CN108398559B - 一种用于诊断冠心病的联合检测微流控芯片及其制备方法和用途 - Google Patents

一种用于诊断冠心病的联合检测微流控芯片及其制备方法和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN108398559B
CN108398559B CN201810162775.7A CN201810162775A CN108398559B CN 108398559 B CN108398559 B CN 108398559B CN 201810162775 A CN201810162775 A CN 201810162775A CN 108398559 B CN108398559 B CN 108398559B
Authority
CN
China
Prior art keywords
detection
detection zone
mouse
monoclonal antibody
human
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810162775.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108398559A (zh
Inventor
林斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Huaketai Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Beijing Huaketai Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Huaketai Biotechnology Co Ltd filed Critical Beijing Huaketai Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201810162775.7A priority Critical patent/CN108398559B/zh
Publication of CN108398559A publication Critical patent/CN108398559A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108398559B publication Critical patent/CN108398559B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/10—Integrating sample preparation and analysis in single entity, e.g. lab-on-a-chip concept
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/324—Coronary artery diseases, e.g. angina pectoris, myocardial infarction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于诊断冠心病的联合检测微流控芯片，包括：芯片基板及盖合于所述芯片基板上方的上层盖片，所述芯片基板上设有依次通过毛细管微通道连通的加样区、抗体包被区、微混合区、第一检测区、第二检测区、质控区及废液收集区；所述上层盖片上设有加样孔、第一检测窗口、第二检测窗口、质控窗口、通气孔，并且与所述加样区、第一检测区、第二检测区、质控区、废液收集区的位置依次对应。本发明还提供了上述联合微流控芯片的制备方法和用途。本发明能够实现脂蛋白磷脂酶A2和髓过氧化物酶项目的联合检测，对能够全面准确的诊断冠心病有着极大的临床诊断价值。

Description

一种用于诊断冠心病的联合检测微流控芯片及其制备方法和 用途
技术领域
本发明属于体外诊断领域，具体涉及一种用于诊断冠心病的联合检测微流控芯片及其制备方法和用途。
背景技术
脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)是血管特异性的炎症酶，主要由淋巴细胞和单核-巨噬细胞合成和分泌，血中的Lp-PLA2与低密度脂蛋白(LDL)结合，能够将氧化LDL水解成大量的溶血软磷脂和游离氧化脂肪酸，促进脉粥样硬化斑块形成。Lp-PLA2是健康人群首发冠心病独立预测因子，并且高水平的Lp-PLA2与冠心病的高风险相关，与传统冠心病危险因素相独立，Lp-PLA2可以作为冠心病一级或二级预防的独立预测因子。
髓过氧化物酶(MPO)既是系统性炎症的标志物，又是氧化应激的介质，能够通过氧化修饰作用促进动脉粥样硬化的形成，引起动脉粥样斑块的不稳定或破溃。MPO是冠状动脉粥样硬化斑块不稳定的标志物，在冠状疾病的发展过程中，MPO的水平逐步提高，其与冠心病的严重程度相关，且相关程度要高于 CRP。MPO水平可独立预测冠心病人群的复发和健康人群首发冠心病，但是其对风险评估的预测价值不如Lp-PLA2。
综上所述，作为冠心病的预测因子，联合检测Lp-PLA2和MPO对冠心病的诊断具有非常大的临床诊断价值。然而，目前临床上对冠心病的诊断主要是对单个项目进行检测，导致在疾病诊断方面存在一定的局限性。或者为了获得准确的检测结果，临床上采用对不同项目的试剂盒进行联合检测，样本用量多，检测周期长，工作量大，效率低。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于诊断冠心病的联合检测微流控芯片及其制备方法和用途。
为了达到上述的目的，本发明提供了一种用于诊断冠心病的联合检测微流控芯片，包括：芯片基板及盖合于所述芯片基板上方的上层盖片，
所述芯片基板上设有依次通过毛细管微通道连通的加样区、抗体包被区、微混合区、第一检测区、第二检测区、质控区及废液收集区；
所述上层盖片上设有加样孔、第一检测窗口、第二检测窗口、质控窗口、通气孔，并且与所述加样区、第一检测区、第二检测区、质控区、废液收集区的位置依次对应；
其中，所述抗体包被区预存储有荧光微球标记的一株鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人MPO单克隆抗体和荧光微球标记的兔IgG 的混合物；
所述第一检测区中预存储有磁性微球标记的另一株鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体或磁性微球标记的另一株鼠抗人MPO单克隆抗体中的一种；所述第二检测区中预存储有磁性微球标记的另一株鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体或磁性微球标记的另一株鼠抗人MPO单克隆抗体中的另一种。
进一步地，其中所述第一检测区、第二检测区、和质控区的下侧设有由永磁铁或电磁铁提供的磁场区域。
进一步地，其中所述荧光微球标记的鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体、荧光微球标记的鼠抗人MPO单克隆抗体和荧光微球标记的兔IgG抗体的摩尔比为1： 1：(0.1～4)。
进一步地，其中所述检测区中磁性微球与另一株鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体的质量比为10：0.05～2；所述检测区中磁性微球与另一株鼠抗人MPO单克隆抗体的质量比为10：0.05～2。
进一步地，其中所述磁性微球为磁性的Fe3O4、γ-Fe2O3、Pt、Ni或Co微球，或者为磁性的Fe3O4、γ-Fe2O3、Pt、Ni或Co与无机物或有机物形成的核/ 壳结构或掺杂结构的微球，所述Fe3O4、γ-Fe2O3、Pt、Ni或Co与所述无机物或有机物的重量百分比为1：(0.001～1000)；所述磁性微球的粒径大小为0.05～5 μm。
进一步地，其中所述质控区预存储有磁性微球标记的羊抗兔多克隆抗体。
进一步地，其中所述第一检测区、第二检测区和质控区的表面设置为粗糙结构，所述粗糙结构为向下凹的半圆结构、锯齿形结构、凹凸的小矩形结构或其他不规则结构；
所述微混合区为棱形、圆形、方形或矩形，并且其内部设有n个交错设置的矩形、棱形、方形或圆形的柱体；或者所述微混合区为至少一个矩形串联结构，并且每个矩形中设有一个矩形柱体；或者所述微混合区为锯齿形结构；或者所述微混合区为至少一个正三角形或倒三角形串联结构，并且每个三角形中设置有一个相应正三角或者倒三角形柱体；或者所述微混合区为至少一个棱形结构串联，并且棱形结构中设置有一个棱形或圆形柱体；或者所述微混合区为至少一个圆形结构串联，并且圆形结构中设置有一个圆形柱体。
本发明还提供了上述用于诊断冠心病的联合检测微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：
1)在芯片基板上开设一个所述微流控检测通道；
2)将荧光微球标记的一株鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人MPO单克隆抗体和荧光微球标记的兔IgG进行混合，将混合物预存储在抗体包被区中，干燥；
3)将磁性微球标记的另一株鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体、磁性微球标记的另一株鼠抗人MPO单克隆抗体分别任意地预存储在第一检测区、第二检测区中且两个检测区中所预存储的物质各不相同，干燥；
4)将磁性微球标记的羊抗兔多克隆抗体预存储在质控区中，干燥；
5)将上层盖片盖合于芯片基板的上方；
6)在芯片基板的下方对应所述微流控芯片的第一检测区、第二检测区和质控区设置磁场。
本发明进一步提供了上述用于诊断冠心病的联合检测微流控芯片的应用方法，包括如下步骤：
1)将微流控芯片置于配套的仪器中，启动电磁铁，若为永磁铁则不需要启动，使第一、第二检测区和质控区中的免疫磁性微球平铺固定到相应区域的底面；
2)从加样孔加入检测样本，该检测样本通过毛细管微通道流入抗体包被区，复溶预存储在抗体包被区中的荧光微球标记的一株鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人MPO单克隆抗体和荧光微球标记的兔IgG，得到混合物；
3)随后，步骤2)中得到的混合物通过毛细管微通道流入到微混合区，在微混合区样本中的Lp-PLA2与荧光微球标记的鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体进行充分反应形成荧光微球标记的Lp-PLA2免疫复合物，样本中MPO与荧光微球标记的鼠抗人MPO单克隆抗体进行充分反应形成荧光微球标记的MPO免疫复合物，且荧光微球标记的兔IgG未参加反应；
4)步骤3)中反应形成的荧光微球标记的Lp-PLA2免疫复合物、荧光微球标记的MPO免疫复合物以及未参加反应的荧光微球标记的兔IgG通过毛细管微通道进入到第一检测区、第二检测区和质控区内，Lp-PLA2免疫复合物与磁性微球标记的另一株鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体发生免疫反应而停留在存储有磁性微球标记的另一株鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体的检测区中，MPO免疫复合物与磁性微球标记的另一株鼠抗人MPO单克隆抗体发生免疫反应而停留在存储有磁性微球标记的另一株鼠抗人MPO单克隆抗体的检测区中，荧光微球标记的兔IgG与质控区中磁性微球标记的羊抗兔多克隆抗体发生免疫反应而停留在质控区中，剩余液体流入废液收集区；
5)第一、第二检测区和质控区的荧光微球均显示一定的荧光信号，存储有磁性微球标记的另一株鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体的检测区与质控区荧光信号的比值与Lp-PLA2的浓度具有正相关性，存储有磁性微球标记的另一株鼠抗人 MPO单克隆抗体的检测区与质控区荧光信号的比值与MPO的浓度具有正相关性，通过标准曲线计算即可得出Lp-PLA2和MPO的浓度。
本发明的有益效果在于：
1.本发明设置的微混合区便于待测物质与相应抗原或抗体之间进行充分结合，提高检测的灵敏度；
2.本发明在检测区和质控区中分别设有免疫磁微球，在检测区和质控区的下方设置了磁场区域，便于将待测物质固定到相应检测区内，并且检测区和质控区表面设置成粗糙结构，用于增大摩擦力，防止磁珠滚动；降低非特异性造成的干扰，提高检测灵敏度；
3.本发明在免疫反应前将免疫磁珠平铺固定到检测区或质控区表面，免疫反应后使荧光微球均置于免疫磁珠的上表面，避免了磁性微球遮挡荧光微球而对荧光信号造成干扰；
4.本发明能够实现Lp-PLA2和MPO项目的联合检测联合检测，对能够全面准确的诊断冠心病有着极大的临床诊断价值，并且本微流控芯片检测时、检测周期短、检测效率高。
附图说明
图1A为本发明的用于诊断冠心病的联合检测微流控芯片中芯片基板的结构示意图；
图1B为本发明的用于诊断冠心病的联合检测微流控芯片中上层盖片的结构示意图；
图2为本发明的免疫磁性微球与检测区或质控区的粗糙表面的接触示意图，其中，(1)免疫磁性微珠与向下凹的半圆结构的粗糙表面接触；(2)免疫磁性微珠与锯齿形结构的粗糙表面接触；(3)免疫磁性微珠与凹凸的矩形结构的粗糙表面接触；
图3为本发明的用于诊断冠心病的联合检测微流控芯片的微混合区结构示意图，其中，(1)棱型结构，并且内部设有多个交错设置的棱形柱体；(2) 棱型结构，并且内部设有多个交错设置的圆形柱体；(3)棱型结构，并且内部设有多个长条形柱体；(4)两个矩形串联结构，并且每个矩形中设有一个矩形柱体；(5)三个正三角形串联结构，并且每个正三角形中设有一个正三角形柱体；(6)三个倒三角形串联结构，并且每个倒三角形中设有一个倒三角形柱体； (7)锯齿形结构；(8)三个棱型串联结构，并且每个棱型中设置一个棱型柱体；(9)三个棱型串联结构，并且每个棱型中设置一个棱型柱体；
图4为Lp-PLA2的标准曲线；
图5为MPO的标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
结合图1A及图1B所示，本发明提供了一种用于诊断冠心病的联合检测微流控芯片，包括：芯片基板20及盖合于所述芯片基板上方的上层盖片21，所述芯片基板上设有依次通过毛细管微通道连通的加样区1、抗体包被区2、微混合区3、第一检测区4、第二检测区5、质控区6、废液收集区7；上层盖片上设有加样孔8、第一检测窗口9、第二检测窗口10、质控窗口11、通气孔12，并且与芯片基板中加样区1、第一检测区4、第二检测区5、质控区6、废液收集区7的位置依次对应。第一检测区4、第二检测区5和质控区6的下侧设有磁场区域19，磁场由永磁铁或电磁铁提供。
其中，加样区1和抗体包被区2通过第一毛细管微通道13连通，抗体包被区2和微混合区3通过第二毛细管微通道14连通，微混合区3与第一检测区4 通过第三毛细管微通道15连通，第一检测区4和第二检测区5通过第四毛细管微通道16连通，第二检测区5和质控区6通过第五毛细管微通道17连通，质控区6和废液收集区7通过第六毛细管微通道18连通；
抗体包被区2预存储有荧光微球标记的一株鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人MPO单克隆抗体和荧光微球标记的兔IgG的混合物；
第一检测区4中预存储有磁性微球标记的另一株鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体，第二检测区5中预存储有磁性微球标记的另一株鼠抗人MPO单克隆抗体，质控区6中预存储有磁性微球标记的一株羊抗兔多克隆抗体。
所述荧光微球标记的鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体、荧光微球标记的鼠抗人MPO单克隆抗体和荧光微球标记的兔IgG抗体的摩尔比为1：1：0.1～4。
所述第一检测区4或第二检测区5中磁性微球与另一株鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体的质量比为10：(0.05～2)；所述第一检测区4或第二检测区5中磁性微球与另一株鼠抗人MPO单克隆抗体的质量比为10：(0.05～2)。
所述磁性微球为磁性的Fe3O4、γ-Fe2O3、Pt、Ni或Co微球，或者为磁性的Fe3O4、γ-Fe2O3、Pt、Ni或Co与无机物或有机物形成的核/壳结构或掺杂结构的微球，所述Fe3O4、γ-Fe2O3、Pt、Ni或Co与所述无机物或有机物的重量百分比为1：(0.001-1000)；所述磁性微球的粒径大小为0.05-5μm。
结合图2所示，所述第一检测区4、第二检测区5和质控区6的表面设置为粗糙结构。所述粗糙结构为向下凹的半圆结构、锯齿形结构、凹凸的小矩形结构或其他不规则结构。
结合图3所示，所述微混合区3为棱形、圆形、方形或矩形，并且其内部设有n个交错设置的矩形、棱形、方形或圆形的柱体；或者所述微混合区3为至少一个矩形串联结构，并且每个矩形中设有一个矩形柱体；或者所述微混合区为锯齿形结构；或者所述微混合区3为至少一个正三角形或倒三角形串联结构，并且每个三角形中设置有一个相应正三角或者倒三角形柱体；或者所述微混合区3为至少一个棱形结构串联，并且棱形结构中设置有一个棱形或圆形柱体；或者所述微混合区3为至少一个圆形结构串联，并且圆形结构中设置有一个圆形柱体；
制备上述用于诊断冠心病的联合检测微流控芯片的方法，包括如下步骤：
1)在芯片基板上开设一个所述微流控检测通道；
2)将荧光微球标记的一株鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人MPO单克隆抗体和荧光微球标记的兔IgG进行混合，将混合物预存储在抗体包被区2中，干燥；
3)将磁性微球标记的另一株鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体、磁性微球标记的另一株鼠抗人MPO单克隆抗体分别相应地预存储在第一检测区4、第二检测区5中，干燥；
4)将磁性微球标记的羊抗兔多克隆抗体预存储在质控区6中，干燥；
5)将上层盖片21盖合于芯片基板20的上方；
6)在芯片基板20的下方对应所述微流控芯片的待第一检测区4、第二检测区5和质控区6设置磁场。
以下通过具体实施例对本发明进行进一步说明。
1.抗体包被区的处理
1.1荧光微球标记鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体
取5mL 0.01g/mL的乳胶荧光微球放入小离心管中，按照12000r/min的转速离心20min，移除上层清液后，用5mL的碳酸钠缓冲溶液进行复溶，随后加入5mg的碳二亚胺(EDC)、5mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1mL 鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体在25℃下搅拌6h，继续加入2.5mg的赖氨酸在室温下搅拌20min，将混合物放入透析袋中在4℃下透析12h；透析结束后将混合溶液在12000r/min的转速下离心10min，移去上层清液，最后用20mL的 LM缓冲溶液复溶，待用；
1.2荧光微球标记鼠抗人MPO单克隆抗体
取5mL 0.01g/mL的乳胶荧光微球放入小离心管中，按照12000r/min的转速离心20min，移除上层清液后，用5mL的碳酸钠缓冲溶液进行复溶，随后加入5mg的EDC、5mg的NHS和1mL鼠抗人MPO单克隆抗体在25℃下搅拌6h，继续加入2.5mg的赖氨酸在室温下搅拌20min，将混合物放入透析袋中在4℃下透析12h；透析结束后将混合溶液在12000r/min的转速下离心10 min，移去上层清液，最后用20mL的LM缓冲溶液复溶，待用；
1.3荧光微球标记兔IgG
取5mL 0.01g/mL的乳胶荧光微球放入小离心管中，按照12000r/min的转速离心20min，移除上层清液后，用5mL的碳酸钠缓冲溶液进行复溶，随后加入5mg的EDC、5mg的NHS和1mL兔IgG在25℃下搅拌6h，继续加入 2.5mg的赖氨酸在室温下搅拌20min，将混合物放入透析袋中在4℃下透析12 h；透析结束后将混合溶液在12000r/min的转速下离心10min，移去上层清液，最后用20mL的LM缓冲溶液复溶，待用；
1.5抗体包被区的处理
将上述制备的荧光微球标记鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体、荧光微球标记鼠抗人MPO单克隆抗体和荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体按照摩尔比为1：1：1进行混合，取3μL混合溶液滴于抗体包被区，在湿度<30％的环境中干燥6h。
2.检测区的处理
2.1磁性微球标记鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体
取1mg羧基功能化的磁性微球置于离心管中，用1mL的MEST缓冲溶液洗涤两次；取600μL的MES重悬磁性微球后，依次向体系中加入1mg的EDC 和1mg的NHS，在37℃下置于旋转混合器上活化0.5h；磁分离后，移除上层清液，用500μL的MEST缓冲溶液洗涤两次，用PBST溶液重悬后加入40μ g鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体在4℃下搅拌12h；将搅拌后得到的偶联产物与乙醇胺(2％，V/V)在37℃下活化0.5h，最后用PBST缓冲溶液洗涤两次后加入1mL PBST重悬，取3μL磁性微球标记鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体置于第一检测区4中，在湿度<30％环境中干燥6h。
2.2磁性微球标记鼠抗人MPO单克隆抗体
取1mg羧基功能化的磁性微球置于离心管中，用1mL的MEST缓冲溶液洗涤两次；取600μL的MES重悬磁性微球后，依次向体系中加入1mg的EDC 和1mg的NHS，在37℃下置于旋转混合器上活化0.5h；磁分离后，移除上层清液，用500μL的MEST缓冲溶液洗涤两次，用PBST溶液重悬后加入40μ g鼠抗人MPO单克隆抗体在4℃下搅拌12h；将搅拌后得到的偶联产物与乙醇胺(2％，V/V)在37℃下活化0.5h，最后用PBST缓冲溶液洗涤两次后加入1 mL PBST重悬，取3μL磁性微球标记鼠抗人MPO单克隆抗体置于第二检测区 5中，在湿度<30％环境中干燥6h。
3.质控区的处理
3.1磁性微球标记羊抗兔多克隆抗体
取1mg羧基功能化的磁性微球置于离心管中，用1mL的MEST缓冲溶液洗涤两次；取600μL的MES重悬磁性微球后，依次向体系中加入1mg的EDC 和1mg的NHS，在37℃下置于旋转混合器上活化0.5h；磁分离后，移除上层清液，用500μL的MEST缓冲溶液洗涤两次，用PBST溶液重悬后加入40μ g羊抗兔多克隆抗体在4℃下搅拌12h；将搅拌后得到的偶联产物与乙醇胺(2％， V/V)在37℃下活化0.5h，最后用PBST缓冲溶液洗涤两次后加入1mLPBST 重悬，取3μL磁性微球标记的羊抗兔多克隆抗体置于质控区中，在湿度<30％环境中干燥6h。
4.微流控芯片联合检测
1)将微流控芯片置于配套的仪器中，启动电磁铁，若为永磁铁则不需要启动，使第一检测区4、第二检测区5和质控区6中的免疫磁性微球平铺固定到相应区域的底面；
2)从加样孔8加入检测样本，该检测样本通过毛细管微通道13流入抗体包被区2，复溶预存储在抗体包被区2中的荧光微球标记的一株鼠抗人Lp-PLA2 单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人MPO单克隆抗体和荧光微球标记的兔IgG，得到混合物；
3)随后，步骤2)中得到的混合物通过毛细管微通道14流入到微混合区3，在微混合区3样本中中的Lp-PLA2与荧光微球标记的鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体进行充分反应形成荧光微球标记的Lp-PLA2免疫复合物，样本中MPO与荧光微球标记的鼠抗人MPO单克隆抗体进行充分反应形成荧光微球标记的 MPO免疫复合物，且荧光微球标记的兔IgG未参加反应；
4)步骤3)反应后形成的荧光微球标记的Lp-PLA2免疫复合物、荧光微球标记的MPO免疫复合物以及未参加反应的荧光微球标记的兔IgG通过毛细管微通道依次进入到第一检测区4、第二检测区5和质控区6内，Lp-PLA2免疫复合物与第一检测区4中磁性微球标记的另一株鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体发生免疫反应而停留在第一检测区4中，MPO免疫复合物与第二检测区5中磁性微球标记的另一株鼠抗人MPO单克隆抗体发生免疫反应而停留在第二检测区5 中，荧光微球标记的兔IgG与质控区6中磁性微球标记的羊抗兔多克隆抗体发生免疫反应而停留在质控区6中，剩余液体流入废液收集区7；
5)第一检测区4、第二检测区5和质控区6的荧光微球显示一定的荧光信号，存储有磁性微球标记的另一株鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体的第一检测区4 和质控区6荧光信号的比值与Lp-PLA2的浓度具有正相关性，存储有磁性微球标记的另一株鼠抗人MPO单克隆抗体的第二检测区5和质控区6的荧光信号的比值与MPO的浓度具有正相关性，通过标准曲线计算即可得出Lp-PLA2和 MPO的浓度。
5.标准曲线的建立
配置浓度为0、40、80、160、320、1000ng/mL的Lp-PLA2校准品用于建立Lp-PLA2标准曲线(如图4)，检测灵敏度为40ng/mL，检测范围为40～1000 ng/mL；配置浓度为0、10、50、100、500、1000ng/mL的MPO校准品用于建立MPO标准曲线(如图5)，检测灵敏度为10ng/mL，检测范围为10～1000 ng/mL，检测结果如表1所示。
表1
6.精密度的测定
取浓度为80ng/mL和320ng/mL的Lp-PLA2校准品、浓度为50μg/mL和 500ng/mL的MPO校准品进行精密度的测定，每个样本重复测定10次，计算批间平均偏差和批内平均偏差CV％值，测定结果如表2中所示，批间差和批内差均小于15％。
表2
附：所需溶液配制
(1)碳酸钠缓冲溶液
碳酸钠 4.33g
碳酸氢钠 2.96g
纯化水定容至1000mL；
(2)柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(LM)
柠檬酸三钠 7.33g
柠檬酸 4.44g
氢氧化钠 1g
纯化水定容至1000mL；
(3)MEST缓冲溶液
纯化水定容至1000mL；
(4)MES缓冲溶液
磷酸氢二钠 6.59g
磷酸二氢钠 24.21g
2-吗啉乙磺酸(MES) 1.95g
纯化水定容至1000mL；
(5)PBST缓冲溶液
磷酸氢二钠 43.42g
磷酸二氢钠 5.24g
Tween20 0.1g
纯化水定容至1000mL。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种改动和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于诊断冠心病的联合检测微流控芯片，其特征在于，包括：芯片基板及盖合于所述芯片基板上方的上层盖片，
所述芯片基板上设有依次通过毛细管微通道连通的加样区、抗体包被区、微混合区、第一检测区、第二检测区、质控区及废液收集区；
所述上层盖片上设有加样孔、第一检测窗口、第二检测窗口、质控窗口、通气孔，并且与所述加样区、第一检测区、第二检测区、质控区、废液收集区的位置依次对应；
其中，所述抗体包被区预存储有荧光微球标记的一株鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人MPO单克隆抗体和荧光微球标记的兔IgG的混合物；
所述第一检测区中预存储有磁性微球标记的另一株鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体或磁性微球标记的另一株鼠抗人MPO单克隆抗体中的一种；所述第二检测区中预存储有磁性微球标记的另一株鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体或磁性微球标记的另一株鼠抗人MPO单克隆抗体中的另一种；
所述第一检测区、第二检测区和质控区的表面设置为粗糙结构，所述粗糙结构为向下凹的半圆结构、锯齿形结构、凹凸的小矩形结构；
所述微混合区为棱形、圆形或矩形，并且其内部设有n个交错设置的矩形、棱形或圆形的柱体；或者所述微混合区为至少一个矩形串联结构，并且每个矩形中设有一个矩形柱体；或者所述微混合区为锯齿形结构；或者所述微混合区为至少一个正三角形或倒三角形串联结构，并且每个三角形中设置有一个相应正三角或者倒三角形柱体；或者所述微混合区为至少一个棱形结构串联，并且棱形结构中设置有一个棱形或圆形柱体；或者所述微混合区为至少一个圆形结构串联，并且圆形结构中设置有一个圆形柱体。
2.根据权利要求1所述的用于诊断冠心病的联合检测微流控芯片，其特征在于，所述第一检测区、第二检测区和质控区的下侧设有由永磁铁或电磁铁提供的磁场区域。
3.根据权利要求1所述的用于诊断冠心病的联合检测微流控芯片，其特征在于，所述荧光微球标记的一株鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人MPO单克隆抗体和荧光微球标记的兔IgG的摩尔比为1：1：(0.1～4)。
4.根据权利要求1所述的用于诊断冠心病的联合检测微流控芯片，其特征在于，所述第一检测区或第二检测区中磁性微球与另一株鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体的质量比为10：(0.05～2)；所述第一检测区或第二检测区中磁性微球与另一株鼠抗人MPO单克隆抗体的质量比为10：(0.05～2)。
5.根据权利要求4所述的用于诊断冠心病的联合检测微流控芯片，其特征在于，所述磁性微球为磁性的Fe3O4、γ-Fe2O3、Pt、Ni或Co微球，或者为磁性的Fe3O4、γ-Fe2O3、Pt、Ni或Co与无机物或有机物形成的核/壳结构或掺杂结构的微球，所述Fe3O4、γ-Fe2O3、Pt、Ni或Co与所述无机物或有机物的重量百分比为1：(0.001-1000)；所述磁性微球的粒径大小为0.05-5μm。
6.根据权利要求1所述的用于诊断冠心病的联合检测微流控芯片，其特征在于，所述质控区预存储有磁性微球标记的羊抗兔多克隆抗体。
7.权利要求1～6任一项所述的用于诊断冠心病的联合检测微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)在芯片基板上开设一个所述微流控检测通道；
2)将荧光微球标记的一株鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人MPO单克隆抗体和荧光微球标记的兔IgG进行混合，将混合物预存储在抗体包被区中，干燥；
3)将磁性微球标记的另一株鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体、磁性微球标记的另一株鼠抗人MPO单克隆抗体分别任意地预存储在第一检测区、第二检测区中且两个检测区中所预存储的物质各不相同，干燥；
4)将磁性微球标记的羊抗兔多克隆抗体预存储在质控区中，干燥；
5)将上层盖片盖合于芯片基板的上方；
6)在芯片基板的下方对应所述微流控芯片的待第一检测区、第二检测区和质控区设置磁场。
CN201810162775.7A 2018-02-26 2018-02-26 一种用于诊断冠心病的联合检测微流控芯片及其制备方法和用途 Active CN108398559B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810162775.7A CN108398559B (zh) 2018-02-26 2018-02-26 一种用于诊断冠心病的联合检测微流控芯片及其制备方法和用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810162775.7A CN108398559B (zh) 2018-02-26 2018-02-26 一种用于诊断冠心病的联合检测微流控芯片及其制备方法和用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108398559A CN108398559A (zh) 2018-08-14
CN108398559B true CN108398559B (zh) 2019-05-14

Family

ID=63096568

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810162775.7A Active CN108398559B (zh) 2018-02-26 2018-02-26 一种用于诊断冠心病的联合检测微流控芯片及其制备方法和用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108398559B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4140584A4 (en) * 2021-02-05 2023-08-02 BOE Technology Group Co., Ltd. MICROFLUIDIC CHIP
CN116106539B (zh) * 2023-04-12 2023-07-04 北京芯迈微生物技术有限公司 一种免疫微流控的多重抗原包被试剂盒及其方法、应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN205015347U (zh) * 2015-07-30 2016-02-03 广州天宝颂原生物科技开发有限公司 髓过氧化物酶、脂蛋白磷脂酶a2定量联检试纸条
CN106226513A (zh) * 2016-08-02 2016-12-14 北京乐普医疗科技有限责任公司 一种免疫磁珠定量检测相关抗原的方法及其应用
CN106338601B (zh) * 2016-08-26 2019-04-05 广东普洛宇飞生物科技有限公司 一种抗精子抗体和抗缪勒管激素联合定量检测卡及其制作、使用方法
CN106807461B (zh) * 2017-01-10 2018-02-13 北京华科泰生物技术有限公司 一种用于荧光免疫检测的微流控芯片及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN108398559A (zh) 2018-08-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108181458B (zh) 一种基于荧光免疫联合检测的微流控芯片及其制备方法和用途
TW203120B (zh)
US4639419A (en) Immunological color change test involving two differently colored reagent spots
CN103201057B (zh) 免疫学测定用蓝色金纳米颗粒、其制造方法以及使用该蓝色金纳米颗粒的测定方法
CN105842451B (zh) 基于量子点荧光免疫检测dnmt1的方法
WO1995015498A1 (en) Immunoassays employing generic anti-hapten antibodies and materials for use therein
CN85104030A (zh) 免疫测定方法和装置
CN108273575A (zh) 一种用于诊断贫血性疾病的联合检测微流控芯片及其制备方法和用途
CN109669044A (zh) 基于双色量子点联合检测saa和crp的荧光免疫吸附检测试剂盒及其制备方法
CN108398559B (zh) 一种用于诊断冠心病的联合检测微流控芯片及其制备方法和用途
CN101545909A (zh) C肽微孔板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法
CN101377500A (zh) 游离前列腺特异性抗原化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法
CN105195243A (zh) 一种肌红蛋白定量检测的磁微粒化学发光微流控芯片
CN110346557A (zh) 一种检测试剂盒
CN109283335A (zh) 用于定量检测卵巢癌外泌体抗原的试剂盒及其配制方法
CN108097340B (zh) 一种用于胃功能疾病筛查的联合检测微流控芯片及其制备方法和用途
CN109470857A (zh) 免疫测定方法、用于鉴定免疫测定的系统和试剂盒
Gella et al. Latex agglutination procedures in immunodiagnosis
JPH0795065B2 (ja) 水不溶性試薬、それを含む要素及びその使用方法
CN109709322A (zh) 一种检测黄曲霉毒素b1的检测方法
CN109459570A (zh) 一种快速检测人体血液中铅离子的胶体金免疫试纸条制备方法
CN109342736A (zh) 一种微柱凝集抗人球蛋白检测卡
CN108236972B (zh) 一种用于早期诊断肾损伤的联合检测微流控芯片及其制备方法和用途
CN111896733A (zh) 一种快速诊断溶组织内阿米巴原虫抗原的彩色微球免疫层析检测试纸及其制备方法
CN108918888A (zh) 一种检测内皮抑素的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: 101111 Four Floor F4E of Building No. 2, Kechuang East Five Street, Tongzhou District, Beijing

Applicant after: Beijing Huaketai Biotechnology Co., Ltd.

Address before: 101111 Four Floor F4E of Building No. 2, Kechuang East Five Street, Tongzhou District, Beijing

Applicant before: Beijing Elcoteq Bio-Technology Co., Ltd.

CB02 Change of applicant information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Lin Si

Inventor after: Hu Chenguang

Inventor after: Xiao Jun

Inventor after: Yang Fachen

Inventor before: Lin Si

CB03 Change of inventor or designer information