床培养18～24h，得到复合菌剂，每毫升菌剂中总菌数为1-9*109个。
所述牛肉膏蛋白胨液体培养基制备方法为：
取牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g和水1000mL，pH为7.4-7.6，然后在121℃湿热灭菌30min，即可。
实施例2
一种降解秸秆的方法，包括以下步骤：
1)制备液体发酵产酶培养基，将复合菌剂按照3％的比例接种到液体发酵产酶培养基上，37℃±2℃条件下，180±10r/min摇床培养1天，得到发酵液；
所述的液体发酵产酶培养基制备方法为：
取KH2PO4 1.00g、CaCl2 0.10g、MgSO4·7H2O 0.30g、NaCl 0.10g、FeCl3 0.01g和(NH4)2SO4 3.50g，加水定容至1000ml，即可。
2)制备与步骤1)相同的液体发酵产酶培养基100ml，加入秸秆2.5g(秸秆干燥至恒重，长度为2-3cm)和液体发酵产酶培养基的3％的步骤1)制备的发酵液，37℃±2℃温度下在180r/min摇床速度下降解秸秆。
发酵一天后，培养基出现较为明显的浑浊，能够看见小部分稻秆段已经破碎；两天后，培养基浑浊度加深，又有部分稻秆段破碎；到第三天时，培养基浑浊度已经非常明显了，大部分的稻秆段已经破碎成丝状，无复合菌剂处理的空白对照组残余稻秆干重为2.13g，而复合菌剂处理后的实验组残余稻秆干重为1.12g，降解率达47.42％；到第七天时，只有少量段状稻秆存在，绝大部分的稻秆降解成丝状、屑状，空白对照组残余稻秆干重为2.13g，而复合菌剂处理后的实验组残余稻秆干重为0.94g，稻秆降解率达55.87％，适合用于稻秆原位降解还田，且降解后的稻秆发酵液成分丰富，可用于肥料开发等。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽师范大学
<120> 一种降解秸秆的复合菌剂及其制备方法、降解秸秆的方法
<130> 1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1434
<212> DNA
<213> 菌株XJA1基因序列：
<400> 1
accttcggcg gctggctcca aaaggttacc tcaccgactt cgggtgttac aaactctcgt 60
ggtgtgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcggcat gctgatccgc 120
gattactagc gattccggct tcatgtaggc gagttgcagc ctacaatccg aactgagaac 180
gactttatcg gattagctcc ctctcgcgag ttggcaaccg tttgtatcgt ccattgtagc 240
acgtgtgtag cccaggtcat aaggggcatg atgatttgac gtcatcccca ccttcctccg 300
gtttgtcacc ggcagtcacc ttagagtgcc caactaaatg atggcaacta agatcaaggg 360
ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga caaccatgca 420
ccacctgtca ccgttgcccc cgaaggggaa actatatctc tacagtggtc aacgggatgt 480
caagacctgg taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg 540
cgggcccccg tcaattcctt tgagtttcag tcttgcgacc gtactcccca ggcggagtgc 600
ttaatgcgtt agctgcagca ctaaggggcg gaaaccccct aacacttagc actcatcgtt 660
tacggcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgtttgctcc ccacgctttc gcgcctcagc 720
gtcagttaca gaccagaaag tcgccttcgc cactggtgtt cctccaaatc tctacgcatt 780
tcaccgctac acttggaatt ccactttcct cttctgcact caagtccccc agtttccaat 840
gaccctccac ggttgagccg tgggctttca catcagactt aaaggaccgc ctgcgcgcgc 900
tttacgccca ataattccgg acaacgcttg ccacctacgt attaccgcgg ctgctggcac 960
gtagttagcc gtggctttct aataaggtac cgtcaaggta cagccagtta ctactgtact 1020
tgttcttccc ttacaacaga gttttacgat ccgaaaacct tcttcactca cgcggcgttg 1080
ctccatcagg ctttcgccca ttgtggaaga ttccctactg ctgcctcccg taggagtctg 1140
ggccgtgtct cagtcccagt gtggccgatc accctctcag gtcggctacg catcgtcgcc 1200
ttggtgagcc gttacctcac caactagcta atgcgccgcg ggcccatcct atagcgacag 1260
ccgaaaccgt ctttcagtct ttcaccatga agcaaaagag attattcggt attagccccg 1320
gtttcccgga gttatcccaa actatagggt aggttgccca cgtgttactc acccgtccgc 1380
cgctaacgtc aaaggagcaa gctccttttc tgttcgctcg acttgcatgt atta 1434
<210> 2
<211> 1469
<212> DNA
<213> 菌株XJH1基因序列
<400> 2
aaccttcggc ggctggctcc ttgcggttac cccaccgact tcgggtgtta taaactctcg 60
tggtgtgacg ggcggtgtgt acaagacccg ggaacgtatt caccgcggca tgctgatccg 120
cgattactag caattccgac ttcatgcagg cgagttgcag cctgcaatcc gaactgagac 180
cggcttttta ggattggttc cacctcgcgg cttcactgcc cgttgtaccg gccattgtag 240
tacgtgtgta gcccaggtca taaggggcat gatgatttga cgtcatcccc accttcctcc 300
ggtttgtcac cggcagtcta tttagagtgc ccatccgaaa tgctggcaac taaatataag 360
ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacaaccatg 420
caccacctgt ctcaactttc cccgaagggc acctaacgca tctctgcctc gttagttgga 480
tgtcaagacc tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatac tccactgctt 540
gtgcgggtcc ccgtcaattc ctttgagttt cagtcttgcg accgtactcc ccaggcggaa 600
tgcttaatgt gttaacttcg gcaccaaggg tatcgaaacc cctaacacct agcattcatc 660
gtttacggcg tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct ttcgcgcctc 720
agcgtcagtt acagcccaga gagtcgcctt cgccactggt gttcctccac atctctacgc 780
atttcaccgc tacacgtgga attccactct cctcttctgc actcaagtca cgcagtttcc 840
agtgcgatcc ggggttgagc cccgggatta aacaccagac ttacatgacc gcctgcgcgc 900
gctttacgcc caataattcc ggacaacgct tgccccctac gtattaccgc ggctgctggc 960
acgtagttag ccggggcttt cttctcaggt accgtcacct tgagagcagt tactctccca 1020
agcgttcttc cctggcaaca gagctttacg atccgaaaac cttcatcact cacgcggcat 1080
tgctccgtca ggctttcgcc cattgcggaa gattccctac tgctgcctcc cgtaggagtc 1140
tgggccgtgt ctcagtccca gtgtggccga tcaccctctc aggtcggcta cgcatcgtcg 1200
ccttggtgag ccgttacctc accaactagc taatgcgccg caggcccatc ctcaagtgac 1260
agattgctcc gtctttccag ttcccttcag gcgaagaaaa caagtattcg gtattagcta 1320
ccgtttccgg tagttgtccc aagcttgagg gcaggttgcc tacgtgttac tcacccgtcc 1380
gccgctaagt ctcaggaaag caagctttcc atcaactccg ctcgacttgc atgtattagg 1440
catgccgcca gcgttcgtcc tgagccagg 1469

Claims (10)

1.一种降解秸秆的复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
将长形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides)和杰米拉类芽孢杆菌(Paenibacillus barcinonensis) 一同接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中混合培养，得到复合菌剂；
所述杰米拉类芽孢杆菌(Paenibacillus barcinonensis)保藏号CGMCC No.14862；所述长形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides)保藏号CGMCC No.14863。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，每毫升菌剂中总菌数为（1-9）×109个。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述混合培养条件为：在 37℃±2℃温度条件下，180±10 r/min摇床培养18~24h。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，长形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides)和杰米拉类芽孢杆菌(Paenibacillus barcinonensis) 按照体积比例1:1接种。
5.一种降解秸秆的复合菌剂，其特征在于，采用权利要求1-4任一项所述的方法制备得到。
6.一种利用权利要求5所述的复合菌剂降解秸秆的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）制备液体发酵产酶培养基，将复合菌剂接种到液体发酵产酶培养基上，培养，得到发酵液；
2）制备与步骤1）相同的液体发酵产酶培养基，加入秸秆和步骤1）制备的发酵液，降解秸秆。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1）中液体发酵产酶培养基接种3%的复合菌剂，以体积分数计。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤1）所述培养是指37℃±2℃条件下，180±10 r/min摇床培养1天，得发酵液。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2）中每100ml液体发酵产酶培养基中加入2.5g秸秆。
10.根据权利要求6或9所述的方法，其特征在于，加入的步骤1）制备的发酵液是液体发酵产酶培养基的3%。
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