CN108387739A - 一种特异性检测血清中真菌的试剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

发明人提供了一种特异性检测血清中真菌的试剂，所述试剂的组分包括多粘菌素和鲎试剂。上述技术方案通过在鲎试剂内添加多粘菌素，多粘菌素含有带阳电荷的游离氨基，能与革兰氏阴性菌酯多糖(LPS)也就是细菌内毒素(endotoxin)的磷脂中带阴电荷的磷酸根结合，而使细菌内毒素失活，失活的脂多糖无法与鲎试剂中C因子起反应，从而阻断了C反应，避免了真菌检测中的假阳性结果。多粘菌素对鲎试剂中其他成分及检测血清中其他组分不会发生交叉反应。

Description

一种特异性检测血清中真菌的试剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及生化领域，特别是一种特异性检测血清中真菌的试剂及其制备方法。
背景技术
鲎试剂主要成分包括C因子(Factor C，FC)、B因子(Factor B，FB)、G因子、凝固酶原(Proclotting enzyme)、凝固蛋白原(或显色基质)以及二价阳离子、缓冲盐等。其酶的级联反应基本原理已被广泛研究，包括两条凝集反应途径：一条是由1,3-β-D-葡聚糖介导的G因子(FG)途径，活化的G因子将凝固酶原(Proclotting enzyme)转化为凝固酶(clottingenzyme)，凝固酶再水解显色基质(Boc-Leu-Gly-Arg-pNA),使其游离出对硝基苯胺(pNA)，此时再经过偶氮化反应生成玫瑰红色偶氮物质，在545nm处有吸收峰。另一条是内毒素介导的C因子途径：C因子(FC)结合内毒素而被激活，然后激活B因子，活化的B因子将凝固酶原(Proclotting enzyme)转化为凝固酶(clotting enzyme)，产生假阳性反应。鲎试剂C、G反应体系图程见附图1。
由于真菌细胞壁的主要成份是(1-3)-β-D-葡聚糖，所以当(1-3)-β-D-葡聚糖与鲎试剂中G因子反应时，就会激活G因子，但是鲎试剂中也同时存在能与血清中细菌内毒素反应的C因子。因此，目前技术中，在用鲎试剂进行血清真菌检测时，必须对鲎试剂进行层析纯化，除去C因子或/和B因子，但该过程较为复杂，收率较低，G因子和其他组分也会造成一定的损失。
发明内容
为此，需要提供一种可以特异性检测血清中真菌的试剂，该试剂屏蔽鲎试剂与血清中内毒素结合的C反应，使之可以特异性的进行真菌检测，避免内毒素产生的假阳性。同时，制备过程简单适合生物医药工业大范围推广，推动鲎试剂检测产业的发展。
为实现上述目的，发明人提供了一种特异性检测血清中真菌的试剂，所述试剂的组分包括多粘菌素和鲎试剂。
细菌内毒素结构为脂多糖，它主要的活性中心是其中的类脂A、类脂A主要由β(1-6)氨基葡双糖组成。其中1，4’位与磷酸相结合，7个分子的脂肪酸是由糖的羟基与氨基结合而成，主要为带阴离子电荷基团。我们发现多粘菌素含有带阳电荷的游离氨基，能与革兰氏阴性菌酯多糖(LPS)也就是细菌内毒素(endotoxin)的磷脂中带阴电荷的磷酸根结合，而使细菌内毒素失活。失活的脂多糖就无法与鲎试剂中C因子起反应。
进一步地，所述多粘菌素的的添加量为4.0mg/ml鲎试剂。
发明人将多粘菌素E溶解于鲎试剂后，1:1做中和细菌内毒素实验，试验结果如下表所示：
根据临床上人的血清中细菌内毒素限值为0.03Eu/ml；患者血清中内毒素值A在0.03Eu/ml＜A＜0.2Eu/ml之间，用内毒素含量0.2Eu/ml的血清作为检测血清，向检测血清中添加不同浓度的多粘菌素。
根据上表显示，当多粘菌素浓度为4.0mg/ml时，基本能中和血清中的细菌内毒素0.015Eu/ml,使旁路反应，即使血液中存在细菌内毒素也不会影响鲎试剂中。
进一步地，所述多粘菌素为多粘菌素E。
发明人还提供了一种特异性检测血清中真菌的试剂制备方法，包括以下步骤：
将多粘菌素、表面活性剂加入鲎试剂混合均匀，调节试剂pH值为5.5-6.5；所述多粘菌素的添加量为4.0mg/ml鲎试剂，所述表面活性剂的添加量为0.1％。
进一步地，所述鲎试剂的制备过程包括以下步骤：
细胞剪切：将鲎血细胞剪切后加入7-9倍的质量细胞崩解液，使细胞充分吸水膨胀后-10℃以下进行保存；
细胞冻融：将细胞用冰水浴解冻后-10℃以下进行冻结，重复以上步骤5-8次；
细胞液提取：将反复冻融后解冻的细胞离心提取上层细胞液；
氯仿精制：将细胞液加入1.5-3倍质量的氯仿后，-10℃以下冻结混合物；将混合物置于冰水浴中解冻，解冻后离心提取的上清液即为鲎试剂。
进一步地，所述多粘菌素为多粘菌素E，所述表面活性剂为Triton400。
进一步地，所述制备过程在4℃以下进行。
区别于现有技术，上述技术方案通过在鲎试剂内添加多粘菌素，多粘菌素含有带阳电荷的游离氨基，能与革兰氏阴性菌酯多糖(LPS)也就是细菌内毒素(endotoxin)的磷脂中带阴电荷的磷酸根结合，而使细菌内毒素失活，失活的脂多糖无法与鲎试剂中C因子起反应，从而阻断了C反应，避免了真菌检测中的假阳性结果。多粘菌素对鲎试剂中其他成分及检测血清中其他组分不会发生交叉反应。
附图说明
图1为背景技术所述鲎试剂C、G反应体系图；
图2为多粘菌素E结构图；
图3为具体实施方式中，真菌(1-3)-β-D-葡聚糖检测试剂盒(终点显色基质法)的标准曲线图。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。
本实施方式所述的多黏菌素(Polymyxin)是发现于多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)培养液中的抗菌性多肽，有A、B、C、D、E五种，多黏菌抗菌谱相互类似而范围宽广，特别对革兰氏阴性细菌作用颇强，毒性较弱。
多黏菌素E(图2为多粘菌素E结构图)配合鲎试剂的血清试验：
1.检测材料和方法
1.1试剂
真菌(1-3)-β-D-葡聚糖标准品(批号：20160601)、细菌内毒素国家标准品(批号：200707)、碱试剂、0.2mol/L PH6.0缓冲液、细菌内毒素检查用水(生产厂家：福州新北生化工业有限公司，批号：17050302细菌内毒素<0.005EU/ml)
1.2仪器设备
酶标仪(545nm波长) 1台
恒温振荡仪 1台
移液器(1000ul) 1把
移液器(200ul) 1把
旋涡混合器 1台
剪刀 1把
试管架 2个
1.3器具
所有与试剂直接接触的器具应无菌无热原无葡聚糖。
无热源枪头(1000ul) 50支
无热源枪头(200ul) (96支/盒×2)
酶标板(96孔) (96孔/块×1)
无热源空安瓿(2ml/支) 10支/盒×20盒
无菌无热源无任何添加剂的采血管 100支/盒×1盒
1.4血清材料
1.4.1样本采集要求
1.4.1.1采集过程要求无菌操作，用不加任何抗凝剂真空采血管。
1.4.1.2健康人空腹采血。
1.4.2样本的送检和保存要求
1.4.2.1样本采集后应半小时内，于无添加抗凝剂的无热原无葡聚糖真空采血管中，3000转/分钟离心5分钟离心，取上层血清。
1.4.2.2四小时内检测完。若当日不能及时检测样本应将离心后血浆转移至无热原采血管内2-8℃保存72小时内使用。-20℃以下冷冻保存，6个月内使用。
2.实验方法
2.1血清的外加标准品处理
2.1.1标准品稀释
真菌(1-3)-β-D-葡聚糖稀释：6400pg/mL→3200.0pg/mL
内毒素稀释：100.000EU/mL→40.000EU/mL→20.000EU/mL
2.1.2血清添加标准品
2.1.2.1真菌(1-3)-β-D-葡聚糖：90μl血清+10μl 3200.0pg/mL真菌(1-3)-β-D-葡聚糖溶液→100μl含320.0pg/mL真菌(1-3)-β-D-葡聚糖的血清(血清①)
2.1.2.2血清添加内毒素：90μL血清+10μL 20EU/mL内毒素溶液→100μL含2EU/mL内毒素的血清(血清②)
2.1.2.3血清添加真菌(1-3)-β-D-葡聚糖与血清添加内毒素：180μl血清+10μl6400.0pg/mL真菌(1-3)-β-D-葡聚糖溶液+10μL 40EU/mL内毒素溶液→含320.0pg/mL真菌(1-3)-β-D-葡聚糖与2EU/ml的血清(血清③)
2.2血清的处理：
2.2.1未添加多粘菌素鲎试剂的血清检测操作：取血清①、血清②、血清③各100μl+400μl碱试剂→37℃水浴10min→500μl缓冲液，为血清处理液→取50μl+50μl未添加多粘菌素鲎试剂→37℃水浴30min→偶氮化反应后，置酶标仪测定。(各测两支平行)
2.2.2鲎试剂检测操作：取血清①、血清②、血清③各100μl+400μl碱试剂→37℃水浴10min→500μl缓冲液→添加4mg多粘菌素，为血清处理液→取50μl血清+50μl添加多粘菌素鲎试剂→37℃水浴30min→偶氮化反应后，置酶标仪测定。(各测两支平行)
3.结果
表1
真菌(1-3)-β-D-葡聚糖检测试剂盒(终点显色基质法)的OD结果表
浓度 0 10 20 40 80 160
OD1 0.067 0.105 0.128 0.19 0.282 0.545
OD2 0.068 0.102 0.128 0.188 0.284 0.546
平均OD值 0.0675 0.1035 0.128 0.189 0.283 0.5455
图3为具体实施方式中，真菌(1-3)-β-D-葡聚糖检测试剂盒(终点显色基质法)的标准曲线图。
表2多粘菌素对真菌(1-3)-β-D-葡聚糖的检测结果表
从表2可看出，含320.0pg/mL真菌(1-3)-β-D-葡聚糖的血清(血清①)以两种鲎试剂(添加0.4mg/ml多粘菌素与未添加多粘菌素)进行检测，检测结果无显著差异，说明添加0.4mg/ml多粘菌素对真菌(1-3)-β-D-葡聚糖的检测不存在影响，没有干扰。
含2EU/mL内毒素的血清(血清②)以两种鲎试剂(添加0.4mg/ml多粘菌素与未添加多粘菌素)进行检测，未添加多粘菌素鲎试剂检测值为657.6pg/ml，而添加0.4mg/ml多粘菌素鲎试剂的检测结果是145.0pg/ml，检测结果有显著差异，很明显添加0.4mg/ml多粘菌素鲎试剂对完全屏蔽住2EU/ml内毒素。
含320.0pg/mL真菌(1-3)-β-D-葡聚糖与2EU/ml的血清(血清③)以两种鲎试剂(添加0.4mg/ml多粘菌素与未添加多粘菌素)进行检测，未添加多粘菌素鲎试剂检测值为1019.7pg/ml，而添加0.4mg/ml多粘菌素鲎试剂的检测结果是330.0pg/ml，检测结果有显著差异，由此得出多粘菌素鲎试剂完全屏蔽住0.2EU/ml内毒素，而对真菌(1-3)-β-D-葡聚糖的检测不存在影响，没有干扰。准确地检测出真菌(1-3)-β-D-葡聚糖的值。
实施例1：
1、鲎试剂制备:
1.1细胞剪切:
准备工作：在百级操作台上将经除去细菌内毒素的细胞剪切所需的工具准备好。将准备用来装载细胞的玻璃瓶，置于4℃以下冰柜中预冻。将要使用的崩解液置于0～4℃冰箱预冻30分钟。取合格细胞原料每支约40-50g左右。挑选2个烧杯，烧杯四周覆上冰。
剪切细胞：取若干支细胞，用药勺将容器中细胞小心挖出，用镊子夹取细胞，用剪刀剪切细胞至烧杯中，要求25g细胞剪切为10小块以上细胞碎粒。将烧杯中剪切好的细胞夹到预冻好的玻璃瓶中，将预冻好的崩解液，按1：8的比例分别加入放细胞的玻璃瓶中，将每个玻璃瓶剧烈振摇，使其中的细胞块散开，然后置于0～4℃冰箱中4～8hr，使细胞充分吸水膨胀之后改置于－10℃以下冰柜中保存，转入细胞冻融工序。
1.2细胞冻融
取出的装有细胞的玻璃瓶，放入冰水浴。冰水液面与瓶中液面高度相等。待瓶中解冻一半就可以开始“振摇”玻璃瓶，每瓶每次振摇5分钟。之后改置于-10℃以下冰柜中保存。照此同样操作反复冻融6次。
1.3、细胞液提取：
将装有细胞的玻璃瓶从-10℃以下取出，置冰水浴中解冻后，转入离心管中离心(离心速度为8000rpm/min，温度4℃，离心分离时间为30分钟)后立即将上层细胞液移入-10℃以下冰柜存放。
1.4氯仿精制:
从冰柜中取出细胞液，加入在4℃以下冰柜预冻的氯仿(CHCl3)进行萃取，细胞液：氯仿的质量比为1：2，-10℃冻结萃取混合物；将已冻结含有氯仿的细胞液置冰水浴中解冻后，进行离心分离，(离心速度为8000rpm/min，温度4℃，离心分离时间为60分钟)，离心上清液即为鲎试剂。
1.5检测试剂的制备：
将鲎试剂的多黏菌素E、表面活性剂Triton400加入鲎试剂混合均匀，多黏菌素E的添加量按4.0mg/ml鲎试剂的比例添加，表面活性剂Triton400的添加量按0.1％的比例添加。调节试剂pH值为5.5-6.5得到特异性检测血清中真菌的试剂成品。
以上制备过程在4℃以下进行。
实施例2-5
实施例2-5与实施例1的区别在于：检测试剂的制备步骤中，加入的多黏菌素分别为多黏菌素A、B、C、D。
检测试剂的使用方法为：
1、血清前处理：取用市售碱试剂稀释后的血清，37℃水浴10min后，加入Tris-HCl缓冲液(0.2N，pH6.0)混合均匀后，低温3000转/分钟离心5分钟。
2、加检测试剂：取处理好的血清50μL加入无热原空安瓿中，再加入检测试剂50μL，混匀后，37℃恒温反应30分钟。
3、偶氮化反应：将反应后的溶液取出进行偶氮化反应，反应后混合液置于置酶标板，545nm处测定吸光度。
5、计算：根据厂家提供的(1-3)-β-D-葡聚糖标准曲线，计算出(1-3)-β-D-葡聚糖含量。
6、真菌判断：
﹤20pg/mL血清中真菌(1-3)-β-D-葡聚糖值正常，未感染真菌。
≥20pg/mL怀疑真菌感染，建议临床结合症状进行判断及治疗。
用标准人血清(未存在真菌感染、革兰氏阴性菌感染的)加入内毒素，内毒素含量为0.2Eu/ml作为检测血清，并按上述使用步骤进行加入实施例1-5制备的特异性检测血清中真菌的试剂测定，检测结果为阴性，血清中内毒素Eu/ml＜0.03。
将实施例1-5制备的特异性检测血清中真菌的试剂，用真菌感染的患者血清进行测定，检测结果有特异性表达，而对加入2EU/mL内毒素的正常血清进行检测，则没有特异性表达,证明加入多黏菌素的鲎试剂可特异性的检测血清中的真菌
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims (8)

1.一种特异性检测血清中真菌的试剂，其特征在于，所述试剂的组分包括多粘菌素和鲎试剂。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述多粘菌素的添加量为4.0mg/ml鲎试剂。
3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述多粘菌素为多粘菌素E。
4.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂的组分还包括表面活性剂，所述表面活性剂为Triton400。
5.一种特异性检测血清中真菌的试剂制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将多粘菌素、表面活性剂加入鲎试剂混合均匀，调节试剂pH值为5.5-6.5；所述多粘菌素的添加量为4.0mg/ml鲎试剂，所述表面活性剂的添加量为0.1％。
6.根据权利要求5所述的试剂制备方法，其特征在于，所述鲎试剂的制备过程包括以下步骤：
细胞剪切：将鲎血细胞剪切后加入7-9倍的质量细胞崩解液，使细胞充分吸水膨胀后-10℃以下进行保存；
细胞冻融：将细胞用冰水浴解冻后-10℃以下进行冻结，重复以上步骤5-8次；
细胞液提取：将反复冻融后解冻的细胞离心提取上层细胞液；细胞液-10℃以下进行冻结；
氯仿精制：将细胞液加入1.5-3倍质量的氯仿后，-10℃以下冻结混合物；将混合物置于冰水浴中解冻，解冻后离心提取的上清液即为鲎试剂。
7.根据权利要求5所述的试剂制备方法，其特征在于，所述多粘菌素为多粘菌素E，所述表面活性剂为Triton400。
8.根据权利要求5所述的试剂制备方法，其特征在于，所述制备过程在4℃以下进行。
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