CN108409661A - 一种利用黑曲霉分离提取吡唑草胺的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用黑曲霉分离提取吡唑草胺的方法，包括（1）浸膏的制备取黑曲霉发酵菌丝体置于鼓风干燥箱中，55℃烘至恒重，磨粉，过60目筛得菌粉，将菌粉用丙酮以1：4的重量比提取3次得黑曲霉提取液，并将该提取液浓缩至3%的浓度；（2）硅胶柱层析；（3）反向柱层析；（4）再次柱层析将步骤（3）中目标粗品再次进行硅胶柱处理，并用环己烷：丙酮洗脱，洗脱液浓缩干燥得白色粉末，即为吡唑草胺类成分。该方法具有底物廉价易得，提取工艺简单、易行，生产过程环保、溶剂残留少、污染低、培养基质容易获得等优点，为吡唑草胺今后的扩大生产提供了良好的前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种吡唑草胺的分离提取方法，特别是利用黑曲霉分离提取吡唑草胺的方法。
背景技术
吡唑草胺(metazachlor)化学名称2-氯-N-(2,-二甲基苯基)-N-(1H-吡唑-1-基甲基)乙酰胺，是德国巴斯夫公司（BASF AG）开发的乙酰苯胺类除草剂，商品名为Butisan S。吡唑草胺是一种乙酰苯胺类低毒选择性除草剂，可有效防除风草、鼠尾看麦娘、野燕麦、马唐、稗草、早熟禾、狗尾草等一年生禾本科杂草及苋草、母菊、蓼、芥、茄、繁缕、荨麻、婆婆纳等阔叶杂草，广泛用于大豆、马铃薯、烟草和移植甘蓝田中防除禾本科和双子叶杂草，具有对作物安全、除草能力强等优点。文献报道吡唑草胺的合成方法主要有两种，酰化法和甲叉法。酰化法需要在三氯化磷的存在下和二甲苯回流下实现，反应的条件苛刻、污染大，不利于工业化生产。甲叉法副产物较多，收率不高。两种方法都需要使用大量的有毒易挥发的有机溶剂，后续处理过程需要增加溶剂蒸馏回收套用的过程，增加了合成过程中三废的排放和能源的消耗。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种利用黑曲霉分离提取吡唑草胺的方法。该方法具有底物廉价易得，提取工艺简单、易行，生产过程环保、溶剂残留少、污染低、培养基质容易获得等优点，为吡唑草胺今后的扩大生产提供了良好的前景。
本发明的技术方案：一种利用黑曲霉分离提取吡唑草胺的方法，包括（1）浸膏的制备；（2）硅胶柱层析；（3）反向柱层析；（4）再次柱层析。
前述的利用黑曲霉分离提取吡唑草胺的方法，具体包括以下步骤：
（1）浸膏的制备
取黑曲霉发酵菌丝体置于鼓风干燥箱中，55℃烘至恒重，磨粉，过60目筛得菌粉，将菌粉用丙酮以1：4的重量比提取3次得黑曲霉提取液，并将该提取液浓缩至3%的浓度；
（2）硅胶柱层析
用石油醚湿法装柱得到硅胶层析柱，将步骤（1）中浓缩液用溶剂溶解并与硅胶拌样，挥干溶剂后干法上样；用石油醚：丙酮梯度洗脱，分段收集洗脱液，薄层层析跟踪检测，合并相同组分，浓缩；
（3）反向柱层析
选取步骤（2）中极性适中浓缩组分用溶剂溶解与硅胶拌样，挥干溶剂后湿法上反向硅胶柱，并用纯净水：甲醇梯度洗脱，分段收集洗脱液，薄层层析跟踪检测，合并相同组分，浓缩得目标粗品；
（4）再次柱层析
将步骤（3）中目标粗品再次进行硅胶柱处理，并用环己烷：丙酮洗脱，洗脱液浓缩干燥得白色粉末，即为吡唑草胺类成分。
前述的利用黑曲霉分离提取吡唑草胺的方法，步骤（1）中，所述的将菌粉用丙酮以1：4的重量比提取3次得黑曲霉提取液；是将菌粉用丙酮以1：4的重量比，在加热温度为50-100℃，压力为0-1.0MPa条件下提取3次得黑曲霉提取液，时间为每次3h。
前述的利用黑曲霉分离提取吡唑草胺的方法，所述步骤（1）、步骤（2）、步骤（3）和/或步骤（4）中的浓缩是指采用旋转蒸发仪在温度40-60℃、压力为0.04-0.06MPa的条件下旋蒸。
前述的利用黑曲霉分离提取吡唑草胺的方法，步骤（2）、步骤（3）和/或所述步骤（4）中所述的硅胶颗粒尺寸为200-300目。
前述的利用黑曲霉分离提取吡唑草胺的方法，步骤（2）中，所述的用石油醚：丙酮梯度洗脱是；按石油醚：丙酮=1:0、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1进行洗脱。
前述的利用黑曲霉分离提取吡唑草胺的方法，步骤（3）中，所述并用纯净水：甲醇梯度洗脱是；按纯净水：甲醇=60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100进行洗脱。
前述的利用黑曲霉分离提取吡唑草胺的方法，步骤（4）中，所述的并用环己烷：丙酮洗脱是；按环己烷：丙酮=30:1进行洗脱。
前述的利用黑曲霉分离提取吡唑草胺的方法，步骤（2）、步骤（3）和/或步骤（4）中的洗脱剂的流速为15 mL/min。
前述的利用黑曲霉分离提取吡唑草胺的方法，所述的黑曲霉是；黑曲霉xj，该菌种已于2006年3月7日保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），保藏号：CCTCC NO：M 206021，名称为：黑曲霉xj（Aspergillus nigerxj）。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明利用黑曲霉xj在较单一的PDA培养基质中发酵制备吡唑草胺，可为解决吡唑草胺来源提供一条新途径。且黑曲霉（Aspergillus niger xj）菌株来源可靠，对温度、pH等自然环境条件的适应范围广，容易培养和保存，可作为分离提取吡唑草胺的供试菌株。该技术生产成本低，分离提取方法操作简单，重复性好，溶剂残留少且易回收，减少了能源的消耗和废气的排放，大大降低了环境污染。
附图说明：
图1是本发明方法提取的吡唑草胺EI-MS质谱分析图。
具体实施方式
下面对本发明作进一步的说明，但并不作为对发明限制的依据。
实施例1：
一种利用黑曲霉分离提取吡唑草胺的方法，包括以下步骤：
（1）浸膏的制备
取黑曲霉发酵菌丝体置于鼓风干燥箱中，55℃烘至恒重，磨粉，过60目筛得菌粉。将菌粉用丙酮以1：4的重量比提取3次得黑曲霉提取液，并将该提取液浓缩至3%的浓度；提取过程中加热温度为50-100℃，压力为0-1.0MPa，时间为每次3h；
（2）硅胶柱层析
用石油醚湿法装柱得到硅胶层析柱，将步骤（1）中浓缩样品用溶剂溶解并与硅胶拌样，挥干溶剂后干法上样；用石油醚：丙酮=1:0、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1梯度洗脱，流速为15mL/min，分段收集洗脱液，薄层层析跟踪检测，合并相同组分，浓缩，即采用旋转蒸发仪在温度40-60℃、压力为0.04-0.06MPa的条件下旋蒸至有机溶剂挥干；所述的硅胶颗粒尺寸为200-300目；
（3）反向柱层析
选取步骤（2）中极性适中浓缩组分用溶剂溶解与硅胶拌样，挥干溶剂后湿法上反向硅胶柱，用纯净水：甲醇梯度洗脱是；按纯净水：甲醇=60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100进行洗脱，流速为15mL/min，分段收集洗脱液，薄层层析跟踪检测，合并相同组分，采用旋转蒸发仪在温度40-60℃、压力为0.04-0.06MPa的条件下旋蒸至有机溶剂挥干，得目标粗品；所述的硅胶颗粒尺寸为200-300目；
（4）再次柱层析
将步骤（3）中目标粗品再次进行硅胶柱处理，并用环己烷：丙酮=30:1进行洗脱，流速为15mL/min，洗脱液采用旋转蒸发仪在温度40-60℃、压力为0.04-0.06MPa的条件下旋蒸至有机溶剂挥干，干燥得白色粉末，即为吡唑草胺类成分；所述的硅胶颗粒尺寸为200-300目；
所述的黑曲霉菌种已于2006年3月7日保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），保藏号：CCTCC NO：M 206021，名称为：黑曲霉xj（Aspergillus niger xj）。
黑曲霉（Aspergillus niger xj）提取物吡唑草胺的鉴定：
①样品的准备
取上述所得白色粉末过100目筛后,采用EI-MS对所述样品和吡唑草胺标样进行波谱解析分析
②EI-MS分析条件
质谱条件：离子源为EI源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70eV；发射电流34.6μA；倍增器电压1624Ｖ；接口温度280℃；质量范围29~500amu；溶剂延迟时间：5.0min。
③结论：通过EI-MS检测，从黑曲霉(Aspergillus niger xj)菌丝体分离提取得到的样品Rf值与标准品一致，该单体化合物为吡唑草胺，结构为(2-Chloro-N-(2,6-dimethylphenyl)-N-(1H-pyrazol -1-ylmethyl)acetamide)。结果见图1。
Claims (10)
1.一种利用黑曲霉分离提取吡唑草胺的方法，其特征在于：包括（1）浸膏的制备；（2）硅胶柱层析；（3）反向柱层析；（4）再次柱层析。
2.如权利要求1所述的利用黑曲霉分离提取吡唑草胺的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
（1）浸膏的制备
取黑曲霉发酵菌丝体置于鼓风干燥箱中，55℃烘至恒重，磨粉，过60目筛得菌粉，将菌粉用丙酮以1：4的重量比提取3次得黑曲霉提取液，并将该提取液浓缩至3%的浓度；
（2）硅胶柱层析
用石油醚湿法装柱得到硅胶层析柱，将步骤（1）中浓缩液用溶剂溶解并与硅胶拌样，挥干溶剂后干法上样；用石油醚：丙酮梯度洗脱，分段收集洗脱液，薄层层析跟踪检测，合并相同组分，浓缩；
（3）反向柱层析
选取步骤（2）中极性适中浓缩组分用溶剂溶解与硅胶拌样，挥干溶剂后湿法上反向硅胶柱，并用纯净水：甲醇梯度洗脱，分段收集洗脱液，薄层层析跟踪检测，合并相同组分，浓缩得目标粗品；
（4）再次柱层析
将步骤（3）中目标粗品再次进行硅胶柱处理，并用环己烷：丙酮洗脱，洗脱液浓缩干燥得白色粉末，即为吡唑草胺类成分。
3.如权利要求2所述的利用黑曲霉分离提取吡唑草胺的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的将菌粉用丙酮以1：4的重量比提取3次得黑曲霉提取液；是将菌粉用丙酮以1：4的重量比，在加热温度为50-100℃，压力为0-1.0MPa条件下提取3次得黑曲霉提取液，时间为每次3h。
4.如权利要求2所述的利用黑曲霉分离提取吡唑草胺的方法，其特征在于：所述步骤（1）、步骤（2）、步骤（3）和/或步骤（4）中的浓缩是指采用旋转蒸发仪在温度40-60℃、压力为0.04-0.06MPa的条件下旋蒸至有机溶剂挥干。
5.如权利要求2所述的利用黑曲霉分离提取吡唑草胺的方法，其特征在于：步骤（2）、步骤（3）和/或所述步骤（4）中所述的硅胶颗粒尺寸为200-300目。
6.如权利要求2所述的利用黑曲霉分离提取吡唑草胺的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述的用石油醚：丙酮梯度洗脱是；按石油醚：丙酮=1:0、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1进行洗脱。
7.如权利要求2所述的利用黑曲霉分离提取吡唑草胺的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述并用纯净水：甲醇梯度洗脱是；按纯净水：甲醇=60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100进行洗脱。
8.如权利要求2所述的利用黑曲霉分离提取吡唑草胺的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述的并用环己烷：丙酮洗脱是；按环己烷：丙酮=30:1进行洗脱。
9.如权利要求2所述的利用黑曲霉分离提取吡唑草胺的方法，其特征在于：步骤（2）、步骤（3）和/或步骤（4）中的洗脱剂的流速为15 mL/min。
10.如权利要求1-9中任一项所述的利用黑曲霉分离提取吡唑草胺的方法，其特征在于：所述的黑曲霉是黑曲霉xj，保藏号为：CCTCC NO：M 206021，名称为：黑曲霉xj（Aspergillus niger xj）。
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|---|---|---|---|---|
| CN110343032A (zh) * | 2019-08-31 | 2019-10-18 | 贵州大学 | 一种分离提取5-十五烷基间苯二酚的方法 |
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2018
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| CN110343032A (zh) * | 2019-08-31 | 2019-10-18 | 贵州大学 | 一种分离提取5-十五烷基间苯二酚的方法 |
| CN110343032B (zh) * | 2019-08-31 | 2022-01-04 | 贵州大学 | 一种分离提取5-十五烷基间苯二酚的方法 |
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