CN108396003B - 降解亚硝酸钠的多粘类芽孢杆菌菌株及其筛选和应用 - Google Patents

降解亚硝酸钠的多粘类芽孢杆菌菌株及其筛选和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种降解亚硝酸钠的多粘类芽孢杆菌菌株及其筛选和应用，该菌Paenibacillus polymyxa JM01保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC 15240。本发明包括菌株的分离培养及16S rDNA分子鉴定；多粘类芽孢杆菌培养后，活性物质菌悬液的获得；在体外，该菌株对亚硝酸盐的降解效果；在体内，腌制猪肉中的亚硝酸盐的降解应用。本发明筛选的多粘类芽孢杆菌能对亚硝酸盐进行有效降解，可用于含亚硝酸盐食品中减少亚硝酸盐含量的添加物。

Description

降解亚硝酸钠的多粘类芽孢杆菌菌株及其筛选和应用
技术领域
本发明属于新菌种筛选技术及微生物技术领域，特别涉及一株能降解亚硝酸 钠的多粘类芽孢杆菌及其在肉制品中的应用。
背景技术
亚硝酸钠是一种普遍应用的食品添加剂，在腌制肉制品中应用由来已久。它 在肉制品中的最大允许添加量是0.15g/kg，最大允许残留量为30mg/kg。亚硝 酸钠残留因能形成亚硝胺而成为一种强烈致癌物质，它在食品中的添加和残留受 到很大的关注。由于亚硝酸钠的残留，加工肉制品被世卫组织下属机构国际癌症 研究机构列为第一类致癌物质。
研究表明，亚硝酸盐在腌制肉的贮存过程中会逐渐减少，有些细菌(比如乳 酸菌)具有降解亚硝酸盐的作用。其作用机制有通过酶降解和酸降解途径。关于 多粘类芽孢杆菌降解亚硝酸钠未见相关报道。本发明主要是将多粘类芽孢杆菌的 不同活性成分作为降解剂，喷洒到腌制猪肉表面，测定其亚硝酸盐降解效果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种降解亚硝酸钠的多粘类芽孢杆菌菌剂 及其制备方法和具体应用。
本发明公开了一种降解亚硝酸钠的多粘类芽孢杆菌菌株，保藏名称为多粘类 芽孢杆菌JM01(Paenibacillus polymyxa JM01)，保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 保藏号为CGMCC 15240，保藏日期为2018年1月18日。
降解亚硝酸钠的菌株经16S rDNA鉴定，为Paenibacillus polymyxa。所述 菌株的单菌落为圆形、白色、边缘清晰、不透明、表面略褶皱。菌株需氧性试验 结果显示可在培养基中间和表面生长，为兼性好氧菌。如图1和2所示。
本发明以改良MRS培养基为筛选培养基，具体方法为：称取金华火腿样品 加入到装有无菌生理盐水的三角瓶中，振荡均匀制成悬液，吸取适量悬液涂布于 含亚硝酸钠的MRS固体培养基上，30-37℃下培养2-3d，待培养皿中长出菌落 后，挑取单个菌落在改良MRS固体培养基上进行反复分离划线，并连续三代培 养获得遗传稳定性的菌株，即为所述降解亚硝酸钠的多粘类芽孢杆菌属菌株。
所述的降解亚硝酸钠的多粘类芽孢杆菌菌株可以用于制备降解腌制猪肉中 亚硝酸盐的菌剂。
活性成分分别是多粘类芽孢杆菌的发酵培养液、菌悬液和菌体干粉。
含有多粘类芽孢杆菌的菌剂的成分为，每毫升降解菌剂中含有多粘类芽孢杆 菌107-1010个。
活性成分的制备过程如下：
1)多粘类芽孢杆菌菌种在LB固体培养基上生长，其培养基配方为胰蛋白 胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂20g/L，用0.1mol/L的NaOH 调节pH 7.4，在121℃下灭菌20min。
2)挑取1)中适量的多粘类芽孢杆菌加入到含有50mL LB液体培养基的 锥形瓶中(菌株的接种量为1-2％(V/V))，放置在37℃，静置培养12-16h， 然后在超净台稀释6-7倍，每个浓度取150μL菌液涂布到LB固体培养基中。
3)根据2)中测得的菌落数，将多粘类芽孢杆菌的浓度稀释到1×107-1×1010 CFU/mL，即得到多粘类芽孢杆菌发酵培养液。
4)根据步骤3)中所得的发酵液，在4000g的条件下离心5-10min，将 上清液和沉淀分离，在装有沉淀离心管中加入等体积的无菌生理盐水，振荡均匀， 再次离心洗脱，即得到多粘类芽孢杆菌菌悬液。
5)根据步骤3)中所得的发酵液离心，沉淀干燥获得菌体干粉，即得到多 粘类芽孢杆菌菌体干粉。
6)作为优选，所述LB液体培养基的组分为：8-10g/L蛋白胨，5-8g/L酵 母粉，10-15g/L氯化钠，pH 6.8-7.0。
本发明的多粘类芽孢杆菌菌剂因含多粘类芽孢杆菌，需在常温或者低温下储 藏。
本发明施用的降解剂有效利用了多粘类芽孢杆菌的活性成分，从而使腌制猪 肉中的亚硝酸钠得到了有效降解。
本发明的生物降解剂具有安全高效的特点，对环境友好，降解效果突出，能 大大降低亚硝酸盐的残留量，对维护食品安全具有重要的意义。
附图说明
图1本发明菌株基于16S rDNA序列Neighbor-Joining系统发育树；
图2本发明菌株平板培养后菌落和菌体形态；
图3本发明菌株在不同反应时间中对亚硝酸钠的降解效果，其中纵坐标代 表亚硝酸钠的含量，横坐标代表作用时间。
具体实施方式
下面具体介绍多粘类芽孢杆菌制剂降解亚硝酸钠的方法。
(一)多粘类芽孢杆菌对亚硝酸钠在LB培养基中的降解效果：
1.降解亚硝酸钠的多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa JM01，通过 16SrDNA测定序列，其序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一株降解亚硝酸钠的多粘类芽孢杆菌发酵液、菌悬液、菌粉的制备
1)活化：将降解亚硝酸钠的多粘类芽孢杆菌JM01在LB培养基中37℃培 养16h。然后重复传代培养2次，待用。
2)发酵液制备和浓度确定：用接种环挑取适量菌于盛有50mL LB液体培 养基的250mL锥形瓶，37℃培养12-16h，适量稀释发酵液使得菌浓度为 107-1010CFU/mL，待用。
3)菌悬液、菌粉制备和浓度确定：发酵液在4000g的条件下离心5min， 在装有沉淀的离心管中加入等体积的无菌生理盐水，振荡均匀，再次离心洗脱加 入无菌生理盐水得到菌悬液，平板计数调节活菌数在107-1010CFU/mL使用； 发酵液离心，沉淀菌体用无菌生理盐水洗涤，干燥后制成菌粉保存，加入适量无 菌生理盐水复溶使活菌浓度达到107-1010CFU/mL使用。
3.降解亚硝酸钠的多粘类芽孢杆菌营养培养基成分：
8-10g/L蛋白胨，5-8g/L酵母粉，10-15g/L氯化钠，pH 6.8-7.0。
4.含亚硝酸钠的LB培养基制备：
0.25g亚硝酸钠添加到500mL LB培养基制成亚硝酸钠浓度为500mg/L 的LB溶液，取10mL亚硝酸钠浓度为500mg/L的LB溶液和90mL LB溶液 混合，制成含亚硝酸钠50mg/L的LB液体培养基100mL，制备3个相同对照 组样品。
5.多粘类芽孢杆菌降解LB培养基中亚硝酸钠
用移液枪移取5mL 109CFU/mL多粘类芽孢杆菌发酵液于4)所制备含亚 硝酸钠的LB培养基。降解步骤各做3组平行，用无菌生理盐水做对照，分别在 反应进行到0、3、6、9、12、15小时后测定亚硝酸钠含量，来定量分析多粘类 芽孢杆菌JM01的活性成分对亚硝酸钠的降解作用。
6.结果：
实验结果如图3所示，在体外实验中，多粘类芽孢杆菌对亚硝酸钠有明显的 降解作用。通过与对照组相比，在原培养液中所添加的亚硝酸钠的含量显著下降。 在起初的6h内，本发明所述菌株对亚硝酸钠快速降解，随后的6h到9h，亚 硝酸钠的降解逐渐变慢，9h到15h，亚硝酸钠的降解趋于稳定，亚硝酸钠含量 从50mg/L降解到0.38mg/L，降解率达到99.2％。
(二)上述体外降解效果好的多粘类芽孢杆菌的腌制猪肉体内试验：
从添加0.1g/kg亚硝酸钠腌制的猪肉肌肉部分取直径为50mm，深为10mm 的样品6个。完全浸泡在酒精中1分钟进行表面灭菌。
取109CFU/mL多粘类芽孢杆菌菌剂10mL接种在样品表面，3个处理组样 品。另外3个生理盐水处理样品作为对照组。6个样品放置于用NaCl饱和溶液 保持湿度的密闭容器中，于30℃培养7d。测定样品中亚硝酸钠含量。
试验结果如表1所示：
表1多粘类芽孢杆菌对亚硝酸钠的降解作用
Figure BDA0001608369520000041
以上数据均是平均值±标准差(SD)，数据来源于3组重复试验。
从上述表中可以看出，在体内试验中，多粘类芽孢杆菌对腌制猪肉具有降 解效果，通过和对照组相比，多粘类芽孢杆菌对腌制猪肉中亚硝酸钠的降解率达 49.90％。
菌悬液、菌粉用于降解腌制猪肉中亚硝酸钠的应用：离心沉淀菌体用无菌生 理盐水悬浮制成菌悬液，平板计数调节活菌数在107-1010CFU/mL，测好活菌数 后直接接种在肉制品表面，具有良好的亚硝酸钠降解效果。菌体干粉用适量生理 盐水稀释使活菌浓度达到107-1010CFU/mL，接种在肉制品表面，具有良好的亚 硝酸钠降解效果。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 降解亚硝酸钠的多粘类芽孢杆菌菌株及其筛选和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1366
<212> DNA
<213> 多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)
<400> 1
tagcggcgga cgggtgagta acacgtaggc aacctgccca caagacaggg ataactaccg 60
gaaacggtag ctaatacccg atacatcctt ttcctgcatg ggagaaggag gaaagacgga 120
gcaatctgtc acttgtggat gggcctgcgg cgcattagct agttggtggg gtaaaggcct 180
accaaggcga cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca 240
cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatgggc gaaagcctga 300
cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgccagggaa 360
gaacgtcttg tagagtaact gctacaagag tgacggtacc tgagaagaaa gccccggcta 420
actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta gggggcaagc gttgtccgga attattgggc 480
gtaaagcgcg cgcaggcggc tctttaagtc tggtgtttaa tcccgaggct caacttcggg 540
tcgcactgga aactggagag cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg 600
gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct gggctgtaac 660
tgacgctgag gcgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 720
cgtaaacgat gaatgctagg tgttaggggt ttcgataccc ttggtgccga agttaacaca 780
ttaagcattc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacgggga 840
cccgcacaag cagtggagta tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt 900
cttgacatcc ctctgaccgg tctagagata ggcctttcct tcgggacaga ggagacaggt 960
ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1020
aacccttatg cttagttgcc agcaggtcaa gctgggcact ctaagcagac tgccggtgac 1080
aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac 1140
acgtactaca atggccggta caacgggaag cgaagccgcg aggtggagcc aatcctagaa 1200
aagccggtct cagttcggat tgtaggctgc aactcgccta catgaagtcg gaattgctag 1260
taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg tcttgtacac accgcccgtc 1320
acaccacgag agtttacaac acccgaagtc ggtgaggtaa ccgcaa 1366

Claims (6)

1.一种降解亚硝酸钠的多粘类芽孢杆菌菌株，其特征在于：所述菌株的分类命名为多粘类芽孢杆菌JM01（Paenibacillus polymyxa JM01），保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No.15240，保藏日期为2018年1月18日。
2.一种权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌菌株的发酵培养液，其特征在于其制备方法如下：
1）将权利要求1所述菌株在LB培养基上生长，挑取多粘类芽孢杆菌加入到含有50 mLLB液体培养基的锥形瓶中，放置在37℃，静置培养12-16 h，然后在超净台稀释6-7倍，每个浓度取150 µL菌液涂布到LB固体培养基中；
2）根据步骤1）中测得的菌落数，将多粘类芽孢杆菌的浓度用生理盐水稀释到1×107-1×1010 CFU/mL。
3.如权利要求2所述的发酵培养液，其特征在于所述LB液体培养基的组分为：8-10 g/L蛋白胨，5-8 g/L酵母粉，10-15 g/L氯化钠，pH 6.8-7.0。
4.一种权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌菌株的菌悬液，其特征在于其制备方法如下：将权利要求2所述的发酵培养液离心，将上清液和沉淀分离，在装有沉淀离心管中加入无菌生理盐水，振荡均匀，离心洗脱后加入无菌生理盐水得到菌悬液。
5.一种权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌菌株的菌体干粉，其特征在于其制备方法如下：将权利要求4所述的菌悬液离心，沉淀干燥获得菌体干粉。
6.一种权利要求1所述菌株用于降解腌制猪肉中亚硝酸钠的应用。
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